TOT Enginyeria Genètica (1 únic doc.) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 4º curso
Asignatura Enginyeria genètica
Profesor V.N.I.A.F.
Año del apunte 2016
Páginas 57
Fecha de subida 22/10/2017
Descargas 2
Subido por

Vista previa del texto

CTRIGUERO ENGINYERIA GENÈTICA (Apunts de classe, no passat a net) TEMA 1 - ENGINYERIA GENÈTICA DNA P 5’ HO 3’ 3’ OH 5’ P Poca regió en el DNA que sigui codificant - Exons = codifiquen per proteïnes - Introns Promotor indica l’inici de la transcripció dels exons 5’-UTR 3’-UTR Zona transcrita però No traduïda Hi ha un codó de parada en l’últim axó Secció 3’ s’allarga en secció d’AAA = codó de parada TECNOLOGIA RECOMBINANT - Aïllar el DNA, - Tallar el DNA en fragments de mida manejable, - Amplificar els fragments pel seu emmagatzematge i posterior anàlisi, - Identificar i aïllar seqüencies específiques, - Caracteritzar per la mida la localització genòmica i la seqüència.
TALLAR EL DNA ~3,100,000,000 parells de bases en un genoma humà haploide.
Un cromosoma té de mitjana ~13 millions de bp El DNA es talla amb enzims derivats de bacteris, endonucleases específiques.
El fet de tallar s’anomena “digestió”.
ENZIMS DE RESTRICCIÓ = Tallen el DNA (digereixen) Son proteïnes que reconeixen seqüències de nucleòtids curtes i específiques i tallen el DNA en aquests punts.
- Exonucleases: comença pels extrems 5’ i 3’ Endonucleases: talla el DNA pel mig, seqüències específiques (diferent en funció del enzim) Els enzims de restricció deriven dels bacteris.
Els bacteris contenen al voltant de 400 enzims d’aquests tipus i reconeixen i tallen fins a 100 seqüències diferents de DNA.
MECANISME DE DEFENSA DELS BACTERIS  contra virus  Metilen les susceptibles dianes de restricció que substitueixen amb el seu DNA.
PALÍNDROM: Imatge especular 5’ -----G A A T T C ------3’ 3’ -----C T T A A G -----5’ Al tallar podem obtenir 2 extrems: - Extrems COHESIUS: sempre queda protuberància de cadena senzilla (tant 5’ com 3’) - Extrems ROMS: els 2 extrems en forma de doble cadena.
1 n= numero de nucleòtids a la diana de restricció CTRIGUERO Dianes  De 4, 6 o 8 nucleòtids Mateixa proporció dels 4 nucelòtids distribuïts al atzar -> 4n = com mes petita es la diana més seqüencies talla i més curtes són.
Mida fragments de restricció: n = 4, 256 bp n = 6, 4096 bp n = 8, 65.5 kb bp 19/09/16 Visualització del DNA digerit: ELECTROFORESI EN GELS D’AGAROSA Per veure si la digestió a funcionat o no ELECTROFORESIS: volem que el DNA es desplaci mitjançant l’aplicació d’un camp elèctric El DNA te carrega elèctrica que li donen els seus grups fosfats.
El DNA es desplaça en funció de la mida del fragment de manera que els fragments que es desplacen mes són els mes petits i els mes grans queden retinguts.
La agarosa en el gel crea una xarxa per on es desplacen els fragments. Si faig una xarxa molt compacta, amb molta agarosa, es desplaçaran millor els petits (si esperem fragments petits farem un gel amb més agarosa i si volem fragments grans farem un gel amb menys agarosa) Volem que passi el corrent elèctric, per tant també hem de posar una solució tampó per subministrar ls electrolts necessaris perquè la electricitat passi ple nostre gel.
Per veure els fragments utilitzem llum ultraviolada.
S’afegeixen uns compostes fluorescents que són agents intercalants (Bromur d’Etidi) -> és un agent mutagen.
Quan hagi finalitzat la electroforesi veiem una determinada fluorescència.
Resultat C: fragment sense digerir Resta de carrils: fragments amb diferents enzims de restricció - 1: S’ha tallat en 2 (si es un fragment circular, l’enzim haurà tallat 2 cops, si es lineal, 1 cop) - 4 i 6: Digestió parcial del fragment (encara queda molt del que tenia inicialment) Carrils L: Col·lecció de fragments amb mida coneguda -> patrons (Marcadors) LLIGACIÓ: Unir un fragment que ens interessi amb un vector.
Enllaços fosfodièster -> participen els grups fosfats i els sucres (tenen grups OH) Per unir 3 fragments de 2 digestions necessitem uns enzims que lliguin aquests dos fragments  DNA lligasa Els enzims de restricció venen de bacteris-> funcionaran a 37ºC La DNAlligasa la obtenim d’un bacteriòfag.
Els enzims de restricció generen extrems cohesius (tenen una petita cadena senzilla-> es fàcil per la DNA lligasa encaixar cadenes complementaries-> s’establiran pons d’hidrogen) i extrems roms Si es circular, el fragment que vull ajuntar es pot donar la volta i no tindria l’ordre que fa les proteïnes que vull.
Per solucionar-ho: hem de fer que el cap i les cues siguin diferents -> si tallem amb 2 enzims diferents el cap estarà tallat amb l’enzim 1 i la cua amb l’enzim 2. El fragment també es talla amb dos enzims diferents.
2 CTRIGUERO Nomes podem enganxar extrems que provinguin d’enzims compatibles (si tallo el fragment A amb l’enzim 1 i el fragment B amb l’enzim 2 i són compatibles i la DNAlligasa uneix els extrems, tindre un combinat de les dues dianes i no podria tornar a tallar amb el mateix enzim) (son compatibles només a nivell de la cadena senzilla) CLONATGE Objectiu d’unir un fragment amb un vector és obtenir molta més quantitat( Moltes còpies) Ho fiquem en bacteris i cada cop que es divideixen fan una còpia Si el combinat circular el volem ficar en bacteris necessitem: - Elements necessaris perquè el plasmid es recombini - Gen característic per diferenciar on està.
- Dianes de restricció Vector de clonatge més senzilla: Diapo - Verd: EcoRI, Sall... = Dianes de restricció -> Dianes úniques (només estan a una zona determinada xq sempre s’obri el cercle pel mateix lloc) (es posen 2 per que s’obri en una determinada direcció) - Vermell: Origen de replicació - Blau: Gen marcador (normalment un gen que li permeti ser resistent a una droga (antibiòtic)) -> permet discriminar els bacteris que m’interessin (que tingui incorporat el plasmid) dels que no.
Un cop fet el creixement amb antibiòtic tindrem els bacteris que han incorporat el plasmidi.
Si en aquest punt es segueix el creixement sense antibiòtic, aquest plasmid no s’anirà replicant, perquè ja no els hi suposa un avantatge (nomes mantindran el plàsmid mentre els hi suposa una avantatge) Quan volem estudiar un gen concret ens interessa ficar el vector en cels eucariotes Haurem de trobar el promotor...
Li hem de donar a la seqüencia tots els elements necessaris per poder fer una proteïna Falta dia 21/09 26/09/16 TEMA 2 AMPLIFICACIÓ DEL DNA Tot el DNA per un gen és 1 μg Un cop clonat si que es pot fer molta quantitat PCR=Reacció en cadena de la polimerasa Objectiu: arribar a ser capaç de veure els fragments de DNA (incrementar la massa per tenir tots els micrograms que vulguis) En determinats moments una cèl·lula fa una còpia del DNA (Replicació del DNA) Elements necessaris: - Motllo de doble cadena (DNA que volem copiar) - Primers (la DNA pol ha de saber on ha de començar a replicar) -> la direcció de síntesi sempre és 5’-3’ - dNTPs 3 CTRIGUERO L’encebador estableix relació amb el motllo -> són complementaris = s’estableixen unions de ponts d’H LA polimerasa un cop vegi l’encebador serà capaç d’afegir nucleòtids Necessitem el motllo perquè la DNA pol afegeix el complementari (necessiten un motllo per saber quin nucleotid han de posar) La DNA-pol va afegint nucleòtids fins al final i tindrem un DNA de doble cadena.
Per assegurar-me que l’encebador s’uneixi a la zona que jo vull es juga amb la llargada del encebador-> com més llarg millor. Normalment utilitzem encebadors de 20 nucleòtids (la probabilitat és de 10 -13 -> es suficientment específic perquè s’uneixi nomes on vull) És necessari separar les dues cadenes del motllo -> opcions: - calor: trenca els ponts d’hidrogen i separa les dues cadenes però posa en perill la activitat del enzim.
- ÀCID o BASE-> trencarà ponts d’H però de forma irreversible. També afecta a la DNA pol.
Un cop hem fet aquesta reacció (hem escalfat la mostra diverses vegades) encara no haurem arribat a la quantitat suficient.
Necessitem una opció alternativa Si es vol amplificar un DNA de doble cadena es necessiten 2 encebadors (1 per cada cadena) 5’ _____________________ 3’ 3’ <--CUA—5’ 5’---CAP--> 3’ 3’______________________ 5’ La seqüencia del encebador de CAP serà la mateixa de la seqüencia que tenim en 5’-3’ Per l’encebador de CUA haurem de fer la complementària, però sempre en direcció 5’ -3’ (començarem a escriure pel final = el 1r nucleòtid que escrivim del encebador serà complementari al ÚLTIM nucleòtid del complementari) Thermus aquaticus: Viu a les aigües termals (viu en temperatures elevades) -> tindrà una DNA polimerasa que ens permet treballar a temperatures més elevades.
Per desnaturalitzar el DNA hem de pujar a temperatures de 92-95ºC Els enzims d’aquests bacteris ens permeten treballar a una temperatura de síntesi de 60-72 ºC Ara si que podem fer molts cicles d’aquestes reaccions-> tindrem un creixement exponencial del fragment.
1. Escalfem el motllo (92-95ºC) -> tinc cadena senzilla 2. Baixem la temperatura (quantes més G i C tinguin tindran una temperatura d’hibridació més alta -> depenent d’això ajustem la temperatura)  S’hibriden els encebadors (60-72ºC) (si baixes la temperatura a 37ºC es podrien hibridar a altres llocs) 3. DNApol fa la complementaria= Extensió o síntesi (60-72ºC) Aquestes 3 etapes són un cicle .
4. Inici d’un nou cicle Això ho fem n vegades -> fins a poder visualitzar el meu fragment amb una electroforesi.
! PCR a temps final -> veiem el resultat al final 4 CTRIGUERO És una reacció exponencial (primer 2 , després 4, després 8, etc.) El numero de molècules que haurem sintetitzat serà 2n (n=numero de cicles) DNA 1r hi ha creixement exponencial Després l’enzim ja no dona mes de sí = SATURACIÓ.
La PCR a temps final ens dona info QUALITATIVA (si el fragment està o no, no podem saber quant tenim Nº cicles Moltes vegades treballem amb mRNA (és el que diferencia les diferents cèl·lules) A partir del mRNA de totes les cèl·lules obtenim menys quantitat encara Es de una cadena -> el podem transformar a cDNA cDNA= DNA sintetitzat a partir d’un motllo de mRNA per acció d’un enzim d’origen viral =Transcriptasa inversa Diferents components que necessitem per fer-ho: - Motllo de RNA (pot ser RNA Total o només mRNA) - Transcriptasa inversa - dNTPs - Tampó per la RT - Primers Els mRNA al extrem 3’ tenen tots una cua de poli As (AAAAA) Primers: - Oligo dT= (TTTTTT) –> s’hibridarà a la cua 3’ (només per mRNA) - Random hexamers –> 6 nucleòtids amb totes les seqüencies possibles -> s’hibridaran a molts llocs -> pots treballar a partir de mRNA o també de RNA total Per assegurar-me que faig nomes la copia de cDNA del mRNA que m’interessa -> si saps la seqüencia del missatger dissenyar una seqüencia -> de 20 nucleòtids (poc aficient com a aproximació) 28/09/16 Síntesi de cDNA TI (transcripció inversa) mRNA -------------> cDNA ------------------> cDNAds RNAssh DNA pol (2) Llibreria DNA és diferents que llibreria cDNA (1) Llibreria DNA= totes les cèl·lules tenen el mateix DNA Llibreria cDNA = info mRNA q s’expressa en una condició concreta, podem enriquir seqüencia que volem cDNAs + Adaptadors (=seqüencia de DNA) = dianes de restricció per clonar RNA en els nostres vectors.
(1) Aïllament de clons corresponents a Hb: Per DNA genòmic hauríem d’aïllar 1 de 1.000.000 clons cDNA d’eritròcits: 1 de cada 3 clons Per estudiar elements reguladors (promotors)  llibreria DNA 5 CTRIGUERO PCR quantitativa: veure a temps reals l’aparició del producte que estic sintetitzant, que sigui fluorescent, Treballarem a la zona de creixement exponencial de la reacció.
Compostos fluorescents: - Agents intercalants (SYBR Green) Emet fluorescència quan s’intercala en una molècula de doble cadena, També es pot intercalar en parella de primers q facin un dímer - Sondes TAQMAN: sondes hidrolítiques Fluorescència quan la sonda estableix enllaç amb la cadena de DNA Comencen a sintetitzar les dos cadenes noves (DNA pol), la sonda es desenganxarà i emetrà fluorescència + Sistema exclusiu d’un determinat fragment que volem amplificar ( + cost) Conformacions diferents, estan + allunyats F i Q i veus la fluorescència, no l’apantalla Patró  DNA de concentració coneguda Dilucions Que sigui sensible ( dins límits, en proves amb poca Q = prova paternitat, etc.) i especifica (nomes fragment que ens interessa) Gens de referencia= gens housekeeping  expressar-se en tots els txts, a un nivell basal tota l’estona.
