TEMA 6 – ANÀLISI DE PRODUCTES DE LA PCR (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 10
Fecha de subida 12/04/2016
Descargas 8

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera TEMA 6 – ANÀLISI DE PRODUCTES DE LA PCR Com analitzem els productes de la PCR? - Electroforesi en gel d’agarosa convencional Electroforesi en gel de poliacrilamida quan necessitem més precisió o distingir diferents mides.
Electroforesi capil·lar Blotting: si no ens interessa per res la mida i sols volem saber si hi ha amplificació o no, farem un dot blot.
Altres mètodes Electroforesi convencional en gel d’agarosa Amb aquesta tècnica determinem la presencia d’una seqüència específica en la mostra analitzada. Correm el producte i mirem si apareix la banda de la mida de l’amplicó hem amplificat.
- Exemple: mirar si es nen o nena, mirant si apareix o no la banda corresponent a una regió de 154pb del cromosoma Y.
Exemple: identificar una infecció vírica. Mirem si el pacient esta infectat pel virus de la hepatitis C, mirem si amplifica o no. El virus de la hepatitis C es un virus RNA: es duu a terme l’aïllament de l’RNA total i per RT-PCR s’amplifica una seqüència de 450bp del 5´UTR d’un gen propi del VHC.
Llavors, és el mes senzill. Comprovem que s’han amplificat fragments de DNA d’una determinada grandària, si la banda que busquem està present o no.
Múltiplex PCR o PCR múltiple En veterinària hi ha mols patògens intestinals (nematodes) de diferents especies. El que podem fer es dissenyar l’amplificació específica del DNA de cadascun dels nematodes. A més, dissenyarem l’amplicó de diferents grandàries per cada espècie i així, distingirem per la grandària, quin DNA hem amplificat.
Exemple: diferents combinacions que hem fet per distingir la infecció de diferents nematodes. Quan tenim un animal infectat, podrem saber de quin(s) nematode(s) està infectat. Necessitem córrer la electroforesi per identificar el nematode infectant.
Detecció de reordenacions cromosòmiques: RET/PTC L’oncogen ret es troba mutat en diferents tumors del sistema endocrí. Únicament s’han descrit reordenacions cromosòmiques que afecten al ret en els tumors del càncer de tiroides papil·lar (PTC). Per tant, l’oncogen ret el trobem implicat en moltes patologies relacionades amb el sistema endocrí i relacionat amb el càncer de tiroides papil·lar (aquesta reordenació es troba en un 40-50% dels tumors analitzats de PTC). Hi ha gens quimèrics relacionat amb el ret.
Exemple: la inversió del cromosoma 10 genera un gen quimèric d’expressió quantitativa: H4. La inversió fusiona la regió reguladora del H4 amb la part estructural del RET. Els punts de trencament es troben en el primer intró del H4 i l’intró 11 del RET. Per tant, el gen quimèric estaria format per la regió reguladora i el primer exó del H4 i a partir del exó 12 del RET, encara que els punts de trencament són variables però, sempre a les mateixes zones.
Podríem dissenyar un encebador a l’exó 1 del H4 i un altre a l’11 del RET. La transcripció es dóna en cadenes diferents.
Si es produeix la inversió, el fragment és més curt i els encebadors estan en cadenes oposades. Llavors, hi haurà amplificació.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Però l’intró 1 del H4 és molt gran i moltes vegades no podem amplificar. Si tenim sort sí, segons el gen quimèric que s’hagi format, segons el punt de trencament. Per tant, en general, de vegades no podem amplificar sobre DNA genòmic. Però, sí que podrem amplificar sobre el cDNA, ja que aquest no té introns. Llavors, farem una RT-PCR; sempre que en fem, hem de tenim en compte que no hem de dissenyar un encebador dintre de l’intró, ja que el cDNA no contindrà aquesta seqüencia.
