Tema 4. Reestructuració de la informació genètica (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 2º curso
Asignatura Bioquímica II
Año del apunte 2015
Páginas 16
Fecha de subida 04/02/2015
Descargas 18
Subido por

Vista previa del texto

Tema 4. Reestructuració de la informació genètica 1. BASES MOLECULARS DE LA VARIABILITAT GENÈTICA Processos de recombinació La recombinació és el procés pel qual una cadena de material genètic es talla i s’uneix a una molècula de material genètic diferent. En eucariotes la recombinació es produeix habitualment durant la meiosi, el procés de formació de gàmetes, com entrecreuament entre els cromosomes aparellats.
Recombinació homòloga La recombinació homòloga entre dos cromosomes germans en eucariotes és un procés creador de diversitat gènica i el percentatge de recombinació entre dos gens serà proporcional a la distància entre ells.
En bacteris haploides, no obstant, la recombinació és un mecanisme de supervivència per un ambient determinat. Si en un bacteri que es troba en un ambient hostil entra un DNA per procés de transformació amb una seqüència homòloga al genoma del bacteri, aquest realitza el procés de recombinació amb l’esperança que en aquest DNA introduït hi hagi un gen que li permeti la supervivència. La probabilitat de que això succeeixi és d’1 per cada 106, però un sol bacteri que sobrevisqui pot dividir-se i augmentar exponencialment en nombre, de manera que passat un dia s’haurà recuperat la quantitat inicial de bacteris.
Existeixen dos models que pretenen explicar la recombinació homòloga: Holliday i el trencament de doble cadena Holliday es basa en l’homologia de les cadenes, la simetria dels talls i la presència d’una unió de Holliday de quatre cadenes com a intermediari. En funció del punt de tall hi haurà o no recombinació.
29 S’ha comprovat, però, que no es dóna aquest model sinó el model de trencament de la doble cadena, que es basa en l’execució de dos talls i dues unions de Holliday. La zona en què es dóna la recombinació s’anomena Hot Spot i cal tenir en compte que per sobre i per sota hi ha més DNA que no es veu afectat.
El mecanisme descrit pel model de trencament de doble cadena consta dels següents passos: 1) Double strand brake asimètric creant dues cadenes protuberants.
2) Una de les cadenes protuberants envaeix l’altra doble cadena i rastreja la complementària buscant bases homòlogues. Per fer-ho desplaça l’altra cadena del dsDNA.
3) La cadena migra fins trobar una regió homòloga i s’estabilitza mitjançant ponts d’hidrogen 4) La cadena desplaçada ocupa la posició de la cadena rastrejadora 5) Resolució dels entrecreuaments mitjançant el tall de les cadenes 6) Síntesi de novo i participació de la ligasa Recombinació en E. coli La recombinació en bacteris s’explica pel model anterior i les principals proteïnes que intervenen són RedBCD (tall), RecA (rastreig) i RuvABC (resolució). L’expressió d’aquestes proteïnes es donarà únicament quan es requereixi una reparació i quan es requereixi una recombinació després de transformació/conjugació o després d’un dany al DNA que posi en risc la supervivència del bacteri, per exemple després de l’exposició a rajos UV.
El mecanisme de supervivència que indueix l’expressió d’aquestes proteïnes s’anomena sistema SOS, que s’autodirigeix per la proteïna LexA, una proteïna repressora localitzada als gens SOS. La transcripció dels gens SOS, doncs, es produeix quan LexA es separa dels gens.
Això succeeix, per exemple, quan RecA detecta danys al DNA i canvia de conformació unint-se a Lex A catalitzant la seva autoproteòlisi.
El complex RecBCD s’encarrega del tall de doble cadena i presenta activitat helicasa dependent d’ATP (RecB) i activitat nucleasa. Aquest complex s’uneix al DNA, crea dos loops i degrada una de les cadenes desplaçant-se fins localitzar un Hot Spot o lloc Chi (GCTGGTCC) on s’atura per afinitat. A l’arribar a aquest punt RecBCD canvia de cadena i RecA s’incorpora a l’extrem 3’. RecA és també dependent d’ATP i s’uneix a ssDNA envoltant-lo. Migra per la cadena i rastreja fins localitzar una seqüència homòloga. Quan la localitza impulsa l’aparellament de les cadenes homòlogues i s’uneix a les tres cadenes. El complex RuvABC resol les Holliday Junctions. RuvA és una proteïna d’unió a DNA que permet la formació de l’estructura de Holliday de quatre cadenes. RuvB és una proteïna motora dependent d’ATP que s’uneix a dos braços oposats i els fa girar en direccions contràries. Per últim, RuvC té activitat nucleasa i trenca les cadenes perquè intervingui posteriorment la ligasa.