Grau d’expressió Ct= fluorescència del nostre producte correspon al llindar 6 CTRIGUERO 3/10/16 APLICACIONS DE LA PCR (diapo) CLONATGE: · MÈTODE TA: Es basa en una propietat que te la Tag polimerasa -> Ens permet fer la reacció de síntesi a 72ºC Ens els fragments que amplifiquem mitjançant aquesta Tag pol ens genera un fragment de doble cadena i als extrems hi afegeix una A 5’-------------- 3’A A3’-------------5’ (no serà la pol que utilitzarem quan volem diagnosticar mutacions perquè comet força errors) Però en aquest cas l’utilitzem per clonar aquest tipus de fragments Si tenim un vector que ens donis les 2 T complementaris podem unir aquests fragments.
No podem controlar la orientació perquè en els 2 extrems 3’ tenim les A i als 5’ les T · MÈTODE IN FUSION Farem servir enzims de restricció però nomes per linealitzar el vector Sempre intentarem tallar amb 2 enzims perquè el vector no es tornes a tancar sobre ll mateix i a me dona una orientació.
Aquí seguim la estratègia clàssica-> tallem amb els 2 enzims i tenim el vector linealitzat.
Ara es fa una reacció de PCR del fragment que ens interessa. Implicarà el disseny de 2 encebadors un de cap i un de cua E1 5’-------------------3’ <---------------> 3’--------------------5’ E2 Afegeixo dianes de restricció com una cua dels encebadors que estic utilitzant (E1 i E2) Al final la seqüencia que la principi no s’hibridava, acaba formant part del fragment ____________________ |E1 | Insert | E2| Enzim In fusion: Un enzim que em permet encaixar ...? Aquest enzim ha de fer a la vegada d’enzim ha de ser capaç de menjar-se una de les cadenes-> genera les protuberàncies senzilles perquè encaixi amb el vector i a més ha de fer com la Lligasa (fa d’enzim de restricció i de lligasa) Es menja els extrems sense afectar la seqüencia que jo vull clonar. (només afecta al tros E1 i E2) 7 CTRIGUERO · MÈTODE INDEPENDENT DE LA LIGASA (LIC) Si els pont d’hidrogen son suficient, ens podem estalviar el pas de la ligasa 5’-------------------3’ <---------------> 3’--------------------5’ Generarem un fragment de PCR amb aquest extrems de les cues dels encebadors Ara utilitzem un altre enzim: T4 DNA pol Insert Les polimerases son capaç d’anar enrere i tallar (parar error que han fet i corregir)-> EXONUCLEASA 3’-5’ En la transcripció no hi ha tanta fidelitat. Sobretot afecta en la replicació del DNA T4 DNA pol te activitat polimerasa i exonucleasa.
Hem d’afavorir la activitat exonucleasa: Tracto el vector i l’incert amb la T4 DNA pol -> només afegeixo 1 dNTP i que NO sigui complementari-> no pot polimeritzar perquè no te els nucleòtids que necessitaria.
Acabem tenint protuberàncies de com a mínim 12 nucleotids tant al vector com al insert -> e barregen · GATEWAY CLONING TECHNOLOGY Aquest mètode esta basat en Recombinació --------- ---------- --------- ----------- Fag λ INTEGRASA Amb els encebadors hem d’introduir els llocs que necessita la integrassa per recombinar Això s’ha de fer en 2 passos Tenim el Fragment o incert de PCR amb les seqüencies que necessitem perquè actuï la integrasa Aquest fragment l’hem de posar al Entry Vector Ara treballem amb un 2n vector: DESTINATION VECTOR -> també tenim els llocs d’integració que estan franquejant la seqüència d’una proteïna tòxica Si barrejo els 2 vectors i afegeixo la integrasa tindrem uns altres 2 vectors (VEURE DIBUIX DIAPO) El nostre incert ha passat del entry vector al destination vector Com a producte secundari hem generat el Entry amb la seqüencia de la proteïna tòxica Ara la barreja la posem a dins de cels de E.coli -> Els bacteris que agafin el de la seq. De la prot tòxica moriran Per que l’altre vector es mantingui al bacteri -> també ha de portar un gen de resistència a antibiòtics (necessitem pressió selectiva perquè el expresion vector es continuii propagant) 8 CTRIGUERO 5/10/16 PCR COM A EINA DE DIAGNÒSTIC - Diagnòstic prenatal - Diagnòstic infeccions - Detecció de transgènics Avantatge respecte altres tècniques de diagnòstic: - La quantitat de mostra que necessitem es molt més petita - És molt fiable.
Problema: es una tècnica molt susceptible de ser contaminada.
PCR per forense cDNA Per assegurar-nos que tenim extrem 5’ o 3’ : Tècnica RACE Es pot utilitzar pels 2 extrems Ens assegurem que per una banda obtenim l’extrem 5’ i per laltre el 3’ Podríem aconseguir tenir la seqüencia sencera Per obtenir l’extrem 3’: 3’-RACE Cua de poli A per hibridar una seqüencia de T, utilitzo un oligodT combinat amb una seqüencia arbitraria que decidim nosaltres (tindrem encebador amb seqüencia definida) Sintetitzem una cadena complementaria del nostre mRNA -> obtindrem cDNA Ara volem utilitzar aquest cDNA pel PCR Per tenir l’extrem 3’ sencer: - L’encebador de cap l’he de posar en algun lloc del cDNA, he de conèixer, almenys parcialment, 20 nucleotids de la seqüencia del missatger .
- El encebador de cua serà una seqüencia complementaria a la seqüencia arbitraria que havíem afegit a la cua de Ts Tindre la regió 3’ sencera sí o sí perquè es fa fins la seqüencia arbitraria que queda mes enllà.
Quan volem l’extrem 5’ 5’-RACE: Primer específic corresponent al missatger que volem amplificar posteriorment Hem de conèixer una seqüencia parcial Sintetitzarem el cDNA corresponent 5’------------------------AAAA |||| <----- cDNA Encebadors pel PCR: Hem de modificar l’extrem 5’ per poder tenir un anclatge per poder dissenyar uns encebadors Ficarem una cua de nucleòtids  Hi ha un enzim Transferasa Terminal que permet afegir una cua constituïda d’un únic nucleòtid al extrem del missatger  Farà Cua homopolimèrica Ara en el PCR puc utilitzar: - Encebador complementari a aquesta cua que he afegit - Encebador de cua complementari al que he fet servir per la reacció amb el RNA 9 CTRIGUERO Amb els RACE aconseguim tenir els 5’UTR i 3’-UTR APLICACIONS DE LA qPCR PCR a temps reals= generem un compost que era fluorescent Principal aplicació d’aquesta tècnica: veure diferencies en els nivells d’expressió gènica 2 situacions: - Control - Problema Fem PCR a temps real amb el Control i el Problema Punt intersecció corbes amb el Llindar = Ct Control Ct més petit (verd) -> vol dir que tenim més producte Ct més elevat-> el producte ha hagut d fer mes cicles teníem menys producte d’entrada.
POLIMORFISMES: canvi d’un nucleòtid -> normalment son silenciosos. Nomes es manifesten sobre determinada pressió selectiva.
Mutació: nombre petit d’individus -> normalment la mutació va associada a malalties greus, mort...
Per saber presencia d’un determinat Polimorfisme: Utilitzarem les sondes Taq man Podem dissenyar una sonda Taqman que nomes s’hibridi en un polimorfisme Necessitem diferents molècules fluorescents F Q A T G C Cada un donarà una fluorescència I tindrem: - T/T C/T C/C FALTA DIA 10/10 10 CTRIGUERO 17/10/16 TEMA 3 DNA  mRNA  Proteïna Els fàrmacs que tenim habitualment actuen a nivell de Proteïna Normalment actuen inhibint -> INHIBIDORS ENZIMÀTICS (Molècules orgàniques complexes) interaccionen amb el centre actiu dels enzims i els bloquegen Si les proteïnes NO són enzims: Tenim la opció d’utilitzar ANTICOSSOS -> Són medicaments biològics Inconvenient: - Hem de tenir la proteïna purificada - Necessitem un organisme que puguem sensibilitzar per fer anticossos contra la proteïna -> animals de laboratori -> Hem de purificar els anticossos Problema: és un procés llarg i molt costós Estratègies terapèutiques abans de la síntesi de proteïnes.
La síntesi de proteïnes és molt costos energèticament Si mitjançant alguna estratègia podem aturar el procés més amunt, estalviaríem tot aquest gest d’energia.
Ex: la proteïna que volem inhibir és una Quinasa (hi ha moltes)-> hi haurà molts efectes secundaris perquè no és prou específic. Molt difícilment torbarem un inhibidor molt específic En canvi si podem treballar a nivell de mRNA o inclús DNA serà més Específic Si inhibim la expressió a nivell de mRNA -> serà un mRNA exclusiu per una sola proteïna  podrem disminuir els nivells de la proteïna que ens interessi Avantatges: - Podem afectar la expressió de una única proteïna - Si estem treballant a nivell de mRNA serà Transitòri-> si les volem fer com a eina terapèutica s’hauria de fer molt temps Si en canvi treballem a nivell de DNA si que sera permanent INHIBICIÓ A NIVELL DE mRNA · OLIGONUCLEÒTIDS ANTISENTIT: Cadena de nucleòtids (tant de DNA com de RNA) Cadena senzilla Antisentit= unirse complementàriament a una molècula de mRNA mRNA 5’ ---------------------------------3’ <------Quan el ribosoma s’uneix el mRNA -> quan el ribosoma s’uneix la estructura doble, s’atura, no pot continuar.
11 CTRIGUERO Depenent d’on dissenyem el oligonucleòtid parem la acció del ribosoma La zona més interessant per fer aquest efecte seria al primer exó (ATG) -> Aixi ja no permetem que la proteïna es comensi a sintetitzar El mRNA ha d’haver arribat al citoplasma (els ribosomes estan el citoplasma)-> Quan arriba al citoplasma ha perdut els introns pel camí-> nomes tindrem els exons i els 5’ i 3’-UTR Si dissenyem el oligonucleòtid per una seqüència INTRÒNICA conseqüències -> No podríem eliminar els introns -> per tant al citosol tindríem un mRNA que encara conserva un dels introns (hem interferit en el procés d’aquest intró).
Quan això es traduís poden passar 2 coses: - Proteïna molt mes gran del normal (estem agafant seqüencia intronica com a seqüencia codificant) - El intró pot tenir un triplet que codifica per un senyal d’stop tindrem una proteïna molt més petita No es plegaran be i seran degradades.
A més en el moment que es formen aquestes estructures de doble cadena entre el mRNA i el oligonucleòtid antisentit es posen en marxa una RNAsaH que ho degrada ·El oligonucleòtids tindran càrrega negativa -> això volem que entri dins d’una cel protegida per membrana plasmàtica -> per entrar-los necessitaré un vehicle adient ·És una cadena senzilla (doble cadena és molt més estable) i les nucelasses s’ho poden degradar-> per corretgir això utilitzem nucleòtids modificats: substituïm els fosfors del enllaç fosfodièster per atoms de sofre -> més resistència front les nucleases.
·Com més llargs siguin més ens assegurem la especificitat que estem buscant (mínim 20) · RNA D’INTERFERÈNCIA (siRNA) Son mecanismes que les nostres cels ja utilitzen Procediment dels siRNAs: Tant si provenen de seqüència genòmiques nostres o exògena, es caracteritzen per ser de doble cadena.
Utilitzem un precursor llarg -> serà reconegut pe runa nucleasa -> el tallarà de manera específica i generarà una molècula petita RNA llarg -----(Dicer)-----> siRNA (petit) La siRNA busca un complex RISC Una de les cadenes és la GUIA (efecte silenciador) i l’altre cadena seria la PASSENGER La cadena passenger s’ha de separar de la cadena Guia Ens quedem amb RISC unit a la cadena GUIA ara el GUIA pot interaccionar amb el mRNA diana Reconeixement RNA GUIA i el nostre mRNA: per complementarietat de bases  desencadena la degradació del nostre missatger (es produeix un tall) -> ja no te opció de que es tradueixi.
 Aquí no li donem opció d’arribar al ribosoma i ser traduït Aquesta estratègia es de les més utilitzades però tenim inconveneint de que es un efecte transitori 12 CTRIGUERO Una manera de tenir efecte permanent: que el siRNA s’estigui fent tota l’estona Posem el siRNA en un plasmid -> la cel podrà fabricar contínuament el siRNA -> sempre tindrem inhibida la expressió d’un determinat missatger.
El plasmid ha d’arribar al nucli i s’ha d’incorporar al DNA -> Es pot inserir a qualsevol lloc i podríem fer malbé una altre cosa Per tant tot i que ens permetria tenir un efecte permanent, no controlem el lloc d’integració del plasmid Criteris per seleccionar un bon siRNA: - Longitud per tenir especificitat - Necessitarem vehicle que permeti entrada - BLAST : si nomes tens una seqüencia a la que es pugui unir -> tindràs especificitat. Si no sabras si es pot unir a altres gens.
Per saber si tenen el siRNA i és efectiu-> PCR a temps real (PCR quantitativa) Voldrem veure que els mRNA hagin disminuït  Nivells alts (nivells alts corresponen a expressions més baixes!!) Amb un Western-blod ho podríem analitzar a nivell de proteïna  veuríem si ha disminuït la proteïna.
Amb la tècnica que sigui l’efecte que volem és una disminució de la proteïna.
INCONVENIENTS DELS siRNAs: Son molècules de RNA i de doble cadena ->Activació de la resposta immune: perquè la cel pensarà que són virus de RNA RESPOSTA IMMUNE INNATA: les cels disposen d’una sèrie de detectors que detectaran infecció per virus.
Tindrem reacció inflamatòria.
Per utilitzar això com a teràpia, NO els podrem utilitzar de manera sistèmica-> la aplicació quedarà reduïda a acció local: Col·liris, inhaladors, cremes...
Avui en dia només existeix una formulació basada en siRNA-> a nivell ocular - > per infeccions oculars que tenen malalts de Sida.