No podem amplificar per PCR convencional una seqüència de DNA definida per un encebador de l’exó 1 de H4 i un encebador de l’exó 12 de ret usant el DNA genòmic de les cèl·lules tumorals com a motlle. Però, sí a partir d’un cDNA del missatger quimèric. Per tant, si hi DNA genòmic i aquest es pogués amplificar, no distingiríem el cDNA. Llavors, podríem generar el encebador situat en dos exons diferents; així ens assegurem de que sols amplificarem el cDNA.
Açò va be per fer un seguiment dels pacients amb càncer de tiroides. Si tenen la reordenació, el càncer es pot eliminar quirúrgicament o amb tractament radioactiu: es subministren pastilles de iode radioactiu. Podríem detectar cèl·lules amb al reordenació en el torrent sanguini del pacient que ja li hem diagnosticat el càncer; i així li fem el seguiment.
Detecció en gel d’agarosa El DNA no té color, si en té serà degut al colorant que usem per detectar-lo. Un dels colorants mes usats és el bromur d’etidi, un agent intercalant, amb un límit de detecció en torn a 1-5ng de dsDNA. Però és un carcinogen molt potent, per la qual cosa no és massa recomanable d’utilitzar. Les persones que treballaven amb aquest, tenien un plus de perillositat i cobraven més. Ara hi ha colorants menys perillosos.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Per exemple, hi ha diferents colorants fluorescents: uns més i altres menys sensibles. Hi ha uns quants comercials; el més usat actualment és el SYBR Green, més sensible que el bromur d’etidi: pot detectar fins a 20pg de dsDNA. Encara que no es totalment innocu, no es tan perillós com el bromur d’etidi.
A més, podem usar la detecció quimioluminiscent o radioactiva; mitjançant radioactivitat podem arribar a detectar fins uns 10fg. Per tant, la radioactivitat encara té més sensibilitat.
Blotting Si no necessitem separar electroforèticament els productes de la PCR el podem transferir directament (desnaturalitzat) al filtre per a la posterior anàlisi per hibridació. Un dot blot és ideal per analitzar múltiples mostres. Exemple: expression of GATA-6 in neoplastic human adrenal tissues was evaluated by RT-PCR and dot-blot hybridization.
Aquí també usarem la detecció quimioluminiscent o radioactiva, amb una sensibilitat bastant elevada. Permet analitzar diferents mostres que tenim ordenades segons unes coordenades. Aquestes mostres formen una mena d’array amb unes coordenades que analitzem. No sempre ens interessa detectar la grandària del fragment, sinó sols si s’ha amplificat o no. Es com el Southern blot però sols amplifiquem el producte i fiquem una gota a la membrana.
- Dot blot: els pouets tenen forma rodona.
Slot blot: els poeuts tenen forma allargada.
L’aparell de transferència està connectat a una aparell de buit. Per buit, el buffer xucla i la mostra es transfereix a la membrana.
Variació en la grandària del producte de PCR Amplificació de microsatèl·lits Si les variacions són petites, no podrem usar un gel d’agarosa. Si treballem amb microsatèl·lits, la variació podria ser d’un o dos nucleòtids. La grandària de l’amplicó dependrà del nombre de repeticions del microsatèl·lit. El que varia és la part interna. Segons el nombre de reparticions, l’amplicó serà mes o menys gran. Però amb un gel d’agarosa tindrem problemes per detectar les variacions; llavors, usarem un gel de poliacrilamida, en el qual podrem detectar variacions de fins a un nucleòtid.
Si usem gels de poliacrilamida i analitzem microsatèl·lits, veurem que poden aparèixer varies bandes, no sols una. La PCR comet petits errors que pot variar el nombre de repeticions amplificades: tartamudeig. Normalment s’usa com a referencia la banda principal, la qual ens indica la grandària del microsatèl·lit.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Electroforesi capil·lar Característiques: - Elevada resolució Petits volums de mostra (1-10nl): són suficients mostres molt petites, podem treballar amb molt poca quantitat de DNA.