30 Recombinació homòloga en eucariotes La recombinació homòloga en eucariotes segueix el mateix mecanisme que en bacteris amb enzims homòlegs als ja vistos. Rad51 s’assimila en seqüència i funció a RecA i s’encarrega del rastreig, mentre que Mus81 sembla facilitar la migració i la resolució de les Holliday Junctions.
Funcions essencials de la recombinació La recombinació sembla tenir dues funcions principals. En primer lloc intervé en la reparació de trencaments de doble cadena utilitzant informació de cromosomes homòlegs. En aquest cas interessa que no hi hagi recombinació, de manera que el tall es realitza amb aquest objectiu tal i com es mostra en la imatge. L’altra funció és en la replicació per evitar la generació de col·lapses en les forquilles de replicació. En aquest cas la recombinació permet el reompliment del nick.
Transposons: elements genètics mobilitzables per recombinació Els transposons són seqüències de DNA que no tenen identitat en ells mateixos sinó que es troben sempre integrats en un altre element genètic. Tenen la capacitat de desplaçar-se el llarg de diferents posicions del genoma d’una cèl·lula mitjançant el procés de transposició.
Aquest procés poden realitzar-lo abandonant el lloc original o creant una còpia que s’insereix en un altre punt del DNA.
La inserció d’un transposó al genoma o transposició, en comparació amb la recombinació homòloga, es caracteritza per requerir una seqüència concreta de DNA, per ser Rec-A independent, per intervenir el procés la síntesi del DNA i per tenir la capacitat de reestructurar el cromosoma hoste per inserció o recombinació homòloga d’elements duplicats.
31 Els transposons bacterians poden classificar-se en tres classes principals.
 Classe 1 No tenen capacitat de duplicació, només poden moure’s d’un punt del genoma a un altre.
 Insertion sequence, IS Són els més típics i més senzills  Composite transposon Presenten un marcador de selecció que aporta, per exemple, resistència per un medicament. Destaquen Tn5 i Tn10.
 Classe 2 Presenten un gen de resistència i activitat resolvasa que els permet crear una copia que s’insereix en un altre punt del genoma.
 Classe 3 Pertanyen a un petit grup de bacteriòfags el més conegut dels quals és el fag Mu.
La transposició pot donar-se per mitjà de dos mecanismes diferents. Els dos mecanismes es basen en l’acció d’una transposasa que genera un doble strand brake asimètric dins del qual s’afegeix el transposó. A continuació una polimerasa reomple els buits.
Els dos mecanismes de transposició són la transposició simple, utilitzada pels transposons de classe 1, i la transposició replicativa, realitzada pels transposons de la classe 2 i que s’assimila a la conjugació.
En els dos casos es disposa d’un cromosoma donant i un cromosoma receptor que presenta una seqüència diana. Es realitza un tall de doble cadena en els extrems 3’ del transposó i els extrems 5’ de la seqüència diana i s’uneixen els extrems. A partir d’aquest punt el procés divergeix per la transposició simple i la transposició replicativa.
En la transposició simple es realitza un tall pels extrems 5’ de les dues cadenes del transposó i a continuació una polimerasa reomple els buits i una ligasa uneix les cadenes.
En la transposició replicativa es crea la cadena complementària a cada una de les cadenes del transposó original mitjançant una polimerasa i actua també una ligasa. Finalment una resolvasa realitza una recombinació específica de lloc.
32 L’esquema següent mostra la transposició simple i la replicativa: Els transposons també poden utilitzar la maquinària de recombinació homòloga i realitzar una recombinació específica de lloc si s’alineen dues zones idèntiques d’un mateix cromosoma creient que formen part de cromosomes diferents.