19/10/16 ESTRATÈGIES PER LA EDICIÓ DEL GENOMA: Utilitzem NUCLEASA que actuarà de manera dirigida -> tallarà el DNA per les 2 cadenes Esprem que es posin en marxa els Mecanismes de reparació que te la cel: - NHEJ -> reparació associada a la pèrdua d’una part de la seqüència -> estem provocant una deleció - Si a les cels on hem fer el doble tall els hi afegim un DNA donador -> es posa en marxa el mecanisme de recombinació Homòloga > incertem o substituïm una seqüència en el lloc del doble tall AODNS i siRNAs  know-down Nucleases -> DSB  knock-out Permet substituir de manera local i força precisa una cadena per una altre -> Ho podríem utilitzar per corretgir una mutació 13 CTRIGUERO Estratègies: · ZINC FINGUER NUCLEASES (ZFNs) La capacitat NUCLEASA ve de: Tenim enzim de restricció FOR I amb domini catalític i domini d’unió del DNA Els dominis de dits de zinc són molt comuns en els factors de transcripció Fusionem el domini catalític de FOR I i el domini de dits de zinc -> tenim nucleasa que es capaç de interaccionar amb el DNA en determinades seqüencies.
Aquesta nucleasa de fusió podrà provocar un tall en les seqüències de DNA Funcionen en tàndem -> ha d’haveri 2 nucleases alhora Un domini de dits de zinc representa uns 30 aa -> podrem reconèixer 3 nucleòtids Hauriem d’ajuntar 6, 7, 8 -> com mes complexe sigui la estructura dels dits de zinc més especificitat tindrem · TALENS: Aquí utilitzem dominis de Talens : dominis que poden interaccionar en seqüencies especifiques del DNA Aquí necessitem entre 32-42 aa per reconèixer 1 sol nucleòtid (haurem d’afegir molta quantitat de seqüencies talen perquè sigui a un lloc específic ) També funcionen en tàndem (2 alhora per les 2 cadenes) La nucleasa es la mateixa en els dos casos Problema d’aquestes estratègies: - Disseny i construcció molt complexa - Especificitat difícil (no actuen sobre una única seqüencia) · CRISPR/Cas9 És un sistema que tenen els bacteris i que actua com a sistema immunitari Bactèria infectada per virus o per nosaltres quan introduïm plasmidi de DNA El bacteri fa trossos petits del DNA del virus o del plasmid i s’integren al genoma -> en les regions Locus ___ Aquestes petites seqüencies es poden transcriure i originen els RNAs corresponents -> crRNA La presencia d’aquest crRNA conjuntament amb els tracRNA formen un complex amb la NUCLEASA (Cas9) Tenim crRNA (de la transcripció de la seqüencia del virus o plasmidi) + tracRNA + Nucleasa Cas9 Quan hi ha una altre infecció per virus o plasmid ->la bactèria es capaç de tallar el DNA exogen (actua com una vacuna) Podem aprofitar aquest descobriment per utilitzar-lo en benefici nostre: Interessa: - Sistema capaç de reconèixer una molècula de DNA amb una sola molècula de RNA Necessitem RNA guia que reconeixi la seqüencia de DNA que volem degradar 14 CTRIGUERO Mitjançant el RNA guia i la NUCLEASA (Cas9) podem aconseguir tallar una seqüencia de DNA que nosaltres haguem triat com a diana Avantatges: - La especificitat del tall depèn del RNA guia - La nucleasa pot ser sempre la mateixa - L´únic que hem de dissenyar el RNA guia que dirigueixi la nucleasa a un lloc concret del DNA.
INCONVENIENTS: - Mala utilització del sistema Voldrem aquesta tecnologia per generar knock-outs Es podria utilitzar per modificar mutacions VEURE VIDEO PER L’EXAMEN !!!!!! (TED TALK) CAS ON HO PODRIEM UTILITZAR: DISTROFIA MUSCULAR DE DUCHENNE Malaltia nomes afecta homes Els casos mes greus estan associats en el marc de la lectura de la proteïna -> no tenim la proteïna distrofina S’ha vist que versions mes petites de la proteïna original que son funcionals -> simptomatologia mes lleu S’intenta passar dels casos mes greus als lleus (que els malalts siguin capaços de sintetitzar trossos mes petits de la proteïna) Per fer-ho: ·Oligonucleòtids antisentit (1a opció terapèutica que es va fer) Ens hem de saltar l’exó que esta malament Si fem disseny del oligonucleòtid antisentit que es salti l’exó 1 2* MUT 1 3 3 EXON SKIPPING Problema: s’han d’estar injectant l’oligonucleotid sempre Per veure si ha funcionat: Tecnica quantitativa -> PCR a partir de mRNA (Haure d’haver fet una reacció de transcripció) -> serà un RT-PCR També mirem nivells de proteïna (distrofina) 15 CTRIGUERO Altres mètodes: Canvis en el DNA-> Canvi permanent · CRIPSR/Cas9 Tallar per que es salti l’exó que tenen mutat Aquí estem veien el salt de l’exó a nivell de DNA -> PCR S’ha fet en ratolins -> podria ser una opció Problema: s’ha de fer en cels musculars Es poden fer teràpies ex-vivo amb cels que puguin originar cels musculars (cels mare) · també es vol fer per recombinació homologa 24/10/16 CULTIUS CEL·LULARS Normalment de extirpació quirúrgica que permetés obtenir fragment de teixit Següent pas: destruir organització del teixit -> tenir les cels independents Les cels es mantenen unides per interaccions proteïna-proteïna -> per trencar-ho i separar cèl·lules i que es mantinguin viables independentment: Proteases Altres estratègies: - Fetge: col·lagenasa Un cop amb les cèl·lules separades Necessitem medi de cultiu adient amb nutrients i un suport adient -> posem a incubador (37ºC) Podem obtenir - Cultiu primari: obtenint unes quantes divisions i després les cels es moriran (ex: fetge-> hepatòcits es dividiran unes quantes vegades, després s’aturarà i moriran) - A partir de biòpsia de teixits tumorals -> cels pràcticament immortals-> s’aniran dividint sempre  És el que s’utilitza a nivell de laboratori RISCS dels cultius cel·lulars derivats de tumors: - Poden créixer microorganismes (contaminacions) -> si son bacterians, podem utilitzar antibiòtics al medi de cultiu. Fongs és mes difícil S’han aconseguit tenir línies cel·lulars de tot tipus de tumors.
Línia cel·lular HeLa Es treballa molt amb aquesta línia cel·lular.
Com es treballa amb línies cel·lulars: Video PROBLEMA d’aquests experiments: S’assembla poc al model in-vivo perquè ja no tenim organisme sencer Si volem veure el comportament del gen -> treballar amb animals de laboratori (aquí si que tenim organisme sencer) -> problema: experiments cada vegada més restringits i limitar el patiment dels animals.
Avui en dia s’està desenvolupant el BODY ON A CHIP 16 CTRIGUERO En un chip es pot representar el circuit que fa un fàrmac: cel intestí, cels sanguínies, cels hepàtiques , etc..
Es pot veure fins i tot el metabolisme del fàrmac.
També podem fer servir impressores 3D (en comptes de tinta es posen cels) TRANSFECCIÓ DE DNA Introducció de DNA exogen al interior de cels - Transitòria: els efectes del gen el volem mesurar durant períodes de temps curt - Permanent o estable Depèn del que passi amb el transgen un cop entri a la cel (transitori, no integració al genoma; permanent: integració) Permanent-> necessitem selecció Podem utilitzar per seleccionar les cels que hagin integrat el genoma que ens interessi: - Antibiòtics per cels eucariotes - Proteïna fluorescent...
Problema: ser resistent, fluorescent, etc. formarà part del plasmid, però no son inerents al gen que ens interessa (son seqüencies aportades pel plasmid i assumim que si te una cosa també tindrà el gen) Perill: pot ser que el gen que ens interessa no s’estigui expressant en les cèl·lules, per exemple si s’integra a algun lloc del genoma que està silenciat. -> s’ha de fer després una comprovació per veure si realment s’està expressant el que ens interessa.
FACTORS QUE DETERMINEN EL METODE ÒPTIM DE TRANSFECCIÓ Tenim les cels que volem fer servir i el DNA que volem transfectar Hi ha tècniques mes elaborades que altres, més cares que altres, etc.
Depenent del tipus cel3lular podrem utilitzar una estratègia o altre MÈTODES DE TRANSFECCIÓ 3 grans tipus: - Químics: impliquen formar complex entre el DNA i un altre compost i això introduir-ho - Físics: dependran de instruments - Biològics: participen els virus · Mètodes QUIMICS DNA te càrrega negativa (inconvenient perquè ell mateix pugui introduir-se) Els reactius químics aprofiten la carrega negativa, per interaccionar amb ell i formar un determinat complex Resultat: complex més favorable a entrar al interior de les cèl·lules Els 3 reactius més emprats: - Lípids catiònics - Polímers catiònics - Fosfat càlcic Els 3 tenen carregues positives que neutralitzen les negatives del DNA Diferencia Lípids catiònics respecte els altres: tenen una part lipídica -> estem fent un complex de tipus LIPOSOMA que tindrà certa facilitat per entra a la cèl·lula -> afavoreix que es puguin fusionar amb la membrana plasmàtica. (fusió membrana lisosoma amb membrana plasmàtica) Els altres l’entrada es fa per endocitosi Son mètodes molt senzills: nomes ho has de barrejar, es forma el complex i barrejar amb les cels  Per simplicitat és el mètode d’elecció 17 CTRIGUERO · MÈTODES FÍSICS Implica la utilització d’algun tipus d’aparell, instrument...
- MAGNETOFECCIÓ Utilitzar la força magnètica per introduir el DNA a les cèl·lules Hem de crear partícules magnètiques que continguin o estiguin envoltades del nostre DNA Un cop tenim el DNA amb les partícules magnètiques -> s’afegeix al cultiu -> imant a sota de la placa -> aconseguim que les partícules magnètiques s’apropin i entrin a les cèl·lules per Endocitosi La entrada és fàcil, però la combinació amb els metalls és difícil i pot haver-hi toxicitat - ELECTROPORACIÓ: Utilitzem la força d’un camp elèctric -> descàrrega a les cèl·lules -> es produirà la entrada del DNA a les cels AVANTATGES: el DNA pot estar nu, no cal que l’acomplexem amb res.
Quan apliquem el camp elèctric, desestabilitzem les membranes de les cels, es formen petits porus que permeten la entrada del DNA Per cels eucariotes acostumem a treballar amb 350-400 V INCONVENIENT: Va associada a una mortalitat molt gran (s’ha de començar amb moltíssimes cels per després tenir algunes que s’hagin transfectat) (en procariotes són 2500V) Hem d’assegurar que no arrosseguem cap tipus de sal perquè provoquem curtcircuits Altre problema: Hi ha gran manipulació de les cèl·lules i hi ha gran risc de contaminació.
(No sempre el resultat final és l’esperat) 26/10/16 Dins de mètode físics també: CELL SQUEEZING No hi ha cap altre força que no sigui mecànica Es tracta de fer passar les cels per regions de diàmetre inferiors als d’una cèl·lula -> es deforma la cèl·lula -> quan surten estan perfectament però hem alterat l’estructura de la membrana i ho aprofitem per entrar DNA i altres compostos que ens puguin interessar Avantatges: No hi ha mortalitat cel·lular, l’únic que fem es apretar les cels Necessitem equipament adient HELIOS GENE GUN Pistola -> les bales porten el DNA Utilitzem partícules d’or o tungstè recobertes del DNA que interessa transfectar Aprofitem la velocitat d’impuls per penetrar al interior de les cèl·lules Cert dany del teixit Equipament no esta al abast de tothom, és bastant sofisticat.
S’utilitza molt sobretot en plantes.
18 CTRIGUERO MICROINJECCIÓ Es una tècnica que es fa cèl·lula a cel Es fa el buit amb una pipeta i amb una altre pipeta s’introdueix el DNA Desavantatge: - Necessites persona molt experimentada - S’ha de fer cèl·lula a cèl·lula Es una de les tècniques que s’utilitza per obtenir animals transgènics TRANSDUCCIÓ Utilitzant virus Primer els hi hem de treure les seqüencies de patogenicitat Necessitem conservar: - Tots els gens que els hi permetin sintetitzar la coberta - La transcriptasa inversa Aquesta manipulació ha de deixar intacta la capacitat infectiva i que la seqüencia es pugui integrar al genoma.
Problema: la mida del fragment que puguem inserir està limitada.
Depenent del tipus d’insert que interessi es tria un tipus de virus o altre Un altre inconvenient: el fet d’introduir RNA de doble cadena provoca que es posi en marxa un sistema de detecció -> Resposta immunitària innata MARCADORS DE SELECCIÓ O REPORTERS ANIMALS TRANGÈNICS: Animal que esta expressant un gen que prové d’una altre espècie Molts dels transgènics son de fet Knock-out Ex: ratolí knock out de la Leptina Portador de la hormona de creixement etc.
UTILITAT ANIMALS TRANSGÈNICS: - Provocar alteracions equivalents a patologies humanes - Evitar plagues (cereals transgènics) - Més producció - Etc - Llet -> fabriques de medicaments Por a aliments transgènics: gent creu en aparició de malalties, no s’entén bé...
Tècniques: - Microinjecció - Virus-> no tindrem totes les cèl·lules -> tindrem Quimera (unes si altres no) - Anar creuant durant moltes generacions per arribar a animal amb totes les cels modificades.
19 CTRIGUERO Ex: PORCS TRANGENICS-> menys contaminació Inconvenients: - Molts pocs animals que sobreviuen - La majora son estèrils - No sabem on s’integra el DNA 02/11/16 TEMA 5 – ANÀLISI DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA ESTRUCTURA SECUNDÀRIA Hibridació dels Àcids nucleics -> quan 2 cadenes senzilles de DNA es reconeixen com a complementaries Doble hèlix A-T (2 ponts d’H) o A-U C-G (3 ponts d0H) Perquè es pugui produir hibridació, primer s’ha de desnaturalitzar Quan una cadena de DNA es desnaturalitza -> s’està perdent estructura secundària: trencament dels ponts d’hidrogen Degradació: Es trenquen els enllaços fosfodièster -> es perd estructura secundaria i primària MÈTODES PER DESNATURALITZAR: - CALOR-> és reversible (al baixar la temperatura es torna a formar la doble hèlix) Però si un cop esta en cadena senzilla, la baixada de temperatura es fa bruscament, no es torna a formar. Cada cadena fa com un capdell (caldria escalfar de nou i baixar la temperatura poc a poc).
