2. Tècniques d'estudi de les cèl·lules (I) (2016)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 1º curso
Asignatura biologia cel·lular
Año del apunte 2016
Páginas 9
Fecha de subida 22/03/2016
Descargas 15
Subido por

Vista previa del texto

MRDD MÈTODES D’ESTUDI DE LES CÈL·LULES (I) Microscopia òptica i electrònica Introducció històrica a l’estudi de les cèl·lules - - - - Robert Hooke (1655): Microscopi compost (tenia una lent objectiva i una lent ocular i, el que feia era concentrar la llum d’una espelma per així poder observar les mostres). És el que va designar el nom de “cèl·lula” al observar una mostra de cèl·lules de suro. [Va observar en un microscopi molt rudimentari, un fragment de suro, en el qual va descobrir que estava compost per una sèrie d’estructures semblants a les cel·les dels panells d’abelles, pel qual les va anomenar cèl·lules].
Anton Van Leeuwenhoek (1674): Microscopi simple (lupa) (només contenia una lent). Pare de la microbiologia, ja que en el seu recull de dades, conta per primera vegada l’observació d’una diversitat de bacteris. [Va arribar a construir uns 2000 microscòpics d’uns 10 cm aproximadament, ja que deixava al mostra fixa al microscopi després d’observar-la].
Mathias Schleiden & Theodor Schwann (1839): Teoria cel·lular  Tots els organismes estan compostos per cèl·lules.
 La cèl·lula és la unitat estructural de la vida.
Rudolf Virchow (1855): Va completar la teoria cel·lular.
 Les cèl·lules només poden originar-se per divisió d’una cèl·lula preexistent.
-3 -7 1µm = 0.001mm = 10 mm 1Å = 10nm = 10 mm (Microscopia òptica) (Microscopia electrònica) -6 1 nm = 10 mm (Microscopia electrònica) Gairebé sempre les cèl·lules tenen una funció específica respecte la funció que han de dur a terme.
Per exemple: [La especificitat morfològica de les cèl·lules està molt vinculada amb la optimització de la funció] - L’òvul és la cèl·lula més gran ja que ha de contenir els nutrients necessaris per a les primeres fases de desenvolupament fins que no s’uneix al corrent sanguini.
- L’espermatozoide té un flagel molt desenvolupat perquè la funció principal que té és poder-se desplaçar i arribar a fecundar l’òvul.
- L’eritròcit no conté nucli per a optimitzar l’espai i poder contenir més hemoglobina.
- Un adipòcit conté una gran vacuola central per a poder emmagatzemar més quantitat de lípids.
- MRDD Conceptes bàsics de microscopia  Límit de resolució: Distància mínima que hi ha d’haver entre dos objectes per a que es puguin identificar com a objectes diferents. En l’ull humà és de 0,1 mm a 25 cm de distància, és a dir, no som capaços de distingir dos punts com a independents que es trobin a una distància inferior a 0,1 mm entre ells. En la llum blanca el LR és de 0,2 µm i en la llum ultraviolada (λ<500 nm) és de 0,1 µm.
El límit de resolució del microscopi òptic ve determinat per una fórmula: LR = 0,61 λ /AN on - 0,61: Constant de superposició dels ulls humans respecte la seva conformació anatòmica.
- λ: Longitud d’ona de la llum amb la que es treballa. (Normalment la llum blanca és > 500nm, però també s’usa la llum ultraviolada) - AN: L’apertura numèrica és un valor donat pel fabricant anotat en cadascun dels microscopis. El que fa és reflectir el producte entre N (índex de refracció, és a dir, la velocitat en que la llum es mou per un medi en relació amb la velocitat al buit) i sin α, que és la meitat de l’angle de llum que entra dins d’un objecte.