Com es mostra a la imatge, si els dos transposons estan ubicats en direcció contrària el resultat del procés serà la inversió del fragment ubicat entre els dos transposons. Si, en canvi, els transposons es troben en la mateixa direcció, es produirà una pèrdua de material genètic amb la formació d’un DNA circular sense origen de replicació.
Pot produir-se també una duplicació de la informació quan això succeeix en dos transposons idèntics seguits en el mateix cromosoma.
33 Els transposons eucariotes poden ser de DNA (com els dels bacteris) o de RNA, i en aquest cas podran ser retrotransposons virals o no virals. De manera general els retrotransposons tenen un cicle molt similar al dels retrovirus.
Els retrotransposons virals són escassos als vertebrats però representen un 5% del genoma humà. Són similars als retrovirus i, igual que ells, presenten seqüències curtes flanquejants i seqüències LTR (long terminal repeats), que mostren un paper en la generació de RNA intermediari.
Els retrotransposons no virals no tenen LTRs i poden ser de tres tipus diferents.
 LINES, long interspersed elements Estan formats per entre 6 i 7 kb i representen un 15% del total del DNA. Destaca la família L1.
 SINES, short interspersed elements Estan formats per 300 pm, representen un 10& del DNA total i tenen una diana per Alu.
 RNAs copiats i integrats També s’anomenen pseudogens processats, no tenen introns i estan envoltats de short inverted repeats Transducció o transformació vírica La transducció o transformació vírica és el procediment pel qual l’ADN és transferit des d’un bacteri cap a un altre gràcies a un virus del tipus bacteriòfag. Pot ser un procés generalitzat o especialitzat.
El bacteriofag lambda realitza una transducció especialitzada o específica de lloc i introdueix el seu DNA a E. Coli gràcies a la presència de seqüècies d’attachment (att).
Quan el DNA de lambda s’introdueix a E. Coli pateix un procés de circularització. Les seqüències attP i attB, que són les seqüències att del fag i el bacteri respectivament, són homòlogues i pateixen un tall de doble cadena seguit per la integració del DNA de lambda a E.
34 Coli per mitjà d’integrasa. El resultat s’anomena progafo i el procés invers és l’escissió, catalitzat per escissionasa.
Generació de diversitat immunològica per recombinació La generació de diversitat immunològica per recombinació és l’últim procés de recombinació específica de lloc.
Totes les cèl·lules tenen un genoma idèntic excepte els limfòcits tipus B o cèl·lules B. Aquestes cèl·lules es sintetitzen a la medul·la òssia i tenen un paper important en la resposta immunitària hormonal ja que tenen com a funció la síntesi d’anticossos.
Les immunoglobulines (anticossos) són glicoproteïnes formades per dues cadenes lleugeres i dues cadenes llargues. Les cadenes lleugeres estan formades per una regió variable (V), una regió d’unió (J) i una regió constant (C); mentre que les cadenes pesades consten d’una regió variable (V), una regió que aporta diversitat (D), una regió d’unió (J) i una regió constant (C).
Les dues cadenes estan unides per mitjà de ponts disulfur.
Cadena lleugera VJC Cadena pesada VDJC Existeixen 3000 possibles cadenes lleugeres i 5000 de pesades, per tant poden arribar-se a sintetitzar 1.4 x 107 immunoglobulines diferents 35 La molècula de DNA de la imatge codifica per una cadena lleugera, doncs té seqüències V, J i C.
Per generar la molècula que contindrà la informació per sintetitzar una immunoglobulina concreta es realitza una recombinació amb escissió del DNA seguida d’un procés d’splicing. Per una cadena pesada es realitzaran dos processos de recombinació per unir DJ i VD i un splicing per unir JC.
La recombinació amb escissió del DNA permet la unió d’una seqüència variable amb una seqüència d’unió i serà diferent per cada limfòcit, és a dir, s’uniran seqüències diferents. La seqüència resultant es transcriu i a continuació es realitza un splicing, consistent en el tall del RNA i el posterior acoblament per unir J amb C. Aquesta seqüència serà la que donarà lloc a la proteïna, però la immunoglobulina no serà encara funcional sinó que haurà d’anar al reticle i patir determinades modificacions.