Tm= el DNA esta desnaturalitzat en un 50% Corbes de desnaturalització: % desnaturalitzat segons temperatura -> segueixen cinètica sigmoidea -> és un procés cooperatiu (el primer pont d’H costa més, després cada cop menys ) Corba blava, corba vermella La corba vermella és mes estable-> necessites més temperatura per desnaturalitzar el 50% (Tm és més alt) Efecte hipercròmic -> manera de seguir la desnaturalització del DNA Paràmetres que modifiquen la Tm: Contingut de G i C -> com més C i G més ponts d’H 20 CTRIGUERO Una SONDA ha de reconèixer una MOSTRA: utilitzarem una molècula de DNA o RNA que anomenarem Sonda per identificar una determinada seqüencia = Seqüencia Diana.
Si en una barreja heterogènia de fragments hi ha un determinat fragment X que ens interessa.
Relació entre la Sonda i el fragment que volem identificar-> que siguin complementaries La Sonda la hem de poder veure, per això la hem de MARCAR -> a la sonda, en el fragment de DNA o RNA li hem d’afegir una molècula amb propietats fq adequades per detectar-la.
1.
2.
3.
4.
Mostra (col·lecció heterogènia de fragments) i Sonda es desnaturalitzen Ho barregem Baixem temperatura -> per que es renaturalitzi Els fragments de la mostra renaturalitzaran amb si mateix, la sonda renaturalitzara amb si mateix i si la sonda troba una complementaria -> Formarà un HETERODÚPLEX (sonda i fragment de la mostra que ens interessa) 5. Detecció del marcatge Aquesta sonda ha de ser ESPECIFICA, SELECTIVA: ha d’hibridar amb el que volem i ja esta.
Aquest procés s’ha de fer en unes condicions on la sonda sigui especifica -> controlar la rigorositat. Hem de treballar en condicions tals en que la sonda es comporti amb el grau de especificitat que nosaltres volguem: - Alta rigosrositat - Baixa rigorositat Això ho podem decidir En condicions de Alta rogorositat: nomes es mantindran estables els dúplex entre sonda i dina del 100% Baixa rigorositat: que no sigui tan especifica -> els híbrids que siguin 100% idèntics es formarà, però també es formen híbrids que no siguin el 100% complementaris Això es pot controlar jugant amb la temperatura Baixa rigorositat: -25 ºC Tm Alta rigorositat: -10ºC Tm 21 CTRIGUERO Més paràmetres que poden influir: - Grau de complementarietat - Composició de bases (moltes G i C-> Tm mes alta) - Llargària de les cadenes: com mes llarga es una sonda, mes alta es la Tm - Temperatura - Força iònica = Concentració de NaCl (Na+) -> És més estable a 1 M de NaCl que a 0,1 M perquè neutralitza les carregues negatives dels fosfats (les cadenes tenen carregues negatives i tenen certa repulsió-> al afegir el Na+ les neutralitza i les forces de repulsió són menors -> més estable Com més alta és la concentració de sodi, mes estable es el dúplex.
Amb 0,1 M la hibridació estarà amb condicions mes estrictes.
Contra menys conc de sal posi, els dúplex son menys estables -> i només s’aguantaran els que estiguin 100% aparellats.
- Agents desnaturalitzants: formamida, urea, formaldehid-> Tenen Oxigen i Nitrogen -> els hi agrada formar ponts d’H -> són desnaturalitzants perquè formen ponts d’H amb les bases nitrogenades -> augmentant al concentració d’aquests gens en el moment de la hibridació, puc regular que la hibridació sigui estricte, molt estricte o poc.
22 CTRIGUERO Físicament això es fa: 1.
Obtenim el DNA 2. El fem a trossos amb enzims de restricció (mides diferents9 3. Aquesta barreja que seria la mostra amb la nostre diana, ho separem amb Electroforesi (gel d’agarosa) -> se separen per mida 4. DESNATURALITZACIÓ 5. Es traspassa els fragments a un suport manipulable-> de un gel a un filtre de nitrogel·lulosa o nailon-> es fa per capil·laritat 6. Fixació-> unir-los de manera covalent a la membrana a. Per temperatura b. Si es nailon es fa per radiació UV 7. Quan ja tinc el filtre, és una replica exacte del gel -> es posa en contacte amb una sonda (complementaria a algun dels fragments) (La sonda ha d’estar marcada) 8. La sonda hibrida en alguns dels fragments (vaig fent rentats abundants per treure tot allo que no ha hibridat o el que no ha hibridat específicament) 9. Revelar la presencia de la sonda -> la meva sonda ha reconegut específicament 2 fragments 10. Conclusió: efectivament els fragments que vull estan en el DNA de partida.
SONDES: Per veure-la s’ha de marcar d’alguna manera: Afegir molècula radioactiva, enzim, fluorescència, etc.
Marcar una sonda= afegir un Marcadors - MARCATGE DIRECTE: marcador directament enganxat a la sonda - A la sonda li enganxo una molècula que no puc veure i el marcador l’afegeixo amb una molècula que identifica la altre molècula= MARCATGE INDIRECTE (el marcador esta amb un molècula ADAPTADORA) El que és IMPORTANT: - S’ha d’anar en compte amb el que s’afegeix perquè no interfereixi en el procés de hibridació-> els marcadors han de ser ben tolerats - El marcatge ha de ser de tal manera que quan faig la hibridació, en les condicions en els que es produeix la hibridació, el marcatge no s’alteri (no es destrueixi, no es desenganxi...) Una altre forma de classificar les sondes: No amb que es marquen sinó COM es marquen: - MARCATGE D’EXTREMS O TERMINAL (NO UNIFORME) o Incorporar un fosfat als extrems 5’ : ho fa la T4 Polinucleòtid quinasa Si aquest ATP que fem servir és radioactiu, el fosfat que incorporarem serà radioactiu (es fa servir poc perquè és perillós) Per aquest tipus de marcatge utilitzem γ32P-ATP o Filling in d’extrems cohesius amb Klenow: Omplir extrems 5’ protuberants (el que incorpora la marca és a 3’, amb DNA polimerasa de Klenow (Te activitat Polimerasa 5’-3’ i Exonucleasa 3’-5’ =activitat correctora) S’afegeix Klenow i els 4 dNTPs amb 1 d’ells marcats  incorpora les bases complementaries de la protuberància (fer-lo rohm) Si aquí intentem fosforilar, haurem de fer-ho amb α32P-ATP 23 CTRIGUERO - MARCATGE INTERN (UNIFORME) ESQUEMA DIAPO o Marcatge per Nick translation: (aquest mètode pràcticament no s’utilitza) Es diu així perquè el primer pas és Agafar la sonda de DNA i generar talls al atzar en les dos cadenes de la sonda Per fer-ho: S’incuba amb una DNAsa-> Talla el DNA, trenquen enllaços fosfodièster. Ho fem en condicions subòptimes (petites quantitats de DNAsa i durant un temps curt (talla per pocs llocs) -> Ens queda una sonda amb petits Niks (llocs on s’ha tallat lenllaç *Recordar que fosfodièster.
La finalitat d’aquest tractament és que en els Niks són extrems hidroxils 3’ -> són encebadors DNA pol I te que utilitzarà una DNA pol I* -> aprofita els extrems 3’ i començarà a sintetitzar DNA de nou.
activitat: -Pol 5’-3’ La DNA pol I va substituint i degradant (DIAPO)-> Quan va incorporant dNTPs algun d’ells -Exo 5’-3’ l’haurem marcat -Exo 3’-5’ La DNA pol I canvia DNA vell per DNA nou.
Es produeix a partir de tots els Niks que havíem generat al principi.
Tenim moltes sondes-> els Niks es fan en diferents llocs en les diferents molècules.
Al final tenim la sonda marcada-> però la tenim a trossos: Tenim molts trossos diferents que en conjunt em representen la totalitat de la sonda.
Es marcarà més intensament l’uniforme (en el marcatge d’extrems nomes es una marca a cada extrem, aquí tenim moltes marques.
o Mètode que s’utilitza ara RANDOM PRIMING (“Ensebat al atzar” Parteix d’una sonda de doble cadena de DNA Aquí el 1r pas és Desnaturalitzar-la. -> se separen les 2 cadenes -> a continuació s’hi afegeix barreja de Hexonucleòtids (=oligos de 6 bases que representen totes les possibles combinacions de 6 bases) Es baixa temperatura perquè es produiexi la hibridació dels oligos amb la sonda -> al atzar els oligos trobaran regions complementaries.
A continuació: utilitzant la polimerasa de KLENOW i els dNTPs es fa la cadena complementària (tenim algun dels dNTPs marcats) Tenim milers de copies de la molècula de sonda -> la hibridació es produirà al atzar.
És un marcatge uniforme i intern.
Al final tenim la sonda a Trossos o Per marcar sonda de RNA: !!<Hem de preparar una RIBOSONDA Per fabricar-la: reproduint el procés de la transcripció amb un afegit (in vitro) en tub d’assaig transcrivim el fragment de DNA (transcripció in-vitro).
*Transcripció in vivo: fa falta: RNA pol, DNA motlle i Promotor In vitro necessitem el mateix i ho generem artificialment.
El gen que volem transcriure i un fragment de DNA -> el Clonem en un vector una mica especialitzat: Ha de tenir al costat del multicloning side un Promotor.
El promotor acostuma a ser el T7 : es un promotor fort = molt actiu= transcriu molt -> la transcripció s’inicia amb molta freqüència-> moltes copies de DNA.
24 CTRIGUERO Un cop tenim això, primer hem de tallar amb un enzim de restricció a 3’ de l seqüencia que hem clonat  Linealitzem el vector.
Amb això ens assegurem que tenim tot i que no torna a començar *Wester blot: per detectar proteïnes .
Utilitzm Anticossos marcats Southern blot: detector DNA Ara ja ho tenim tot a punt -> afegim la RNA pol i comença la transcripció PRECAUCIÓ: com és una RIBOSONDA -> Has de mirar que sigui la complementaria dels RNAs (si és idèntica No hibridaran). Ens hem d’assegurar que al fer la RIBOSONDA és la contraria a la del RNA que s’està sintetitzant.
(has de fer una copia de la cadena de sota) Perquè la RIBOSONDA fons de la cadena complementaria: es clona amb orientació contraria Northern blot: RNA RNA es de cadena senzilla.
Molècules que es fan sevir com INDICADORES: Bàsicament 2: - DIGOXIGENINA - BIOTINA Aquest 2 indicadors s’uneixen als nucleòtids que s’incorporaran a les sondes -> quan el nucleòtid s’incorpora a la sonda s’incorpora amb tot.
S’ha d’anar en compte que els indicadors No incapacitin  S’ha de posar un braç espaiador = permet establir l’enllaç i la deixa allunyada de la sona i no impedeix que la sona hibridi amb la seva diana.
Per Revelar la presencia del Indicador: - Si la sonda la hem marcat amb DIGOXIGENINA -> es detecta amb ANTICOSSOS ANTIDIGO...
- Si s’ha marcat amb BIOTINA: AVINIDINA o ESTREPTAVIDINA Aquestes molècules porten un Marcador: - Molècula fluorescent -> detecció per fluorimetria - Enzims-> quan li donem el substrat apropiat o pot agafar el substrat i el producte i que precipiti d’un color determinat -> detecció colorimètrica o O bé un substrat que quan el passa a producte emet llum visible -> Quimioluminiscència Es fan servir: Fosfatasa alcalina (AP) o Peroxidasa (HRP) 25 CTRIGUERO SEGONA PART TEMA 5 – ANALISI DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA ANALISI MASSIVA DE LA EXPRESSIÓ GÈNICA  TRANSCIRPTOMICA= estudi del transcriptoma = estudi de la expressió de tots els gens que s’estan expressant.
Al principi: Northen blot -> Uns quants gens Es va augmentar l’escala de treball-> noves tècniques: Dot blot, Slot blot Es va incrementar la eficiència de fer motles mostres per PCR quantitativa De uns pocs gens a Desenes de gens A partir d’aquí s’han desenvolupat mes tècniques per mes gens: EST, SAGE, ARRAYS, NEG(aproximacions de seqüenciació massiva) Objectiu: aconseguir amb un únic experiment, analitzar com s’estan expressant els gens del genoma complet (milers de gens) 09/11 COMPARATIVES Que ens pot interessa comparar en termes d’expressió gènica: - Expressió gènica en 2 teixits - Dintre d’un mateix teixit, El teixit en estat normal o tumoral - Mateix teixit, però en un organisme no modificat, o en un mutant.
- Diferents estadis de desenvolupament - Canvis d’expressió en detecció espaial.
Recordatori: RNA dot blot: Dot blot = la mostra es diposita en forma de punts, gotes (“dots”) Es un Experiment tipus Northern bloth Analitzar expressió d’una sèrie de gens relacionats amb la hipertrofia en ratolins - Ratolins no transgènics - Mostres de 6 línies ratolins transgènic que expressen nivells elevats d’un gen particular.
Aïllar RNA RNA es diposita en forma de gotes sobre suport sòlid -> les membranes s’hibriden amb sondes corresponents a tos els gens de la Diapo ANF, BDP...) Es renta i es detecta S’analitzen 6 gens problema i 6 gens control en 8 mostres Es veu que alguns incrementen, altres no.
LA imatge s’escaneja, es quantifica la intensitat del senyal-> gràfica Hi ha 6 gens problema i 1 control (GAPDH= es un gen que s’espera que l’expressió No canviï pel tractament que estem fent) Funció hibridació gen control: patró que et permet estar segur de que funciona i es un punt de referència que permet normalitzar els altres senyals. Es possible que hagi posat quantitats diferents en les columnes, es podrà veure.
Normalitzarem l’expressió dels gens problema tenint en compte el valor del patró que hauria de ser constant.