Separació ràpida (1 a 45 min.) Automatització Quantificació Reproducibilitat El producte l’hem de marcar fluorescentment. A més, enlloc de bandes detectarem pics: quan passa el producte pel detector, fa la lectura d’intensitat de fluorescència. Enlloc de la intensitat de la banda, mesurem l’alçada del pic. Tenim els pics principals i els secundaris deguts al tartamudeig.
Si les expansions dels microsatèl·lits no són massa grans, per PCR els podrem detectar sense massa problemes. Però, el problema vindrà quan les expansions siguin excessivament grans.
- Si hi ha poques repeticions, les detectarem.
Si augmenta molt el nombre, costarà detectar aquestes repeticions i veurem pics de tartamudeig. En aquests casos el Southern et detecta sense problemes les repeticions: s’usa per confirmar si l’individu és homozigot o heterozigot.
De vegades podem fer petites trampes. Es poden introduir uns encebadors interns que reconeguin les repeticions. En l’amplificació farem fragments més petits. Enlloc d’observar un sol pic gran, en veurem diversos, segons la mida de l’amplificació, ja que l’encebador podrà hibridar en diferents punts de la regió on es troben les repeticions en tàndem. Apareixeran una sèrie de pics que serà el que hem anat amplificant. Els fragments petits són els que s’amplifiquen mes eficaçment.
Exemple: pic de 21 repeticions. Hi ha una uns pics que van mes enllà: has aconseguit amplificat fragments interns entre un extrem i l’altre. Si a partir del 21 has aconseguit amplificar, és que hi ha un al·lel més gran. L’individu no és homozigot per 21 repeticions, sabem que hi ha un al·lel mes gran però, no sabem de quina mida. Per tant, acabem fent el Southern per confirmar.
Pèrdua d’heterozigosi (LOH) També podem detectar pèrdua d’heterozigosi. Pot ser que no hi hagi desaparició d’una banda, sinó que aparegui una banda molt menys intensa.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Es pot fer mitjançant gels de poliacrilamida o per electroforesi capil·lar. Simplement es tracta de veure que passem de veure dos pics (heterozigot) a sols un (homozigot o hemizigot). Exemple: en un teixit tumoral veiem sols un pic quan en el teixit normal en detectem dos.
Podem comparar els dos patrons per separat o córrer en la mateixa electroforesi els dos teixits. Els encebadors per amplificar el teixit tumoral i el normal els marquem amb diferents fluorocroms. Llavors, trobarem superposats els dos patrons. Si hi ha alguna diferencia, serà molt més fàcil d’observar.
Per tant, la PCR serveix per detectar molt be la LOH i la inestabilitat de microsatèl·lits.
Detecció de mutacions per PCR De manera semblant al Southern blot, podem analitzar mutacions que afecten a la seqüencia estudiada (amplificada).
Recordem que en el Southern no necessitem treballar amb el genoma, sinó que simplement amplifiquem la seqüencia que volem analitzar. No necessitem tot el genoma, ni que estigui de bona qualitat ni molta quantitat...
PCR-RFLP Exemple: Anèmia de Fanconi. ens interessa analitzar diferents polimorfismes que estan en la regió 3’UTR de un gen.
Per Southern treballaríem sobre DNA genòmic, digerim amb els enzims corresponents... Per PCR és molt mes ràpid.
Fem una PCR per tenir molt DNA i després una segona PCR niuada on amplifiquem les regions concretes on sabem on estan els polimorfismes. Després digerim amb l’enzim de restricció MstII sobre el DNA amplificat, no sobre el DNA genòmic. Mirarem si talla o no, si hi ha o no digestió. En l’últim cas que inclou dos polimorfismes, fem dues digestions, i cadascuna l’analitzem amb enzims de restricció diferents.
Detectarem per cada polimorfisme si es homozigot per presencia o absència de digestió, o si es heterozigot.