Com és baix sigui aquest límit de resolució d’un microscopi, millor serà aquest. [mínima distància] Si ens fixem en la fórmula, per a que el valor de LR sigui baix, el valor que és modificable és la λ, per tan el que volem és que aquesta sigui baixa. El valor d’aquesta landa és el que diferenciarà el LR entre llum blanca i llum ultraviolada.
Per altra banda, volem que el denominador sigui petit i, això és el que diferenciarà els microscopis òptics dels microscopis electrònics.
Normalment el valor de AN és menor en els objectius de petits augments.
Tot i que quan es canvia de medi, com pot ser l’oli en l’objectiu d’immersió, el que es fa es interposar una substància entre l’objectiu i la preparació el qual té una n de 1,515. Al posar l’objectiu de 100x, es forma un angle de gairebé 180º i per tant, en la fórmula seria sin 90. Si s’utilitza l’oli, aquest al tenir un índex de refracció casi igual al vidre, permet aconseguir aquest denominador més gran que 1. Això fa que els rajos de llum passin pels dos medis (vidre i oli) amb el mateix índex de refracció i que no es perdin tants rajos de llums.
 Poder de resolució: Inversa del límit de resolució. PR = 1/LR [Com és alt millor] Normalment, no s’utilitza com a valor quantitatiu sinó com a valor qualitatiu.
 Nomenclatura dels objectius: 40 0,65 160/0,17 On: - 40: Número d’augments.
- 0,65: Apertura numèrica. (Ha de ser inferior a 1 en objectius inferiors a 100x).
- 160: Longitud del tub ocular.
- 0,17: Gruix del cobreobjectes.
MRDD La mostra a observar es troba fora de la distància focal de la lent, per tant per a obtenir la imatge en els MO es que es fa és generar una primera imatge invertida i augmentada de l’objecte. Aquesta primera imatge sí que es troba dins de la distància focal i per tant el que fa la lent ocular és simplement augmentar la imatge de la mostra. Per tant en els MO es veu la imatge invertida de l’objecte.
Per aquest raó, el MO no es pot utilitzar mai en un quiròfan, sinó que s’usa un microscopi estereoscòpic (lupa), que el que fa és únicament augmentar la imatge ja que la llum no insereix dins la mostra sinó que rebota sobre ella i això fa que es generi una La conformació dels MO habituals tenen la imatge. Tot i això la resolució del MO serà major que característica que l’espai que hi ha entre la preparació i l’ocular és mínima. Això fa que el gruix en la lupa.
de la preparació sigui un gran limitant. Tot i això, existeix un MO invertit, el qual permet que puguem observar mostres en plaques de petri i a la vegada poder-les manipular ja que els objectius es troben sota la platina del microscopi. Aquest tipus de conformació és el que ha permès addicionar el microscopi manipuladors per a la manipulació de les mostres.
Limitacions de les mostres biològiques per a la seva observació amb el microscopi òptic 1.
2.
Gruix: Es requereix la realització de talls. Tot i això hi ha excepcions com ara les cèl·lules sanguínies (ja que formen part d’un teixit líquid i a partir d’aquest es pot fer una extensió), les extensions bacterianes (tosca dental), els frotis dels testicles o dels ovaris o l’estudi del esperma (espermiograma) i alguns cultius cel·lulars. Normalment una mostra per a que pugui ser travessada per la llum ha de tenir un gruix de entre 10-15 µm de gruix.
Contrast: Es requereix color o contrast per a poder observar la majoria de les cèl·lules i diferenciar les diferents estructures cel·lulars. Això s’aconsegueix o bé, observant les mostres en MO especials que juguen amb les característiques de la llum i generen un contrast especial o bé amb realitzant tincions a les mostres. Aquestes es poden realitzar amb:  Colorants vitals (preparacions temporals): per a l’observació de cèl·lules vives. Es treballa amb parts per milió de colorant i per tant no és tòxic per a la cèl·lula, només els hi genera unes petites coloracions. Per exemple ho són el blau de metilè, el vermell neutre o el verd Janus.