26 CTRIGUERO ARRAYS Array o Chips = col·lecció sondes. Que poden ser moltes (milions) Les sondes estan unides permanentment a un suport sòlid (platform) posades ordenades, (fatures or sptos).
Les sondes s’hibriden amb una mostra que es el que volem analitzar.
Quan s’utilitza un Array: 1. Dissenyar i fixar les sondes al suport 2. Preparar les mostres 3. Hibridar-les 4. Registrar el resultat 5. Analitzar les dades.
2 grans tipus de ARRAYS: - Impresos (Printed or Spotted) - Es Fabriquen literalment in-situ PRINTED OR SPOTTES ARRAYS SONDAS Es pot fer servir: - Fragments llargs de cDNA: o Microarrays->> membranes o Microarrays: suport rígid->portaobjectes vidre - Oligonuleotids (fragments curts)-> entre 25 i 80 mer=nucleòtids-> portaobjectes vidre MOSTRA: Procés de hibridació competitiva: partim de 2 mostres (1 control i 1 problema) Aïllem RNA de mostra control i RNA de mostra problema -> Fem cDNA (aquest procés s’aprofita per MARCAR amb tag fluorescent( Cyanine) - Cy3 -> verd - Cy5-> vermell Amb els altres marcàvem la SONDA, aquí marquem la MOSTRA!! Amb els altres teníem fixe les MOSTRES, aquí tenim fixe les SONDES!! DIAPO Workflow summary of printed microarrays Un cop ho tenim hibridat i hem rentat Es mira amb làser verd i després amb vermell-> es sobreposen les 2 imatges Si en una determinada posició s’expressa 1 i No l’altre -> Verd Si tenim situació contraria -> Vermell Si el gen expressa al mateix nivell la 1 i la 2 -> Groc Tindrem una gamma de verd fins a gro i groc fins a vermell amb la intensitat Després es mesuren les intensitat de florescència vermella i verda-> unitats d’absorbància-> es quantifica -> es converteixen en escala de color quantitativa -> es trasllada a matriu -> es construeix un Heat map = sabem quin s’està sobreexpressant més, etc.
27 CTRIGUERO IN SITU SYNTHESIZED ARRAYS Les sondes son oligonucleòtids de 25 nucleòtids (si s’allarguen mes no es tan eficient) Es fabriquen directament sobre la superfície de quars Més d’un milió de locus-> en cada un d’aquests hi ha 10 milions de copies del mateix oligonucleòtid (idèntiques) En aquest cas No es hibridació competitiva Aquí 1 ARRAY, 1 MOSTRA Per cada experiment hem d’utilizar mínim 2 ARRAYS Es marca les mostres amb fluorescència Hi ha mes sonda que mostra, si la mostra s’expressa molt, s’uniran a més sondes.
Particularitat: En aquest cas s’utilitza tècnica de Fotolitografia: el suport sòlid inicialment esta tractat químicament amb determinats grups químics però bloquejats.
Hi ha plantilles que nomes tenen unes finestretes per on pot passar la llum -> es posa a sobre i s’il·lumina > la llum desprotegeix uns llocs que passen a ser reactius.
Després s’afegeixen deoxi-T -> nomes pot anar als llocs desprotegits.
S’incorporarà en els llocs on ha de ser una T Després posar una plantilla diferent i s’afegeix deoxi-C I així fins a tenir la primera Base amb T, C, A i G -> i així el oligo va creixent en un ordre determinat.
(per això es diu que es fan in-situ) Marcatge de les sondes: Hi ha diversos protocols 1 d’ells: A partir de RNA -> cDNA -> es transcriu in vitro i s’aprofita això per incorporar Biotina a les molècules de cRNA que s’estan fabricant Hi ha una etapa de fragmentació* -> es passa a la hibridació i continuem.
*En funció de la mida de DNA es possible que afecti la cinètica d’hibridació Per eliminar aquest factor distorsionador, es fragmenta de manera que tots els RNA es quedin mes o menys de la mateixa mida.
Tots els processos s’han de fer en condicions controlades perquè respectin el màxim possible les proporcions de RNA que hi havia a la mostra original.
COMPRACIÓ ENTRE ELS 2 ARRAYS Spotr: Avantatges: - Econòmics - Tens flexibilitat en el disseny experimental: puc triar quines sondes poso - Elevada intensitat de senyal (seqüencies llargues) Desavantatges: ...
En els altres com els compres fets son mes cars i ja ve fet, compres el que ja esta fet no tens tanta flexibilitat 28 CTRIGUERO 14/11/16 Els resultats tipus Spotted tenim resultats relatius Ens al Affymetrix tenim valor absolut-> comparar amb el valor absolut obtingut en un altre array.
En els Spotted en quina proporció s’han de barrejar les mostres control i problema abans de fer la hibridació? La mateixa quantitat de cada una (50-50) -> perquè els resultat sigui directament comparatiu.
Hit map Hierarchical clustering: forma de organitzar les dades-> per ràpidament tenir idea de comportaments semblants.
A la esquerra tenim gens que s’analitzen Abaix: condicions experimentals El Herachical clusterinc-> veiem quins gens en les diferents condicions es comporten mes o menys igual i en quins experiments reaccionen de forma semblant.
Hi ha dendrogrames que reforcen la idea.
A la dreta-> els primers sis cens formen una subclasse clarament diferent de tota la resta Adalt: experiment-> els de l’esquerra-> resposta mes o menys comuna i a la dreta el mateix La longitud de les barres es directament proporciona a la similitud.
Verd acostuma a ser repressió gènica Vermell: sobreexpressió.
També es fa servir blau-groc-negre Affymetrix El que determina que una sonda sigui BONA: Ha de ser específic : ha d’hibridar només amb la DIANA (detecta el que ha de detectar i no el que no ha de detectar) Quan fem un array no es posa 1 sola sonda.
Si es posa 1 sola sonda no saps si serà bona o no.
Per evitar-ho: No es posa 1 sola sonda, sinó moltes sondes que son complementaries a diferents regons del gen! Ex: 14 oligos diferents que cobreixen diferents llocs del gen.
En cada quadradet hi ha 1 sonda (milions de còpies de la mateixa sonda) A més de les 14 sondes que son perfectament complementaries (Perfect match), també es posa la mateixa sonda amb un mismatch (canvi en una posició). El mismatch es fa al mig del híbrid (el 100% complementari s’aguanta i l’altre no Amb això s’aconseguirà saber quines sondes funcionen i quines no - Si el quadrat es alt: fluorescència alta-> Hibrida - Quadrat negre: com més negre, menys hibridació hi ha Es compara el resultat El millor es el que una blanc i una negre: normal es 100%, i si es canvia 1 nucleòtid no s’hibrida. (marcat en verd a la diapo) (ESPECIFICITAT!!) Això s’analitza per CADA gen Es descarten les sondes grises (marcat en vermell a la diapo) DE les que queden bones -> es calcula valor mig de fluorescència 29 CTRIGUERO ALGUNES APLICACIONS DELS ARRAYS: - Identificar nous gens que inicialment no sabíem que podien estar implicats en un procés> al fer anàlisi massiva descobrim gens que alteren la seva expressió-> podem estar descobrint nous candidats en patologies o desenvolupament. (noves dianes) - En el cas de malalties, ens permet descobrir “culpables per associació”.
- En alguns casos, s’utilitzen per acabar de confirmar un diagnòstic diferencial. (analitzant perfil i buscant petites diferencies) Ex: Alzheimer vs demència - Farmacogenòmica= Què li fa el fàrmac en el genoma (com canvia el patró d’expressió gènica quan exposem un genoma a la acció d’un fàrmac-> pot ser útil per permetre descobrir nous gens que no coneixíem i que ens poden ajudar a entendre el mecanisme del fàrmac. També si es tòxic, com es metabolitza etc.
Com mes coneguem del fàrmac sobre el genoma més dianes terapèutiques tindrem - Intent d’identificar biomarcadors: veure si era possible, simplement a partir de definir perfils d’expressió gènica globals, predir per exemple la evolució d’un tumor. (predir el pronòstic) S’ha arribat a bons resultats però encara hi ha error important.
Molts d’aquest estudis es poden veure a base de dades publiques EXEMPLES: · Analitzar el perfil d’expressió de 61 gens de tota una sèrie de mostres biològiques de dones que patien càncer de mama Es va establir correlació entre signatures d’expressió gènica (5 “Clusters”) i tassa de supervivència, pronòstic dels tumors.
- Si una persona te la 1a signatura-> el pronòstic no es bo (cap cas de supervivència - Si te signatura 5: pronòstic molt bo (90%) - Pel mig es no se sap ben be Per si sol no es pot fer servir per saber quin serà el pronòstic.
· Es pot pronosticar el risc de patir metàstasi al cap de 5 anys? Es van establir 2 grans grups (2 signatures) Hi ha també bona associació però no al 100% - Una de les signatures gairebé sense metàstasi (hi ha algunes excepcions) - Una altre amb metàstasis No es definitiva en un 100% APLICACIONS: · Anàlisi del genoma (canvis en el DNA) - Anàlisi de polimorfismes-> concretament de 1 nucleòtid (SNPs) Perquè pugui ser considerat un SNP ha d’estar almenys en un 1 % de la població (amb una certa freqüència) Els SNPs són molt importants-> principal variació dels genomes dels humans. Son molt freqüents.
(Hi ha un SNP cada 300 pb) Afecta al probabilitat de patir malalties Resposta a un determinat fàrmac sigui diferent depenent de la persona FARMACOGENETICA: Que li fa el Genoma al fàrmac (com la nostre individualitat genètica condiciona la resposta al fàrmac) 30 CTRIGUERO MIRAR VIDEOS -> estratègies per utilitzar arreys per identificar SNPs !! Hi ha 3 formes (2 videos i un figura diapo) - Detectar patògens: Catàleg de gens de col·lecció de patògens que poden causar la malaltia. Sondes especifiques i que ens permetin mirar variants, serotips, etc.
- Descobriment d’exons En general Arrays, els de oligos, es diu que son Arrays de Tiling (Tile=rajola) En uns casos sondes son oligonucleòtids complementaris, i no deixen cap espai entre mig -> es reprodueix la seqüencia completa -> Seqüència es solapa -> Array de seqüència complet Hi ha un altres que son de quasi genoma complet, les sondes no cobreixen la totalitat, hi ha gaps Descobriments d’exons: Exemple: S’utilitza array de tiling de sonda de 60 nucleòtids, que solapen 10 nucleòtids.
Aquests sondes cobreixen la totalitat de seqüència de un determinat gen de 10 kb del cromosoma 22 humà Objectiu estudi: determinar si els exons que estaven predits que començaven a un lloc i acaben a un altre, era correcta.
S’agafa DNA genòmic, es marca i s’hibrida Resultat: Pics-> donen senyal Aquest Array s’hibrida amb cDNA ( NOMÉS Exons) Analitzat amb mes detall-> les sondes que cobrien les zones predites com exó, efectivament hibridaven Però en un altre cas, van donar senyal mes sondes del predit-> l’exó nº 3 comença 102bd mes cap a 5’ 16/11/16 Una ultima aplicació dels Arrays de oligos: Immunoprecipitació de cromatina (ChIP-chip) Serveix per: identificar les seqüencies de nucleòtids amb que interaccionen proteïnes Cromatina= Conjunt de DNA i totes les proteïnes que interaccionen amb el DNA (histones son les majoritàries, però no son les úniques) Com es fa: Cal tenir present que la unió que es dinàmica la hem de fixar-> quan la proteïna s’enganxa, fem que no es pugui desenganxar Cross-linked (amb formaldehid) Un cop tenim la cromatina estabilitzada, ho tallem en trossos -> Sheared DNA (unes 500 bp) Després: seleccionar: necessitem un Ac el mes específic possible contra la proteïna que volem estudiar -> fem una Immunoprecipitació -> recuperem precipitat per centrifugació En el immunoprecipitat tindrem el DNA, amb la prot i l’anticòs Ara el que es fa es revertir el Cross-linking inicial (separar les proteïnes i l’Ac del àcid nucleic) -> Nomes volem el fragment de DNA -> els marquem.
31 CTRIGUERO Aquesta col·lecció de fragments que hem immunoprecipitem, els hibridem en un chip amb oligos de gens del organisme que estiguem estudiant.
Aquests fragments s’hibridaran alguns llocs que sabrem.
Una de les cal·lus del èxit es que l’Ac sigui específic.
Però sempre hi haurà fragments que precipiten perquè si, inclús sense Ac Per això es fa un procés igual però sense afegir Ac (CONTROL) -> Els fragments que aquí han precipitat es marquen amb un altre color -> es fa hibridació competitiva Una variant: Per la proteïna que estem estudiant no tenim Ac o no es específic L’organisme amb el que volem treballar, el manipulem perquè estigui expressant la proteïna que ens interessa amb una seqüencia (un Tag de aa) que si que hi ha Ac específics contra aquesta etiqueta que hem posat.
Arribem al mateix.
També pot passar que ens interessi quedar-me amb les proteïnes que estan lligades al DNA - Em quedo amb el DNA per fer el chip - Em quedo les proteïnes que estaven enganxades al DNA, perquè a mes a mes de la proteïna que jo ja se que esta enganxada al DNA, es possible que hi hagi altres proteïnes que també han baixat perquè estan formant complex però jo no se quines son.
ARRAYS DE PROTEÏNA Superfície sòlida, en el qual s’hi enganxen proteïnes (o be senceres o be dominis proteics) amb alta densitat (contra + millor) i posades de forma ordenada Es bàsicament el mateix que els Arrays de DNA però en comptes de DNA son proteïnes.
Aquests Arrays són una mica mes recents que els altres.
Estan encara poc introduïts en l’àmbit de la clínica perquè son cars.
Són més complicats: - Son mes fràgils - Més inestables - Es imprescindible que quan la enganxes al suport, conservi la funció i mantingui la estructura 3D i es molt complicat - A més cada proteïna es diferent (hi ha molt estables poc, modificades, etc.) Tot i així es fan servir, sobretot en investigació.
DIAPO 1955 ....