Per tal de permetre la correcta unió de les diferents seqüències, darrere de V, davant i darrere de D i davant de J hi ha seqüències de reconeixement de dos tipus, de manera que la recombinació només es podrà donar si aquests centres són diferents. D’aquesta manera s’evita la unió de dues seqüències iguals o la unió de V i J.
36 El mecanisme d’unió es basa en el reconeixement de la seqüència, el tall i unió dels dos fragments per acció de la VDJ recombinasa RAG1/2. En la imatge següent, si suposem que la unió es dóna entre V29 i J2, cal tenir en compte que el loop marcat inclou des de V30 fins J1, per tant inclou una seqüència molt gran.
Mutacions Les mutacions són canvis permanents en l’ADN que es transmeten a la descendència. Poden ser causades per agents endògens o exògens o bé poden estar causades per errades en la replicació i la reparació del DNA. Aquestes mutacions podran ser seleccionades o podran desaparèixer.
L’estudi de mutants es realitza mitjançant el seu aïllament. S’utilitzen organismes auxòtrofs, que, de manera contrària als protòtrofs, només són capaços de proliferar en un medi de cultiu si a aquest se li ha afegit una substància específica doncs, degut a una mutació, no és capaç de sintetitzar-la.
Existeixen diferents tipus de mutacions. Poden ser espontànies, degudes a errors en els processos de replicació i reparació, o induïdes per agents mutagènics. Poden produir-se delecions d’un o varis nucleòtids, insercions, translocacions o substitucions. Les substitucions poden ser transversions si es canvia una purina per una pirimidina o a l’inrevés o transicions si es canvia una purina per una purina o una pirimidina per una altra pirimidina.
37 En funció dels seus efectes les mutacions poden ser silents si no hi canvi en la proteïna, sense sentit (nonsense mutation) si produeixen un codó d’stop i generen una proteïna incompleta o una mutació amb canvi de sentit (missence mutation) si la proteïna resultant és una proteïna amb un aminoàcid modificat que pot impedir que la proteïna realitzi la seva funció normal.
Els agents mutagènics que poden induir una mutació es classifiquen en químics, físics, biològics i de laboratori.
Agents mutagènics químics: - Anàlegs de bases Substàncies que s’assemblen molt a bases nitrogenades i generen substitucions.
 5-Bromouracil és molt similar a timina i s’aparella amb guanina, causant la substitució d’AT per GC.
 2-Aminopurina és molt similar a adenina i s’aparella amb guanina, causant també la substitució d’AT per GC.
- Agents alquilants Generen substitucions provocant canvis fins i tot sense replicació.
- Agents oxidants Generen, per exemple, la 8-oxo-guanina, que aparella amb adenina en lloc de fer-ho amb citosina.
- Agents intercalants Indueixen microinsercions i microdelecions.
Agents mutagènics físics: - Radiacions no ionitzants o electromagnètiques UV Provoquen la formació de dímers de pirimidines - Radiacions ionitzants (rajos X i gamma) Tenen un major poder de penetració i generen radicals OH.
Els agents mutagènics biològics inclouen problemes intrínsecs del procés de reparació i els transposons de classe II i III i la mutagènesi de laboratori inclou els transposons i la mutagènesi dirigida.
38 2. REPARACIÓ DEL DNA L’exposició del DNA a baixes dosis d’agents mutagènics provoca mutagènesi en aquest.
L’exposició a altes dosis, no obstant, provoca la mort cel·lular.
Els principals tipus de lesió que pot patir el DNA són l’alquilació de les bases, els entrecreuaments creant dímers de pirimidina, les desaminacions, l’oxidació (8-oxoguanina) i els mals aparellaments.
Reparació de citosines desaminades El DNA ha de tenir una major estabilitat que l’RNA donat que, a diferència del DNA, el RNA té una vida mitja determinada. És per aquest motiu que el DNA presenta timina en lloc d’uracil, tot i tenir la timina una síntesi més costosa. La cèl·lula detecta la presència d’uracil al DNA com a error resultat de la desaminació de la citosina i pot actuar per eliminar-lo.