 Altres colorants en que la seva concentració és estàndard (preparacions permanents) o combinacions de colorants que el que fan és matar a la seva cèl·lula a causa de la seva toxicitat. Aquests colorants tenen la finalitat de permetre diferenciar les diferents estructures cel·lulars però, a la vegada, permetre saber quina és la naturalesa química d’aquestes estructures. Un exemple d’aquests colorants és la prova d’histocompatibilitat que es fa mitjançant l’anàlisi amb Hematoxilina (lila)– Eosina (rosa), el que la combinació dels colorants permet predir el pH de les estructures cel·lulars. Es podrà observar que el nucli quedarà lila a causa de l’ADN (àcid) i el citoplasma rosa a causa de les proteïnes (bàsiques).
MRDD Tipus de mostres i tècniques de preparació per l’estudi al microscopi òptic  Vives: Són preparacions temporals.
- Muntatge simple: porta i cubre - Utilització de MO especials - Contrast amb colorants vitals - Ex: control de cultius cel·lulars, estudi d’esperma, etc.
 Mortes: Són preparacions permanents.
- Cèl·lules aïllades: Fixació, tinció i muntatge - Òrgans (biòpsies): Fixació, (deshidratació), inclusió, microtomia (=tall), (rehidratació), tinció, (deshidratació) i muntatge.
- [És important matar les cèl·lules en el moment just (metafase) en el cas de l’estudi dels cromosomes (CARIOTIP)].
 Fixació: Procediment químic o físic que pretén matar les cèl·lules però mantenint la mateixa estructura que tenien quan estaven vives.
El fixador universal per a les cèl·lules aïllades acostumen a ser solucions alcohòliques (7080º). Per a fixar les mostres més gruixudes com parts d’òrgans acostuma a ser el formol ja que aquest fa precipitar les proteïnes en el seu lloc d’origen.
 Deshidratació: Per a fixar les mostres normalment s’usa parafina, la qual és hidròfoba. Per això en molts casos primer s’ha de deshidratar la mostra amb sèries creixents d’alcohol (A-30 – A-50 – A-70 - A95) durant uns 10’ en cadascuna de les diferents solucions.
 Inclusió: És el procés d’enduriment de la mostra. Normalment es fa amb resines o substàncies plàstiques. La substància més emprada és la parafina. És en el moment en que la mostra conté un 95% d’alcohol en que es col·loca la preparació a l’estufa dins d’uns motlles específics i s’hi adjunta la parafina en estat líquid. A la vegada que entra la parafina en les cèl·lules, l’alcohol al ser una substància molt volàtil, s’evapora. Es treu la mostra de l’estufa per a que la parafina es solidifiqui.
 Microtomia: És el procés d’obtenció de talls molt fins de la mostra gràcies a una ganiveta metàl·lica. Aquests talls s’hauran de planxar perquè sovint la compressió els deix arrugats i normalment quedaran flotant en una substància en la que s’hauran d’agafar amb el portaobjectes prèviament tractat amb una substància per a que s’hi adhereixin.
 Rehidratació: Per a poder observar les mostres, es necessita l’ús de colorants els quals són solucions aquoses. Per això la mostra s’haurà de posar en contacte amb un dissolvent de la parafina que la degradarà. Tot seguit s’ha de rehidratar la mostra per a eliminar les restes de parafina i ser així compatibles amb els colorants. Per fer-ho es fa un bany seriat de solucions alcohòliques en direcció inversa al pas anterior (A-95 – A-70 – A-50 – A-30 – H2O destil·lada).
 Tinció: Molts cops els colorants ja tenen incorporats la substància fixadora. A vegades la estructura de les cèl·lules fa que les tincions no siguin homogènies. Per exemple, en els eritròcits, la part central està menys tenyida perquè al haver-hi menys citoplasma, també hi ha menys capacitat i estructures per a tenyir. Això és degut a la forma bicòncava que tenen.