1980: incrementar la sensibilitat de la detecció (fonamental per poder reduir la quantitat amb la que es treballa 1990: Que permeti detectar diverses proteïnes alhora: els sistemes s’han de monitoritzar i han de ser de tipus múltiplex 2000: 1r array de proteïnes comercial.
Un exemple d’array comercialitzat: HuProt -> te unes 17.000 prot humanes 32 CTRIGUERO Hi ha 3 grans tipus d’Arrays de proteïnes - Analítics - Funcionals - Fase reversa · ANALITICS (A) El que hi ha immobilitzat en el suport sòlid són Anticossos (Ac capture) “S’hibrida” amb l’analit= mostra problema = barreja de proteïnes-> per exemple un sèrum (proteïnes del sèrum d’una persona) Amb quins Ac s’enganxarà? Detecció-> els Ag que s’han unit es detecten amb un 2n anticòs contra la proteïna que s’ha enganxat (Ac reported)-> El 2n Ac ha d’estar dirigit a un altre zona del Ag El 2n anticòs pot estar marcat ell o bé es pot utilitzar un 3 Ac marcat.
· FUNCIONALS (B) És el contrari: El que esta immobilitzat son proteïnes o dominis proteics (els Ag) L’Analit aquí poden ser moltes coses: - Ac -< les prot quins Ac reconeixen - Molècules petites: o Lípids o Tòxics o Fàrmacs-> un determinat fàrmac amb quines proteïnes interacciona.
- Proteïnes: interacció port-prot - Àcid nucleic Per detectar-ho: normalment amb un 2n anticòs contra el que estem estudiant. I aquest 2n anticòs esta marcat fluorescent Una de les aplicacions on tenen mes sortida aquesta Arrays funcionals: Perfilat immunològic. -> Per identificar els perfils d’Ac existents en múltiples malalties autoimmunes.
Una aplicació que si que ha arribat a clínica: Test d’al·lèrgies (son cars) EXEMPLES d’ARRAYS FUNCIONALS: -A: utilització per detectar proteïnes que s’acetilin S’incuba amb acetilCoa [14C] + Acetilasa-> totes les prot que s’hagin Acetilat, tindran una marca radioactiva.
-B: identificar prot que es fosforilen -> identificar quinases Proteïnes al suport Incubem amb gamma-32P- [ATP] + Quinasa X Es fosforilen determinades proteïnes-> estaran marcades -> les que estan marcades seran substrat de la Quinasa X Ho faig amb una altre quinasa, etc -C: Per determinar Ubiquitinació -D: Proteïnes que es SUMOilen -E: prot que reaccionen amb pèptids glucosilats 33 CTRIGUERO · ARRAY DE FASE REVERSA: El que s’immobilitza en cada punt és un extracte proteic d’una determinada mostra biològica que ens interessa Analit són extractes 21/11/16 TEMA 6 – TÈCNIQUES DE SEQÜENCIACIÓ MASSIVA DE DNA Perquè seqüenciar? Perquè som el que el genoma decideix que ha de ser Ningú te el mateix genoma-> petites diferencies-> condiciona com som Combinació de la genètica amb els factors ambientals es el que decideix com som, com actuem quan estem sans i enfront a les malalties.
Si coneixem el genoma, tenim molta informació valuosa per arribar a entendre tot això a nivell individual.
Moments clau historia: 1977: es seqüencia el 1r genoma d’un organisme (d’un bacteriòfag)-> 5386 nt (genoma humà te 3·109 bp) Mètode dels dideoxi 1990s: Es posa un sistema de detecció de fluorescents (ja no radiació) Es passa a separar per electroforesi capil·lar Tot això es un avens molt important 1998: Utilitzant electroforesi capil·lar i fluorescència, s’aconsegueix automatitzar Es podien seqüenciar simultàniament 96 Seqüenciació massiva 2001: utilitzant aquests aparells i mètodes es publica el 1r esborrany del genoma humà.
2004: es publica la seqüencia definitiva (pràcticament 15 anys per obtenir la seqüencia del genoma humà) S’havia de reduir temps, esforços i costos Desenvolupament de noves estratègies de seqüenciació massiva 2005: primera plataforma de seqüenciació massiva: Seqüenciadors de 2a generació. (molt mes massiu que abans) Projecte de seqüenciació del genoma humà: Va començar amb consorci públic. -> Human Genome Project (HGP) Les dades que s’obtenen són públiques Simultàniament empresa privada (Craig Ventes) -> La info que s’obté pot no estar publica.
Carrera per veure qui acabava primer Els WGP (provada) -> mes diners, van fer una altre estratègia mes complicada Al final es van posar d’acord i van publicar.
34 CTRIGUERO El 1r genoma és d’una barreja de persones Estratègies diferents que van fer: · PUBLIC: Top-down o Hierarchical shotgun Van agafar el DNA nuclear humà de les diferents mostres, el van fragmentar en grans trossos (150kb) -> els van clonar utilitzar com a vectors cromosomes artificials bacterians (BACs) Amb aquesta genoteca de BACs (mes de 20.000 diferents) els van ordenar -> se sabia a quin cromosoma pertanyien, posició relativa...
De cada un dels BACs van trencar el DNA del incert en fragments mes patits -> clonar amb fagmidis i Sense ordenar-los es van començar a seqüenciar: Paried-end: per cada seqüencia es feia una lectura d’un tros d’un extrem i d’un tors d’un altre extrem ·PRIVATS: Shotgun (bottom-up) Van agafar directament el genoma -> trossos directament Petits i van començar a seqüenciar a lo bestia (hi havia fragments que es seqüenciaven mes, altres no..) Agafant totes les seqüencies al atzar les encaixen (puzle) i tenir el genoma En els 2-> hi ha un moment que s’han de posar en ordre- > S’han d’ensablar: Per fer-ho: Ensamblatge de Contings: Les diferents lectures de seqüencia-> es busca quines parts de seqüencia comparteixen -> es va allargant-> tindrem seqüencia continua Al final tindrem 1 Conting Conting= 1 seqüència resultat de la unió de tota una seria de trossets de seqüencia mes curts, que entre uns i altres tenen regions comunes.
Recordatori: Mètode clàssic de Seqüenciació: METODE DE SANGER 4 etapes: 1- El fragment de DNA l’hem de clonar en un vector (normalment en plasmidi) 2- Fer in vitro la reacció de seqüencia-> Dona tota una població de fragments de mida diferent.
Per clonar necessitem: DNA pol + dNTPs + Primer + dideoxids (ddNTPs) ddNTPs= A la posició 2’ i 3’ hi ha un OH Podem dissenyar primers comuns a la seqüencia que franqueja l’incert Els ddNTPs es posen en proporció significativament més petita que de dNTPs (perquè quan s’incorpora un ddNTP es para la reacció.
A partir d’un mateix encebador i un mateix motlle-> tindre diferent llargada de la seqüencia -> genero col·lecció de fragments que es van aturant en les diferents posicions de la seqüencia que jo estic llegint.
Els ddNTPS són els que es marquen Un cop hem fet la reacció de seqüencia tenim fragments de mida diferent 3- Fraccionament dels fragments: Electroforesi capil·lar per separar els fragments 4- Detectar per florescència els fragments.
35 CTRIGUERO DIAPO ·Mètode original : radioactivitat i electroforesi de poliacrilamida S’arribava a una lectura de seqüencia de només 100 nt Lectura de seqüència =READ · Detecció fluorescents 2 canvis: els dideoxids estaven marcats cada un amb fluorescència diferent La seqüencia es pot fer simultàniament en un únic tub La separació era per electroforesi capil·lar-< molta mes resolució.
I hi ha detector que ho registra A mesura que van passant es van llegint literalment La diferencia entre els fragment anterior o següent serà de 1 nt Amb això es podia arribar a tenir Lectura de seqüencia de 1000 nt I com es pot fer amb 96 seqüencies. Podem tenir un total de 96 kb LINKS al Campus Actualment es continua seqüenciant per Sanger Avantatge - Taxa d’error baixisima (pot haver-hi 1 error de base per cada 10.000 o 100.000 llegides) - Les longituds es la mes llarga que s’obté (1000 nucleòtids) Problema: - Es difícil d’automatitzar al 100% o Difícil de fer mes de 96 seqüencies en paral·lel 23/11/16 Perquè fer New generation Sequenci (NGS)? Per reduir esforç, temps i cost Poder seqüenciar un genoma en qüestions de hores i a un cost molt barat (menys de 1000€) Això s’ha aconseguit GOLD: base de dades de tots els genomes de qualsevol organisme que es van seqüenciant.
Al llarg dels últims 20 anys, la quantitat de projectes ha augmentat moltíssim (columnes blaves-> genoma complert; columnes vermelles: esborranys permanents= son seqüencies de genomes que tenen regions que encara no s’han seqüenciat o no estan ben seqüenciades, però s’ha decidit que no es modificaran mes.) Com surten aquests noves tecnologies? Combinant 3 coses: - Tècniques de enginyeria genètica bàsiques (conegudes de de fa molt temps) - Nanotecnologia - Desenvolupament de mètodes de detecció i quantificació de imatges altament sensibles i altament eficients-> milions de imatges simultàniament.
->Apareix seqüenciador de 2a generació.
36 CTRIGUERO Grans diferencies: - No s’ha de clonar - No s’han de separar els fragments que es seqüencien : s’eliminen les etapes de fraccionament Això fa que es puguin analitzar moltíssimes postres en paral·lel.
Resultat: Seqüenciació massiva= en una sola carrera, de cop, al acabar el cicle, donarà enorme quantitat de dades de seqüència => 60 Giga bases de seqüència! S’ha de tenir capacitat informàtica suficientment gran per la gran quantitat de dades (si no es te, no serveix de res) El primer que va sortir: Genome Sequencer FLX- 454 de Roche -> es capaç de donar milions de lectures Aquesta maquina utilitza seqüenciació per síntesi Després surt la competència: Illumina També la base de la quimia és la seqüenciació per síntesi Aquí son bilions de lectures Video adalt dreta link Applied Biosystems SOLID TM Diferencia fonamental: No es seqüenciació per síntesi, sinó Seqüenciació per Lligació Milions de lectures · PLATAFORMA 454 Material de partida: DNA de genoma humà S’aïlla el DNA -> s’ha de fragmentar, per fer-ho: amb mètodes físics: per nebulització (passar el DNA per un tub amb un diàmetre de porus molt estret) Dona un rang de mides apropiat A continuació amb electroforesi de gel d’agarosa es selecciona un rang de mides que ens interessi (300-800 bp) Després a cada un dels fragments se l’hi hi afegeix a un extrem un Oligo A i al altre extrem un oligo diferent Oligo B Ens interessen els que tenen A en un extrem i B en l’altre (seqüencies diferents) Es desnaturalitza i es selecciona nomes una de les 2 cadenes 2a etapa: AMPLIFICAR Cal etapa d’amplificació = generarem moltes còpies de tots i a cadascun del fragments que tenim en la barreja (milions de copies) Per fer-ho: PCR -> La barreja de fragments es posen en contacte amb unes microesferes de uns 20μm de diàmetre ( CAPTURE BEADS) que estan recobertes de un mateix oligonucleòtid complementari a un o altre oligos que hem afegit als extrems ( o al A o al B) Es fa en condicions i proporcions tals que, tot i haver-hi molts oligos complementaris a A, en la major part de les esferes nomes hibrida 1 fragment A la població d’esferes sels hi afegeix tots els components necessaris per fer la PCR (nucleòtids..) i se li afegeix oli -> es forma una emulsió Es fa en condicions tals que dintre de cada gota d’aigua hi queda una de les esferes amb el fragment hibridat.
37 CTRIGUERO I ara es comença a fer la PCR A aquesta PCR se l’anomena PCR emulsió El fragment que s’ha fet complementari, quan es desnaturalitza, el que feia de motllo marxa i va a hibridar a un altre oligo. La complementaria queda unida a la esfera perquè el principi es el oligo que estava unit a la esfera Al final, després de X reaccions, hi haurà multitud de fragments que estan recobrint cada una de les esferes.
Un cop hem fet la PCR, es trenca la emulsió i queden lliures les esferes Tercera etapa: REACCIO DE SEQÜENCIA Es fa en una placa de Picotites Te uns 2 milions de pouets -> tenen un diàmetre en el qual nomes hi encaixa 1 esfera NO se sap con cau cada esfera, la distribució es al atzar S’hi afegeixen boletes d’empaquetament perquè la esfera quedi encaixada i no s’escapi i a mes incorporen en sòlid tots els enzims i elements necessaris pel sistema de seqüenciació.
Reacció de seqüencia: Utilitza el mètode de la Pirosequenciació Tenim una esfera en un 1 pou Aprofitant l’oligo que hi ha al altre extrem (si abans teníem el A, ara serà el B)-> posem un encebador complementari al Oligo B Hi ha polimerasa i 2 enzims sulfurilasa i luciferasa. També la Luciferina i APS El sistema distribueix sobre la placa el primer dels 4 nucleòtids: dATP (NO es un dideoxi) Per cada nucleòtid incorporat s’allibera un PPi i es forma 1 ATP Luciferina s’oxida, i s’emet un flaix de llum visible Per cada nucleòtid que s’incorpora s’emet un flaix de llum de una intensitat fixe! Sobre la placa hi ha una càmera que determina el flaix de llum i determina 2 coses: - Intensitat - Posició en el que s’està fent el flaix de llum.