Per tant, fiquem una diana de restricció que afecta a la mutació. Analitzem amb una sonda especifica que hibrida: si no digereix, la banda seria més gran; si ho fa, veurem una banda més petita. Bastaria de ficar una seqüència de 500pb que inclogui la seqüència que ens interessa. Si hi ha digestió obtenim dos fragments (millor de mides diferents) i si no talla, sols un fragment més gros.
Amplifiquem, digerim el producte d’amplificació i després analitzem amb una electroforesi en gel d’agarosa per separar els productes de digestió: 500pb vs. dues bandes de 300pb i 200pb.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Recordem que les bandes del heterozigot, si mirem la intensitat, esperem que siguin de la mateixa intensitat, perquè detectem la sonda que hibrida, no la quantitat de sonda. Quan major colorant fluorescent, més intensitat. Quan hi ha dues bandes, la sonda es repartirà entre els fragments de 300pb i 200pb: la banda de 300pb tindrà mes intensitat, ja que és mes gran i retindrà més intensitat; encara que tingui les mateixes copies de DNA. A més, si al carril del costat tenim una banda de 500pb, aquesta tindrà una intensitat major encara.
Podem fer l’anàlisi per analitzar diferents mutacions. Podem analitzar 4 polimorfismes amb l’estratègia adequada.
Fem un fragment de DNA amb els polimorfismes que ens interessi i els digerim amb diferents enzims per veure si està aquell polimorfisme variant. Però, ho digerim per separat.
PCR específica d’al·lel – encebadors (ASA) El Southern, el que detecta són variacions en la llargada del fragment de restricció. Ha d’afectar a la diana de restricció o a la llargada dels fragments de restricció. En ASA detectem si hi ha o no restricció, veiem si esta un al·lel o un altre.
La mutació podria afectar una diana de restricció, però si no, ho podem analitzar també per PCR. Si afecta a la diana, serà molt més fiable detectar si digereix o no.
Però, en aquest cas, el que mirem és si amplifica o no, encara que no és tan fiable, però si ho és prou.
Més que mirar si digereix o no, mirem si amplifica o no, segons si està l’al·lel o no.
En l’extrem 3’ de l’encebador, si aparella de forma estable en el motlle, la polimerasa no tindrà cap problema en amplificació. Si no aparella correctament, desestabilitza el cicle inicial de l’amplificació i no hi ha síntesi. Llavors, hem de sintetitzar encebadors que es trobin on la mutació.
O també podem dissenyar dos encebadors per l’extrem 3’OH: un específic per l’al·lel 1 i l’altre per l’al·lel 2.
Exemple: hi ha una al·lel amb G i un altre amb A. Creem un encebador en que el nucleòtid de l’extrem 3’OH coincideixi amb la mutació A, i un altre amb una C. Tindrem tres encebadors, dos específics d’al·lel i un per l’altra banda de la cadena. Faríem dues PCR: una amb l’encebador 1 i 3, i una altra amb el 2 i 3. Si hi ha amplificació, està present l’al·lel corresponent; si amplifiquen les dues: heterozigot, si sols un: homozigot pel primer o segon al·lel.
Control d’amplificació Detectem X mutació. Hem dissenyat dos encebadors específics d’al·lel: un acabat en T i altre en C. El que tenim és el producte comú i el mutat. Com veiem es poden veure les dues bandes si es heterozigot però, són dues bandes molt properes; el primer producte es major però, sols per unes 20nt. En la cua que sobresurt del primer encebador, hi ha moltes AT i per tant, la temperatura d’annealing no és massa diferent de la de l’altre. S’ha de procurar que l’extrem 5’ de l’encebador curt contingui un error perquè no és continuï l’amplificació.
El que passa es que si ens fixem, un dels resultats que podem esperar es absència d’amplificació. Per tant, necessitem un control, ja que la no amplificació també podria ser perquè la PCR hagi fallat. Llavors, és una PCR dúplex: Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera s’amplifiquen dos amplicons, el que analitzem i el control. L’amplicó control deurà tenir una grandària diferent per saber a quina banda correspon cada amplicó.