Existeix una gran bateria de tincions diferents per als diferents tipus cel·lulars i de microorganismes que existeixen. Un altre exemple de tinció podria ser la tinció Gram, la qual a més a més de diferenciar la forma dels bacteris entre si respecte el color, també informa de la constitució de la seva paret bacteriana.
 Deshidratació: Si les mostres han de ser permanents, volem que el medi de muntatge tingui el mateix índex de refracció que el cobreobjectes i que l’oli d’immersió. Per això caldrà deshidratar la mostra altra vegada amb el mateix procediment anterior.
MRDD  Muntatge: Posteriorment es col·locarà la gota del medi de muntatge que enganxarà el cobreobjectes amb la mostra durant molt de temps.
Tipus de microscopis Microscopi de contrast de fases Microscopi de contrast de fases interdiferencial (Òptica Nomarski) Microscopi òptic TEM Microscopi de llum UV SEM COMPARACIÓ D’INSTRUMENTS MICROSCOPI ÒPTIC MICOSCOPI ELECTRÒNIC Llum λ= 500 nm Lents de vidre Aire (i oli d’immersió) e λ=0,005 nm Lents electromagnètiques Buit Mostres Vives i mortes Mortes Augment x 40  x 1 000 x 2000  x 100 000 Límit de resolució 0,2 µm – 0,1 µ 0,5 nm – 10 nm - Microscopia electrònica: un feix d’electrons es pot focalitzat igual que es fa amb un feix de llum.
El primer microscopi electrònic va ser un TEM i es va fabricar per Ernst Ruska entre 1931 i 1933.
La λ dels electrons és 100 000 vegades més petita, pel que en els microscopis electrònics tindran un LR molt més alt.
MRDD  MET. Transmission Electron Microscope (TEM): Manté la mateixa disposició de lents que el MO, pel que ens donarà la mateixa informació morfològica però amb major resolució.
El feix d’electrons es forma quan un material conductor, el tungstè, en forma de V, es calenta fins a 3000º i per efecte termoiònic emet uns electrons. Aquests es fan passar per una perforació que està carregada negativament, fent així que el feix d’electrons s’uneixi molt entre si a causa de la repulsió.
Es va veure que si s’utilitzaven lents amb camps magnètics, aquests ajudaven a focalitzar els electrons d’una forma similar a les lents de vidre al MO.
La imatge es forma quan el feix d’electrons travessa la mostra.
Com que els electrons no poden travessar el vidre, s’usa una reixeta metàl·lica de coure (pot ser de platí, d’or i de carbó) (d’ 1cm) a partir de la qual passa el feix d’e . Les lents projectores serien l’equivalent a la lent ocular del MO. La imatge es projecta en una imatge fluorescent i, actualment, aquesta imatge es digitalitza i apareix en una TV.
Per a fer aquest procés, es necessita un espai evacuat al buit ja que els electrons es frenen amb les partícules d’aire. La mostra no pot tenir un Comparació entre el ME de transmissió i el ME de gruix de més de 70nm. S’ha d’utilitzar un rastreig o scanning.
ultramicròtom, el qual conté binoculars.
La resolució d’aquest microscopi és de 0,2 – MICROSCOPI MICROSCOPI ELECTRÒNIC ELECTRONIC DE DE SCANNING 0,3 nm.
TRANSMISSIÓ Tipus Feix d’electrons Feix d’electrons escombra MET MES d’electrons estable la superfície de la mostra Interacció amb la mostra Tipus d’imatge X LR KV Feix d’electrons (e primaris) travessa la mostra - Imatge per transmissió (comparable al MO) x 1000 – x 1000 000 0,5 – 1 nm 40 – 100 KV - Els e primaris no travessen la mostra, interactuen amb la superfície i se’n desprenen els e secundaris Imatge topogràfica (comparable a la lupa binocular) x 10 – x 100 000 5 – 10 nm 1 – 40 KV (15 és el normal) Com més alt és el kilovoltatge d’un microscopi, més baix és el límit de resolució i a la vegada permet jugar amb diferents gruixos de mostres. Hi ha un MES anomenat “feel emition” que té casi una resolució igual al MET.