Uracil DNA glicosilasa detecta específicament la presència d’uracil i l’elimina, formant un lloc AP (a-purinic a-pirimidinic side), indicant que en aquell punt hi falta una base nitrogenada. Una AP endonucleasa trenca els enllaços fosfodiéster i DNA polimerasa introdueix la base complementaria. Finalment una DNA ligasa que uneix la cadena.
Reparació de bases danyades La reparació de bases danyades pot produir-se per fotorreactivitat o per alquiltransferases. La DNA fotoliasa és un enzim que actua per fotorreactivitat. És present en tots els regnes però no en humans i actua traient la base nitrogenada a l’exterior de la cadena i la repara utilitzant la llum. Les alquiltransferases, per la seva banda, eliminen el grup alquil de les bases nitrogenades i seguidament s’autodegraden.
Reparació per escissió de dímers de timina La reparació per escissió en E. Coli és catalitzada per l’escinucleasa UvrABC. En el fag T4 es dóna el mecanisme de la DNA-N-glucosilasa.
El mecanisme d’acció de l’escinucleasa UvrABC s’inicia amb un complex format per les proteïnes A i B que avança pel DNA fins identificar un dímer de timina o una altra zona danyada. En aquest punt s’atura i doblega el DNA (bending) de manera ATP dependent. UvrA es dissocia del complex i s’uneix UvrC. El complex format per BC realitza un nick als dos costats del dímer i una helicasa (UvrD), una polimerasa i una ligasa eliminen el dodecàmer danyat i el substitueixen per nou DNA.
La reparació a través de la DNA-N-glucosilasa es vasa en un atac de la N-glucosilasa seguit per un atac de l’endonucleasa. A continuació participa una polimerasa i una ligasa.
Altres reparacions en E. Coli Les lesions al DNA poden reparar-se també mitjançant el mecanisme descrit de recombinació.
En el cas de la imatge s’ha format un dímer de timines i la cadena no es pot replicar. En aquesta situació el fragment equivalent de la cadena original (vermella) es transfereix al forat 39 de la cadena filla retardada (s’observen els fragments d’Okazaki) per mitjà de la recombinació i l’espai que deixa es reomple per acció de la DNA polimerasa. Intervé per unir els fragments la DNA ligasa.
Un altre mètode de reparació és el sistema SOS, un mecanisme de supervivència explicat al principi d’aquest tema.
Reparació de mals aparellaments La reparació dels mals aparellaments es realitza gràcies al complex MutLHS i a la metilació d’algunes bases. Anteriorment s’havia presentat la mutació com un agent mutagènic, però en aquest context és beneficiosa.
La proteïna MutS detecta dues bases mal aparellades i MutH detecta la seqüència GATC més propera. Es tracta d’una seqüència palindròmica, és a dir que a la cadena complementària hi ha la mateixa seqüència però en sentit contrari. MutL actua unint les dues anteriors. Per identificar quina és la cadena original i quina s’està replicant MutH és capaç de detectar una metilació. Aquesta metilació, en E. Coli, és realitzada per Dam Metilasa, que metila les adenines en el quàdruple GATC. Es tracta d’un enzim poc eficient, és a dir, necessita un temps per localitzar un nou GATC, per això la cadena metilada serà sempre l’antiga.
Un cop detectat el mal aparellament i identificada la cadena problema, MutLHS talla la cadena i aquesta es torna a sintetitzar per mitjà d’una DNA polimerasa, substituint així la base problema per la base correcta. Finalment actua DNA ligasa.
40 Reparación en eucariotas En eucariotes els principals danys que es produeixen al DNA són trencaments de doble cadena i modificacions de bases nitrogenades.
 Double Strand Breaks S’utilitzen els sistemes NHEJ i la recombinació homòloga.
 Bases modificades  Petits canvis produïts per estrés oxidatiu es reparen a través de BER  Canvis grans es reparen per NER  Els canvis durant la transcripció es reparen per TCR (transcription-couple repair) Constantment la cèl·lula realitza DNA damage checkpoints i en cas de detectar-se algun tipus de dany es bloqueja el cicle cel·lular i s’activen els mecanismes necessaris per solucionar-ho.
La reparació d’un double strand brake es repara per NHEJ (non-homolous end joining) o per recombinació homòloga.