Perquè no es continuï l’amplificació, es col·loca un nucleòtid erroni per desestabilitzar la proteïna. La desestabilització en el extrem 3’ no és igual de forta per tots els casos. AC i i GT es poden unir prou be, encara que no amb la mateixa força que GC i AT; en cas de AC i GT la polimerasa sí que podria unir-se i seguir amplificant. Per evitar açò, ficarem parells de bases la unió de la qual es molt dèbil: GA, CT i TT.
A més, si un dels resultats es absència de resultat en sí, necessitarem el control que ens indiqui que és fiable aquesta absència de resultat. Podem fer diferents dissenys de PCR, podríem fer un que ja tingui el control. Amplificarem un al·lel o altre, o els dos; no hi ha possibilitat de que no hi hagi cap sinó es que falli. Per tant, en una sola reacció ja tenim la fiabilitat.
Dissenyem un encebador per l’al·lel de A i un altre pel de G, però aquest per la cadena complementaria. Si està present el de A, a la cadena complementaria tindríem una C. Dissenyaríem un encebador en la cadena complementaria que acabarà amb C. Per poder amplificar necessitaríem dissenyar un encebador revers pel al·lel 1 i un altre específic pel 2.
Llavors, dissenyem dos encebadors per cadena: f1, r1, f2, i r2. Per tant, obtens dos productes de PCR quan és heterozigot, encara que com sempre, deuran ser de diferent grandària per diferenciar-los. A més, s’amplificarà un producte gran entre els dos encebadors reversos que sempre amplificarà, ja que els dos amplicons (al·lel 1 i 2) comparteixen un tros de seqüencia.
Identificació d’una mutació que confereix susceptibilitat a la hemocromatosi PCR específica d’al·lel – sondes (ASO) Com usem els oligonucleòtids com a sonda? La manera mes fàcil és per Dot blot. Amplifiquem per PCR però, no cal que es separen electroforèticament. El transferim i fixem sobre un filtre: és com un Southern on no hi ha electroforesi.
Després hibridem les sondes especifiques d’al·lel.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Si treballem amb oligonucleòtids, un mismatch pot generar prou inestabilitat a l’estructura hibrida per evitar que es mantingui la hibridació. Si desestabilitzem l’extrem, la desnaturalització és molt dèbil però, si és al centre més o menys, baixa molt la Tm d’aquesta estructura hibrida. Llavors, hi ha que trobar les condicions perquè la hibridació sigui perfecta o no hi hagi hibridació directament (aparellament imperfecte). Si augmenta molt la severitat, es deshibridaran els dos tipus de sondes però, trobarem un punt on la severitat permeti que si l’aparellament sigui perfecte i es mantingui la hibridació però, que si hi ha un mismatch, que es desnaturalitzi.
ASOH - L’anàlisi es fa per dot-blot directe El DNA motlle és DNA amplificat per PCR corresponent a les seqüències a analitzar Les sondes són oligonucleòtids de 19-21nt Tots els Dot blots han d’incloure controls. Hem de trobar les condicions on el control positiu hibridi i el negatiu no, segons si la hibridació és perfecta o no.
Dot blot directe: un Dot blot el podem deshibridar i tornar a hibridar. A més, en farem dos: un amb el control i al·lel 1 i un altre pel control i al·lel 2. Segons les coordenades podrem saber si es homozigot o heterozigot.
Dot blot revers: és un mètode molt bo per analitzar múltiples mostres per una mutació en concret. A més, també podem analitzar diferents mutacions en una mateixa persona. Exemple: tindrem 10 sondes: 5 de l’al·lel normal i 5 pel mutat.
1. Si hibriden totes les sondes normals, l’individu es normal, almenys per les 5 mutacions que estem analitzant.
2. Pot ser que a la 4ª mutació hibridin els dos: heterozigot per aquesta mutació.
3. En el primer sols hibrida el mutant, té la mutació del primer al·lel.
4. Doble heterozigot.
La majoria de Dot blots es venen de manera comercial.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera Detecció de metilacions per PCR També podem analitzar metilacions que afecten a les bases de la seqüencia estudiada, això si, d’una manera diferent al que fem per Southern blot.