MRDD Les mostres a observar estan formades per C, O, H i N majoritàriament. Aquest elements tenen pocs electrons, el que fa que el feix d’electrons no es desvii. Per a afavorir la conductivitat en la mostra, i que el feix d’electrons es desviï molt per a que es pugui captar tota la superfície de la mostra, el que es fa introduir a la mostra solucions que continguin metalls pesats i que interaccionin amb els components cel·lulars per a crear contrast. Per exemple el citrat de plom (CiPb) o el uranil acetat (UrAc) són les substàncies emprades per a contrastar les mostres en els ME per a que no quedin les imatges totes blanques (a causa de la no desviació dels electrons). Com més consistent i compacte és la mostra, més s’uneixen els metalls pesants. Com més negre surt en la imatge, més s’ha desviat el feix d’electrons.
 MEB/MER. Scanning electron microscope (SEM) [Es va desenvolupar 30 anys més tard que el MET] - Imatges en 3 dimensions - Mostres de gran volum - Profunditat de camp de varis mm [La profunditat de camp és la capacitat de veure enfocats simultàniament diferents plans de la preparació].
- Resolució: 3,5 nm El feix d’electrons rastrejarà la superfície de la mostra i fer que aquesta emeti electrons. Aquests electrons emesos els captarà un detector carregat positivament i els convertirà en una imatge fotònica la qual ens permetrà veure-ho en una pantalla de TV.
La composició consta d’un filament de tungstè que allibera els electrons al calentar-se, una lent condensadora que focalitza els electrons, un deflector d’electrons, on el feix d’e ja no és estable sinó que es desplaçarà al llarg de la superfície de la mostra per a que aquesta emeti els electrons secundaris i aquests siguin captats pel detector i emeti la imatge.
El MES també treballa en condicions de buit tot i que existeix un microscopi electrònic ambiental, el qual treballa a unes condicions més normals permetent que es puguin observar insectes vius i que aquests després continuïn vius. Aquest microsopi amb pressió de buit més baixa té menys resolució.
En els MES, la limitació del gruix ja no existeix però sí que s’ha de corregir el contrast de la imatge. Per ferho el que es fa és recobrir la superfície de la mostra amb una substància que sigui capaç d’emetre molts electrons i així excedir la quantitat d’electrons secundaris emesos per la mostra. Aquesta substància acostuma a ser l’or. Per tant la imatge resultat és la suma dels electrons emesos per l’or i per la mostra.
MRDD COMPARACIÓ ENTRE LES TÈCNIQUES DE PREPARACIÓ DE LES MOSTRES PER MET I MEB MICROSCOPI ELECTRÒNIC DE TRANSMISSIÓ Fixació Deshidratació Inclusió Talls Contrastat MICROSCOPI ELECTRÒNIC DE SCANNING Fixació Assecat - Punt crític - Criodessecació Conductivitat – Metalització (Au, C) Per a poder utilitzar aquest tipus de microscopis, s’ha de fixar la mostra. En aquest cas, els fixadors que s’utilitzen més són el glutaraldehid o el paraformaldehid. Aquests aldehid estableixen enllaços amb els grups amino de les proteïnes. A vegades també es poden emprar permanganats. Al contrari que el formol en el MO, aquests fixadors no fan precipitar a les proteïnes, sinó que interactuen amb elles formant enllaços.