(s’està fent en tots els pous on el primer nucleòtid digui una A) Si hi haguessin 4 T-> s’unirien 4 A -> 4 PPi-> 4 ATPs 4 vegades mes intens el flaix de llum Després es renta i es diposita sobre la placa per exemple dCTP -> on s’hagi d’incorporar una C, passarà això i hi haurà llum Es neteja i es repeteix amb les G, es neteja i es repeteix amb les T Estem fabricant el complementari i No estem separant els fragments Això es va repetint i els fragments van creixent -> el sistema va llegint les bases que es van incorporant Al final tenim que de cada pou se’ns està generant un READ-> acabarà donant 2 milions de READS (lectures) Al final tens un Excel Al llarg dels anys s’ha passat de 100 Mb per run a 700 Mb per run 38 CTRIGUERO 28/11/16 3 ARTICLES -> PER L’EXAM ON-LINE!!! MIRAR TAMBÉ TEORIA ILLUMINA Seqüenciació per síntesi L’anterior donava lectures llargues Aquesta dona lectures curtes (màxim 300 nt) La primera part és pràcticament igual: - trencament per nebulització - Enriquiment amb fragments determinada mida - Adició seqüencial de oligos A i B - Fase de fusió del DNA -> es dissocien les cadenes Aquí ara es fa: PCR amb PONT ( BRIDGE PCR) La població de fragments que volem seqüenciar, es dipositen sobre la flow cell = superfície de vidre, on hi ha oligos enganxats covalentment Aquí hi ha els 2 oligos Es dipositen els fragments de cadena senzilla i hibridaran al atzar (units transitòriament) A partir d’aquí -> primera etapa d’extensió: a partir del oligo enganxat a la placa es copia -> després fase de desnaturalització El fragment que han servit de motlle s’eliminen i queden les cadenes complementaries de tots els fragments unides complementàriament a la placa.
Poden tenir un procés de oscil·lació i formar un pont i hibrida amb l’oligo complementari que te al altre extrem.
Es fa PCR-> es copia la cad complementaria Quan la estructura es desnaturlaitza, es desplega i queden els 2 fragments -> Els 2 fragments estan units covalentment a la base i són complementaris Es poden tornar a plegar i es copien, es tornen a desplegar, etc.
Quan es completen les etapes de PCR-> al voltant de cada fragment inicial, s’ha generat múltiples copies del fragment original.
Tenim tota la llibreria amplificada.
Ara cal eliminar la meitat dels fragments que s’han acumulat -> han de quedar tots en la mateixa direcció (s’eliminen la original o la complementaria) S’aplica un tractament químic per eliminar una de les meitats -> es talla per uns dels encebadors arran de placa -< es neteja i s’elimina.
Després de fer això ja puc estar segur de que aconsegueixo tenir cada agrupació amb fragments de cadena senzilla orientats de manera idèntica Ara ja puc fer la seqüenciació.
Cada una de les agrupacions s’anomena POLONIA 39 CTRIGUERO Reacció de seqüencia: S’afegeixen els 4 nt simultàniament Els 4 nt (no son estàndard com en el cas d’abans) tenen Hidroxil 3’ bloquejat -> Nomes es pot unir 1 cada cop Aquí cadascun dels nt porta un marcador fluorescent diferent S’afegeixen els 4 nt, s’incorpora el que toca -> hi ha càmera que detecta fluorescència quan s’excita la flow cell amb làser.
Fet això es desbloqueja l’extrem 3’ -> es trenca i s’elimina el marcador fluorescents que estava unit a la base nitrogenada i es tornen a afegir els 4 nt.
Es repeteix i es va construint la seqüencia.
Rendiment d’aquesta plataforma: Produeix 11 seqüenciadors diferents-> domini del mercat - Maquines que donen 300 milions de lectures - Maquines que donen 125 milions - 3mil milions També pot variar la longitud (100 bp, 300 bp...) Això fa que puguis jugar amb el temps i la quantitat de seqüencia que dona.
Aquesta plataforma ofereix la possibilitat de Paired-end Sequencing= tens una lectura a partir de cada extrem Pot passar que les lectures solapin -> ensamblatge molt més fàcil.
Si no solapen-> les 2 lectures estan molt aprop-> queda registrat que les lectures provenen del mateix fragment -> també facilita el posterior ensamblatge.
No cal començar des del principi per tenir la orientació contraria: a partir de la mateixa placa es pot aconseguir que en el mateix lloc estigui la Polonia amb la orientació contrària i es repeteix nomes la part de la seqüenciació.
PLATAFORMA SOLID Seqüenciació per Lligació! (No per síntesi!) La mostra es prepara pràcticament molt semblant a la 454 PCR en emulsió Es diposita en una superfície al atzar i queden unides Seqüenciació: SONDES DIBASE Sondes de oligonucleòtids de 8 bases, les 2 primers posicions son les mes importants, tenim totes les combinacions possibles ( 16 combinacions) A continuació es posen totes les combinacions possibles en les 3 bases següents Les ultimes son Inosina que pot hibridar amb qualsevol de les bases Al final: marcador fluorescent (hi ha 4) Cada 4 combinacions de les 1a 2 bases se’ls hi posa un marcador fluorescents Quadradet DIAPO TA, GC, CG i AT -> vermell En total tenim 1024 sondes diferents Hi ha modificació química entre les nnn i les zzz per poder trencar l’enllaç fosfodièster quan volguem.
Seqüenciació: Una única de les esferes amb Oligo comú que tenen tos els fragments i el fragment que vull seqüenciar.
S’afegeixen sobre la placa totes les possibles bases dibase TOTES ALHORA 40 CTRIGUERO Si tinc TT-> hibridarà la que comenci per AAnnnzzz-Fluoerescent La unió s’ha de fer permanent-> s’afegeix DNA lligasa : uneix covalentment la sonda amb l’encebador Es detecta la fluorescència -> es blava Es talla la sonda per eliminar el fluorofor A continuació es torna a repetir el procés i s’afegeix Tota la col·lecció de sondes una altre vegada.
Es posa lligasa i es fa covalent i es registra la fluorescència Es talla i s’elimina les zzz Això es va repetint i al final tot s’elimina Ara es repeteix el mateix però en contes de fer servir un primer n, es fa servir un encebador n-1 (hibrida una posició més endins)-> es torna a repetir Combinant que sabem la primera base de la dibase i el color que havíem tingut abans Es fa una tercera roda a partir d’un encebador nou: n-2 i un primer pont que arriba a la posició 3-> comencem a seqüenciar a la posició 4 4rt cicle: Primer n-3 + sonda pont i així 5é cicle: Primer n-4 + sonda pont Al final hem llegit dos cops cada una de les posicions Tot això ha anat donant una sèrie de colors i s’ha d’interpretar.
Si sabem que la primera es AT, el següent ha de començar per T i es verd doncs serà TG-> la següent dona blava i ha de començar per G -> es GG I així tots S’han de llegir 2 cops perquè nomes tenim 4 marcadors fluorescents i 16 marcadors de bases.
Aquestes maquines donen seqüencies molt curtes i tarden molts dies.
En general totes les plataformes que donen lectura curta: Encara que cada lectura es mes curta, en conjunt donen mes quantitat se seqüencia perquè donen moltes mes lectures que la Plataforma 454 30/11/16 · Plataforma 454: principal tipus d’error-> incersions o deleccions de seqüencia (s’han llegit de mes o de menys) = InDels · Ilumina i Solid -> error mes típic: substitucions (es llegeix una base que no és) ChIP-chip-> mitjançant arrays ChIP-Seq -> Població de fragments que han baixat amb les proteïnes -> determinar seqüència mitjançant seqüenciació massiva.
41 CTRIGUERO Plataforma ION TORRENT Idèntica a la 454 però canvia la forma en que es detecta la incorporació dels nt En la 454 es detecta cada nt que s’incorpora amb emissió de llum Ion Torrent: els pous tenen capacitat per detectar canvis de pH i passar.-ho a corrent elèctric.
En aquesta plataforma també s’afegeix un nucleòtid -> quan la polimerasa incorpora un nt s’allibera un protó > canvi de pH -> provoca corrent elèctric-> es detecta amb una determinada intensitat (Quan hem afegit les A s’ha obtingut aquest corrent elèctric-> vol dir que s’han incorporat 2 A per exemple.
Mostra també en esferes, PCR per emulsió, nomes canvi en el mètode de detecció.
Lectures de 400 bp És molt ràpida Tipus d’error més habitual: InDels (com la 454) Aquestes 4 Plataformes que hem fet fins ara(Roche 454, Ilumina, SOLID i Ion Torrent), tots s’ha d’amplificar per PCR = són PLATAFORMES DE 2a GENERACIÓ S’havien de fer senyals mes intensos per poder-los detectar.
PLATAFORMES DE 3a GENERACIÓ: Gran diferencia: No hi ha amplificació de la mostra Son seqüenciadors d’una sola molècula NO PCR Avantatge: No tindrem els errors d’amplificació (en el procés d’amplificació s’introdueixen errors i canvia algunes bases.) Plataformes: - Helicos Heliscope - Pacific Biosciences - Seqüenciació per Nanoporus (VIDEO) 4a generació: molt prometedora però esta en fase experimental. La idea es arribar a poder seqüenciar el material genètic d’una sola cèl·lula en una mostra de teixit fixada · PACIFIC BIOSCIENCES Agafem tots les fragments que he general al preparar la mostra i es dipositen en pous.
El fons dels pous és transparent i hi ha immobilitzada una molècula de DNA polimerasa La polimerasa en presencia d’un encebador i el fragment que volem seqüenciar i amb els 4 nt simultàniament -> la polimerasa va incorporant el nucleòtid que toca.
Els nucleòtids estan marcats per fluorescència Quan un nucleòtid es atret perquè s’incorpori la polimerasa , el detector llegeix la fluorescència i ho registra.
La marca fluorescent no esta a la base nitrogenada, si no que esta al pirofosfat -> quan la base s’incorpora el pirofosfat marxa i marxa la fluorescència. (però ja ha passat per la zona on es pot detectar la fluorescència) Permet tenir lectures molt llargues : 10 -15 kb Inconvenient: la tassa d’error es bastant alta (10%), però es pot compensar seqüenciant el fragment varies vegades.
42 CTRIGUERO · OXFORD NANOPORE La placa on es fa la seqüencia es una membrana travessada per nanoporus Nanoporus poden ser de 2 tipus: - Biològics : hemolisina - Sintètics crafè La membrana esta submergida en solució salina -> entre els dos costats s’estableix diferencia de potencial -> va passant corrent elèctric d’intensitat constant Quan es vol seqüenciar, tota la població de fragments que vull seqüenciar que estan convenientment modificats Cada fragment va atravessant els porus -> provoca un canvi en la intensitat del corrent elèctric El canvi de intensitat i el temps durant el qual es produeix el canvi d’intensitat, varia en funció de la base nitrogenada que està passant en aquell moment.
(salt i durada de la intensitat diferent -> es el que es va registrant) També dona lectures molt llargues: 6kb També taxa d’error relativament gran- > per solucionar-ho es fa la complementaria-> primer es seqüencia una de les cadenes i quan arriba al final llegeix la complementari -> disminuïm la taxa d’error.
Amb aquesta tècnica es pot detectar a més, si alguna de les bases que esta passant esta modificada (per exemple metilada) Un cop hem obtingut les lectures individuals -> Formar contigs Si son llargues es mes fàcil Si son curtes esmes difícil i hi ha zones que no tenen cap lectura.
Per compensar-ho: es fan moltes mes lectures Ensamblatge-> generar contigs Hi ha seqüencies que no troben cap seqüencia i es queden soles -> Aquestes seqüencies soles es diuen Singletons = Lectura de seqüencia que no te ninguna altre amb qui solapar.
Si volem seqüenciar genoma de 2.000 bp La maquina que tens et dona lectures de 500 bp Teòricament si es fa 4 vegades ja tenim les 2.000 bp = Coverage 1X Quan talles la mostra en trossos hi ha regions que es tallen de forma mes regular i altres que no, a mes quan fas PCR no tos els fragments es fan ambla mateixa eficiència.
Pots fer 4 lectures i que 3 d’elles donin la mateixa seqüencia i una del final, però tens una zona sense lectura.
S’ha d’augmentar al Coverage -> si augmento el numero de lectures al final podré cobrir tot el genoma d’un extrem al altre.
Potser necessito 11 lectures (PROFUNDITAT DE SEQÜÈNCIA) -> Representa Coverage de 5.500/2.000 = S’ha de treballar com a mínim amb un Coverage 30X Ex: si tinc genoma de 3·109 pb -> s’haurà de fer 90·109 pb 43 CTRIGUERO ALTRES APLICACIONS Seqüenciar el RNA -> RNA-seq Una de les aplicacions que mes s’està utilitzant: Quantificar la expressió Per seqüenciar el RNA: S’agafa població de RNA -> es converteix en cDNA -> Es fraccionen -> s’afegeixen els adaptadors (depenent de la plataforma) -> es seqüencien els cDNA -> es generen lectures i s’ensablen (contigs) Ex: genoma de 4 gens Contar numèricament el numero de lectures que corresponen a cada gen (que mapegen cada gen) Gen 2 - Mostra 2: 12 lectures - Mostra 1: 27 lectures -> Aquí s’està expressant més Gen 1-> cap lectura-> No te expressió en ninguna de les mostres Dins d’una mateixa mostra, la expressió depèn de la llargada de cada gen -> s’ha d’introduir una normalització: El nº de lectures s’ha de normalitzar en funció de la mida de cada gen = s’expressen per cada 1000 bases Mostra 2: profunditat de seqüencia: 20x106 lectures Mostra 1: profunditat de seqüencia de 5x106 lectures Si el gen 3 te 4 en les 2 mostres -> s’ha expressat més en la mostra 1 (en menys lectures, igual nombre) S’ha de normalitzar per la profunditat de lectura i per la llargada! 12/12/16 Fins ara hem vist 2 tècniques de trascriptomica: - RNA-seq. (seqüenciació massiva) - Arrays Els Arrays es continuen utilitzant molt i potser a la llarga el RNA-seq acabarà desplaçant als Arrays. Però ara s’utilitzen els 2 ARRAYS: AVANTATGES: - Cost Arrays és molt baix (uns 100$) - Fa mes temps que s’estan utilitzant -> la tecnologia i els protocols d’anàlisi dels resultats i la forma de donar els resultats a partir de les dades obtingudes d’un Array esta molt més estandarditzat -> L’anàlisi de les dades cres per convertir-les en dades d’expressió es farà més ràpid INCONVENIENTS: - S’ha d’hibridar una mostra amb una sonda-> els RNA pels quals no haguem posat una sonda al array, per molt que s’expressi molt, no es podrà detectar perquè no hi haurà sonda Les sondes que he posat en l’array condicionen de quins gens puc detectar la seqüencia.