Per què ho hem de fer diferent?. En el Southern ho fem amb el DNA genòmic que hem aïllat; digerim amb agents específics sensibles o no a la amplificació. Però, en la PCR amplifiquem, encara que el amplifiquem estarà sense metilar. Per tant, perdem la referencia. Necessitem una estratègia perquè al amplificar, sapiguem si el DNA estava metilat o no.
Utilitzem el bisulfit. El DNA que aïllem el podem digerir amb enzims (Southern); si és per PCR, el que solem fer es tractar amb bisulfit i després amplificar, i llavors analitzar-lo d’una manera u altra. Els dos grans mètodes que hi ha són per analitzar enzims de restricció sensibles a la metilació o tractar amb bisulfit.
Tècniques per detectar llocs específics de metilació del DNA: - Digestió amb enzims de restricció  Southern blot.
Mutagènesi amb bisulfits: o COBRA o PCR de metilació específica o Sequenciació per bisulfits o MassArrayH MALDI-TOF o Piroseqüenciació Seqüenciació / Bisulfit sòdic – Metilacions específiques El tractament del DNA amb bisulfit sòdic provoca els canvis de citosines a uracils per desaminació.
Les citosines metilades (5-metilcitosina) són resistents al tractament.
El bisulfit desamina la citosina i la converteix en uracil. Si la C està metilada, el bisulfit no desamina. Llavors, desaminem les C no metilades, les quals es converteixen en U. Llavors, ja tenim una manera de detectar si la C estava metilada o no. Llavors, el que fem es canviar el motlle.
Imaginem que té aquesta seqüència. Tractem amb bisulfit i les C no metilades en convertiran en U. Apareixerà un gràfic: les C que apareixen només són les que estaven metilades. Quan passa a U apareixen dos pics, ja que C  U i aquesta U que quan amplifica el DNA, per replicació, serà una T: apareix un pic per U i un altre per T.
La hidroximetilació tampoc es desamina amb el bisulfit. Llavors, no podrem distingir els dos tipus de metilació. Però, si prèviament oxidem el DNA, la 5hmC passa a 5fC (5.formilcitosina), la qual si es desamina amb bisulfit. Llavors, quan tractem, on hi hagi una 5hmC sí que es desmetilarà. Amplifiquem per PCR, seqüenciem, comparem... Les que abans eren C i ara són T, es que eren C no metilades o hidroximetilades.
Diagnòstic Genètic Molecular Alba Ibáñez Galera PCR específica de metilació (MSP) Dissenyem encebadors per saber si les C estan o no metilades. Tractem amb bisulfit per transformar les C no metilades en U. Dissenyem dos encebadors idèntics però un amb la seqüència corresponent a la seqüència amb U (A) i un altre amb les C (G) tal qual. Segons si esta metilat o no, hi haurà una amplificació o una altra. Finalment, comparem les dues coses. A més, en cas d’un tumor, observaríem les dues bandes, ja que hi ha copies de DNA metilades i altres que no.
Combined bisulfite restriction analysis (COBRA) S’usen les dues tècniques que hem vist abans. S’utilitzen enzims de restricció que reconeguin la diana on estiguin les citosines que poden estar metilades o no. Aïllem el DNA genòmic, el tractem amb bisulfit; si les C estan metilades es desaminen i passen a ser U. Si la diana està l’enzim talla, si no està no talla. Llavors, segons si talla o no, podríem saber si hi havia metilació o no.
- Una banda: han desaparegut les C i no ha tallat.
Dues bandes: la C no ha desaparegut, l’enzim de restricció ha pogut tallar.
Tres bandes: ho podem trobar en teixit tumoral.
Si mirem la intensitat de les bandes, podem saber quina proporció de DNA estava metilat i quina proporció no ho estava.
La seqüenciació és mes fiable però més costosa que els altres dos mètodes.
...

Comprar Previsualizar