A més a més però, també es volen preservar les membranes cel·lulars en aquest tipus de microscopia, pel que els lípids també es conserven mitjançant OsO4 (tertraòxid d’osmi), que el que fa és intercanviar els enllaços entre l’osmi i l’oxigen i passa a interaccionar amb les estructures lipídiques. Aquest Os té un nombre atòmic molt elevat, el que farà que els electrons es desviïn bastant. Tot i això, aquest compost té una penetració limitada en els teixits, el que vol dir que per a que el teixit quedi amb suficient quantitat d’Os, s’ha de tallar en porcions petites.
Definim les substàncies depenent de la seva absorció d’aquestes substàncies que creen contrast com a substàncies electrotransparents (gairebé blanca) o electrodensa (gairebé negre).
Aquest tipus de fixació es realitza tan en el MET com en el MES.
Al estar els dos microscopis electrònics en unes condicions de pressió al buit, fa que les mostres hagin d’estar completament deshidratades. En comptes de fer servir solucions aquoses al introduir les substàncies amb metalls pesants, en aquest tipus de mostres s’utilitzen solucions tampons per a aconseguir que la mosta i el medi tinguin la mateixa molaritat. La deshidratació, tanmateix, es faria igualment amb sèries creixents d’alcohol però amb passos molt més acurats per a assegurar cada fase.
En el MET es segueixen els mateixos processos que en el MO. Per a dur a terme l’enduriment de la mostra, no s’empra parafina sinó que s’utilitzen resines epoxi (resines plàstiques), les quals són una combinació de substàncies que entre elles endureixen, plastifiquen o catalitzen la mostra. Aquestes substàncies polimeritzen a 55º i són capaces d’entrar a la mostra. Per fer aquest pas d’introducció també es fan sèries creixents d’aquestes substàncies barrejades amb alcohol per a facilitar i assegurar el procés. Fet això la mostra s’ha de tallar mitjançant un micròtom el qual està format per ganivetes de vidre o de diamant per a fer talls de 70 nm de gruix. Tot seguit es col·loca la mostra damunt de la reixeta i es posa sobre d’ella una gota de CiPb o alguna altra substància contrastant.
Per al MES, la mostra normalment no cal que es prepari a no ser que tingui un alt contingut d’aigua. En el cas que s’hagués de fer, s’hauria de fer de tal manera que aquesta no perdés la seva conformació a l’espai al dessecar-la a causa de la pressió atmosfèrica.
MRDD Per fer aquest procés normalment es duen a terme dos processos: - Punt crític (més utilitzada): Es basa en la combinació dels tres estats de la matèria. Per tant es busca una substància que tingui un punt crític que sigui capaç de passar de líquid a gasos i que a a vegada siguin en condicions compatibles amb les nostres cèl·lules. Normalment s’empra el CO 2, ja que aquest si es sotmet a 50 bar i 100º és líquid. El que es fa és substituir l’alcohol de les cèl·lules per CO2. Quan se sap que tot l’alcohol de les cèl·lules ja ha estat substituït, el que es fa és augmentar la temperatura (i per tant la pressió) fins a arribar al punt crític del CO 2 (31,5 º i 50 bar). Això fa que la mostra es quedi seca ja que no hi haurà cap dissolvent dins seu.
- Criodessecació: El que es fa és sotmetre la mostra a baixes temperatures. Abans però es protegeix la mostra amb un anticongelant per a que no es faci malbé. Fet això, es congela la mostra amb una substància ultracongelant (amb una velocitat de congelació molt gran per a que no es facin grans cristalls ja que sinó trencarien la cèl·lula). Normalment s’utilitza freó o nitrogen líquid (-196ºC). Una vegada està congelada, hi ha un aparell (al que col·loquem la mostra) que conté una placa metàl·lica que va augmentant progressivament la seva temperatura; de -196  20º. Això fa que el gel es sublimi al buit i fa que la mostra al cap d’unes 18h estigui seca.
Finalment per a fer més efectiu el contrast de la imatge, en el MES es banya la mostra amb una pel·lícula d’or o C. En el MET per a assegurar aquest contrast s’ha d’introduir alguna de les substàncies esmentades anteriorment.
...