41 La recombinació per NHEJ és molt més mutagènica ja que no pren la cadena homòloga com a motlle per reparar la cadena. Es correspon amb la imatge de l’esquerra i es basa en la unió dels dos extrems formats pel trencament de doble cadena. La proteïna més important és Ku80. La recombinació homòloga, en canvi, utilitza cadenes complementàries. Les proteïnes més importants del procés són Rad51, BRCA 1 i 2 i MUS81.
Els mecanismes BER (base excision repair) i NER (nucleotid excision repair) s’utilitzen per reparar una base modificada o un conjunt de bases respectivament. Es diferencien principalment perquè en NER s’escindeix un tros més gran de DNA.
NER seria l’homòloga funcional de UvrABC mentre que BER ho seria de glicosidasa + AP endonucleasa + polimerasa/ligasa.
BER pot subdividir-se en dues vies que s’anomenen short patch i long path. Les dues vies comparteixen la DNA glicosilasa i l’APE. Difereixen en la polβ en la via curta i PCNA, RFC, polδ, FEN1 i Lig1 en la via llarga.
42 Pel que refereix a NER cal destacar els enzims RPA, TF2H, XPA (identificada en Xeroderma pimentosum) i polδ. El procés es basa en el mateix però l’escissió de nucleòtids és major.
Hi ha malalties associades a defectes en la reparació entre les quals destaquen Xeroderma pigmentosum, el càncer colorectal i el càncer de mama. Xeroderma pigmentosum és un defecte en la pell que deriva en càncer de pell i es produeix per errors en els sistemes BER i NER. La conseqüència és una gran sensibilitat de la pell als rajos ultraviolats, provocant l’aparició de ceratosis, cicatrius i úlceres de còrnia. El càncer colorectal és produït per mutacions en gens humans de reparació de mals aparellaments, principalment hMSH1 i hMLH1. Per últim deficiències en els gens BRCA 1 i 2 de la recombinació homòloga estan associats amb l’aparició del càncer de mama.
3. METILACIÓ DEL DNA La metilació del DNA, com ja s’ha vist, pot produir-se per funcions fisiològiques o per motius patològics. En la metilació fisiològics SAM S-adenosil metionina actua com a donador de grups metils en una reacció cadalitzada per DAM metilasa.
En E. coli DAM metilasa metila bases d’adenina dins la seqüència GATC i és útil per la reparació de mals aparellaments. Altres funcions d’aquestes metilacions són la protecció envers endonucleases de restricció, l’evitació de la re-replicació i com a component regulador de la transcripció. Tot i ser l’adenina la base més freqüentment metilada, també pot metilar-se una citosina amb una freqüència de l’1%.
43 En eucariotes es metilen les citosines que van seguides de guanina CG, suposant entre un 3 i un 5% del total de les citosines en animals, encara més en plantes però casi inexistent en insectes.
En l’estudi experimental d’aquestes metilacions va estudiar-se una seqüència de DNA i es va comprovar quines bases dels parells CG estaven metilades (negres) i quines no (blanques) obtenint-se el resultat següent.
S’observa que els dinucleòtids no metilats coincideixen en zones amb parelles CG molt properes que van denominar-se illes CG. Va observar-se també que aquestes illes CG coincideixen amb els promotors dels gens, els orígens de replicació i les zones de recombinació. Globalment pot dir-se que hi ha una correlació entre les illes CG i les zones que necessiten poca compactació en la cromatina.
4. AMPLIFICACIÓ GÈNICA EN EUCARIOTES En determinats moments del desenvolupament, com a conseqüència de tensions metabòliques, es produeix l’amplificació gènica, consistent en l’augment del número de còpies d’un fragment d’ADN determinat per aportar una determinada resistència a les cèl·lules.
Aquest procés es dóna per exemple en insectes proporcionant-los resistència als pesticides. En cèl·lules tumorals l’amplificació gènica és un problema pel tractament ja que proporciona resistència a la quimioteràpia. En cèl·lules resistents a metrotexat, un medicament quimioteràpic, s’observa una amplificació del gen que codifica per DHFR. Aquesta amplificació es produeix per un entrecreuament desigual en la recombinació homòloga normalment per la presència de transposons.
44 ...