44 CTRIGUERO AVANTATGES RNA-seq: - RNA-seq: es basa en seqüenciar ->es llegeixen. No es necessita info prèvia per saber quins es detectaran. Si hi son es detectaran.
- Arrays: els RNA que s’expressin molt poc, si la quantitat de mostra es molt petita, pot quedar com soroll de fons. Quan la expressió es molt intensa, el sistema es satura i no es detecta. (hi ha un rang en que si que es poden apreciar les diferencies) Això no passa amb el RNA-seq: el rang dinàmic de sensibilització es molt més gran.
Com es podrien combinar els 2? 1r experiment de RNA-seq-> sabem quins gens s’estan expressant -> a partir d’aquí es dissenyen sondes que es col·loquen en un Array per veure com varia l’expressió d’aquests gens (implica dissenyar Array a mida) Dins de la Transcriptomica: El RNA-seq permet altres aproximacions: - Descobriment de transcrits: utilitzar la seqüenciació massiva per establir catàleg de gens que s’estan expressant en les mostres que tinc. -> es pot identificar qualsevol RNA (mRNA, ncRNA, tRNA, etc) - Determinar al estructura transcripcional del gen : Com es l’extrem 5’ o el 3’, patró de splicing, saber on comencen i on acaben els exons, identificar fenòmens de editin(quan el RNA s’ha transcrit es modifica) L’anàlisi transcriptomica no es nomes analitzar nivells d’expressió sinó descobrir transcrits i determinar estructura dels gens.
EXEMPLE: El misteri de les abelles que es moren RNA de colònies d’abella sanes i comparar-lo amb anàlisi trancriptòmic derna d’abelles malaltes Es va veure la presencia de transcrits que no estaven en les sanes -> els RNA corresponien a diferent tipus de virus que afecten als insectes -> podria ser la causa de la mort de les abelles.
Depenent de si ja es te un genoma de referencia o no l’ensamblatge serà mes o menys fàcil.
Ensablar els gens aprofitant que tinc el genoma de referencia O be de novo-> anar a cegues, i anar ajuntant les peces quan les trobo-> no es te genoma de referencia-> es mes difícil i costos.
Per descobrir nous transcrits(quins gens s’expressen i quins no), es pot fer una llibreria normalitzada de cDNA Els RNA que s’expressen poc poden estar tant poc representats que es perdin, perquè estan emmascarats pels que s’expressen molt.
Per evitar-ho banc de cDNA normalitzat: Tenim un RNA que s’expressa molt i un que molt poc ... es prepara Es fa una PCR -> amplifiquem els que s’expressen a nivell baix i a nivell alt Desnaturalitzem Fins aquí hem mantingut les proporcions relatives.
45 CTRIGUERO NORMALITZAR: fer una manipulació per tal de que els RNA tant els que s’expressen molt com els que molt poc, acabin estant al mateix nivell -> al final tindre la mateixa probabilitat de detectar un que s’expressa poc que un que molt (NO es quantitatiu) - Es deixa baixar la temperatura una mica i durant un temps limitat -> els que estan en molta abundància son els primers que es re-associen.
- Es tracta amb una nucleasa que nomes es activa sobre el DNA de doble cadena -> es carrega tot el que estava re associat.
- Resultat: la proporció ja es queda 1:1 Ara es seqüencia perquè tinc la mateixa quantitat de 1 que de l’altre (he normalitzat) AIXO ES FA QUAN INTERESSA DESCOBRIR NOUS TRANSCRITS APLICACIONS EN L’ÀMBIT DE LA GENÒMICA: - Podem estar seqüenciant de novo: fem la seqüenciació d’un genoma d’una sp que no ha estat seqüenciada (per primera vegada) Es molt fàcil i assequible.
- O be podem re-seqüenciar el genoma: ja es disposa genoma de la sp, però ara es fa de individus concrets d’aquella espècie.
Com que els individus son diferents, responem diferents al ambient, a la malaltia -> es podran establir relacions entre fenotip i genotip -> identificar diferencies entre individus, SNPs, InDels, canvis de seqüencia, duplicació, etc.
EXEMPLE: El projecte dels 1000 Genomes-> es van seqüenciar 2504 genomes de 2504 persones diferents per veure les diferencies genètiques més comunes.
(es va fer amb un covarage 4x (baix) Deep sequencing of 10.000 human genomes Covareg molt alt -> mes exactitud mes precisió Han pogut identificar 150 milions de SNPs Amb la tecnologia i cost actual, es possible seqüenciar molt ràpidament genomes, amb un grau de confiança molt alt i per tant apta per ser apta a la aplicació clínica.
Això ha sigut possible gracies a la Illumina HiSeq International Cancer Genome Consortium Seqüenciar genoma dels tumors de 50 tipus de càncer - Seqüenciar una part concreta del genoma: Dirigida: Seqüenciació del exoma= part del genoma que codifica per proteïnes (és un 2% del genoma sencer) S’utilitza sobretot per identificar les causes genètiques de malalties Mendelianes (malalties monogèniques): alteració de la seqüencia d’un sol gen i que normalment donen malalties rares, poc freqüents.
El fet de seqüenciar nomes l’exoma i no tot el genoma: es pot treballar a molta mes profunditat (molt mes covarage). A igual numero de lectures les tinc concertades nomes en el 2% del genoma i no en tot .
METAGENOMICA: seqüenciació de genomes de microorganismes No tens perquè cultivar els microorganismes al laboratori.
PROJECTE DEL MICROBIOMA HUMÀ: quins microorganismes estan vivint amb nosaltres en les diferents parts del organisme.
Podrem tenir seqüencia del genoma i del microbioma -> es podrien trobar causes de malalties que no estan clares.
46 CTRIGUERO 14/12/16 EXPRESSIÓ DE PROTEÏNES RECOMBINANTS Produir proteïnes fora del seu entorn natural Per què volem purificar proteïnes? Perquè volem caracteritzar la proteïna: com es, com funciona, que fa.
Perquè la volem produir en quantitats grans per produir-la a nivell industrial Ç(activitat terapèutica, activitat detergent, etc.) - Per fer anticossos Per identificar-la a nivell estructural Activitat enzimàtica Estudiar mecanismes de regulació de la activitat Localització subcelular Altres proteïnes que interaccionin Industrial: enzims amb aplicació biotecnològica Aplicacions terapèutiques: vacunes, hormones factors de creixement...
Per fer-ho: A partir del DNA que l codifica volem arribar a la proteïna (traducció, transcripció Necessitem: - cDNA -> clonar - S’ha de clonar en un vector especialitzat = Vector d’expressió (expressar proteïna en un sistema heteròleg) o La volem expressar dins de cel viva? O in vitro? o Si es cel viva que ha de ser? Bacteri, insecte, planta, mamífer? o Quin vector farem servir?, quina soca? Quina línia cel·lular? o Li posarem algun pèptid o algo-> etiqueta o no etiqueta? o On posarem la etiqueta? N- o C- terminal? - Ferm que s’expressi la proteïna - Purificació o Quina estratègia de purificació? o La proteïna s’ha plegat correctament? Te la mateixa estructura 3D que la natural? o Es necessari fer alguna cosa per que es plegui correctament? o Continuem amb la etiqueta o es treu? - Si funciona el que fem  Passar a Gran escala (escala de producció) - Quan passem d’escala s’ha de comprovar que continuo funcionant Cada proteïna és UNICA! Una estratègia que val per una proteïna no te perquè funcionar per una altre, perquè tenen propietats diferents.
Criteris per decidir en quin organisme o invitro - Expressar-la in vitro - In vivo o Procariotes: E.coli o Eucariotes: llevat, insecte....
Si la prot es d’origen bacterià -> expressar-la en bacteris.
47 CTRIGUERO Si no és d’origen bacterià, s’ha de tenir en compte que els bacteris no fan la majoria de transformacions posttraduccionals i que la proteïna no funcioni. -> haurem de passar a un sistema eucariòtic Els diferents sistemes eucariòtics tampoc fan les mateixes modificacions post-traduccionals Facilitat de manipulació: de mes fàcil a mes complicat (DIAPO in vitro – Bactèria – llevat - ...) Recombinant protein production usicng cell-free extracts Extractes de cels: de Bacteris, llevats, plantes, mamífers...
Els que s’utilitza mes: extracte de germen de blat i reticulòcits de conill. El que habitualment dona millor rendiment és el de germen de blat (però sempre hi ha excepcions9 Extracte cel·lular que te tots els elements que hi havia a la cel S’ha d’eliminar el DNA i el RNA que hi pugui haver.
Ens quedem amb la resta: - Maquinaria traduccional: ribosomes, rRNAs, ......
- Maquinaria transcripcional: RNA pol,....
A més hem d’afegir: - RNA polimerasa d’un bacteriòfag molt actives - NTPs - AA - Energia (ATP i/o GTP) - Sistema de reciclat d’energia: o Eucariota: Creatina-P i CPK o Bactèria: PEP i PK - Tampó - Qualsevol altre cofactor perquè la transcripció i la traducció es donguin+ En un extracte-> transcripció, traducció in vitro Per expressar la nostra proteïna: A tota la barreja hi afegint el DNA de la prot que volem expressar (ha de ser un cDNA) Pot estar en un plasmidi o pot ser simplement cDNA lineal EL DNA es transcriurà-> mRNA -> traducció-> Proteïna Es pot partir directament del mRNA -> nomes Traducció in vitro AVANTATGES: - Si la proteïna fos tòxica-> mataria la cel-> com no hi ha cap cel viva, és ideal per produir cels potencialment tòxiques.
- Problema: No es fan gaires modificacions post-traduccionals, però es pot suplementar amb enzims que introdueixin les modificacions post traduccionals que ens puguin interessar.
Si la proteïna es insoluble, com es un sistema obert, es pot afegir un detergent suau, algun sistema membranós perquè no precipiti ...
Es sistema obert que permet afegir allò que volem.
- Permet fabricar proteïnes amb les que artificialment hi podem incorporar aa que no son naturals per veure com actuen, o be aa en els que els hi hem afegit algun tipus de molècula (marcar la proteïna)* INCONVENIENTS: - A petita escala funciona molt bé però quan es fa a escala industrial no funciona tant be - Es car - La reproductibilitat no es bona, hi ha varietat - Escalar-ho per incrementar la productivitat no es fàcil 48 CTRIGUERO *Mitjançant mutagènesi dirigida, en un triplet per exemple UTA, el canvio a UGA (es un codó de parada A mes afegeixo un tRNA modificat que sigui capaç de reconèixer específicament el codó de parada i a mes al tRNA li afegeixo un aa que no es ningun del 20 -> quan la traducció arribi al codó modificat se li incorporarà l’aminoàcid diferent.
 Es per fabricar bioconjugats Dona molta versatilitat AMB CÈL·LULES VIVES La majoria de prot recombinants es produeixen en E. coli Primer s’ha de clonar el ORF EL promotor serà procariota o eucariota depenent de on volguem expressar la proteïna. (cada promotor amb els eu tipus de cèl·lula) E. coli: · AVANTATGES: - Es mol fàcil de treballar i manipular - Molt fàcil de transformar - Velocitat de creixement molt ràpid - Es poden arribar moltes cels en el cultiu - Expressas molt - Es pot fer créixer el cultiu de bacteris en condicions molt diferents fins a torbar les òptimes.
- Molt econòmic - Es pot incrementar la escala de producció · Problemes: - La proteïna que es produeix pot ser insoluble (es produeix en tanta quantitat que no es pleca be i precipita, forma agregats...)-> quan precipita forma agregats= cossos d’inclusió (això pot ser avantatge ) - Li costa formar ponts di Sulfur al citoplasma - Gran problema: no modificacions post-traduccionals - Per expressar algunes proteïnes procariotes (amb massa molecular gran) no va gaire be.
- Utilització de codons Utilització de codons no es exclusiu de E. coli Per cada aminoàcid que esta codificat per mes d’un triplet, hi ha codons que tenen preferència respecte altres.
Si estem expressant una prot de E coli en una cel de llevat on els codons que en E. coli eren preferent ara son estranys, la cel es quedarà sense els tRNA i es quedarà sense la proteïna La utilització de codons no es la mateixa en tots els organismes Es un aspecte que s’ha de tenir en compte Per resoldre-ho: si se que hi ha un codó que codifica per Arg i en l’hoste el codó es de baixa freqüència, mitjançant mutagènesi dirigida, substituir el codó per un altre de alta freqüència en el hoste on vull la proteïna.
49 CTRIGUERO Elements basics un vector d’expressió per produir proteïnes en E. coli Es un plasmidi, he de saber: - Quin ORI (origen de replicació) te-> depenent del ORI que sigui el numero de copies dintre de cada cel serà diferent - Promotor: ha de ser bacterià-> hi ha diferents (forts, febles, induïbles, consecutius...) Els promotors induïbles han de ser forts i que siguin molt ben controlables-> que quan no s’han d’expressar, no s’expressin en absolut. Que no siguin leaky (que no s’expressin poc quan no s’han d’expressar) - MCS (multicoloning side) Terminador de la transcripció perquè s’aturi.
Gen marcador -> normalment antibiòtic Entre l’inici de transcripció i el MCS hi sol haver nucleòtids que: - Codifica per una etiqueta (petit peptid o proteïna grossa) que servirà per etiquetar la proteïna - Diana reconeguda específicament per determinades proteases Quan el promotor transcriu i el RNA es tradueix -> es genera una proteïna de fusió d’aquest tipus: N-|TAG |D| ORF |-C  es una proteïna de fusió ( a la proteïna que ens interessa li hem fusionat alguna cosa) *Diana de proteases El marc de lectura s’ha de respectar, han d’estar en fase ARTICLE!! 19/12/16 Gairebé sempre es treballa amb promotors induïbles, regulables Si la expressió es massa alta, es produeix molta proteïna, però la cel concentra els seus recursos metabòlics en produir aquesta proteïna i el cultiu no continuarà creixent.
Si tenim poques cels el rendiment serà molt baix Si la proteïna a mes es tòxica és encara pitjor Primer deixem que el cultiu creixi, quan ja hi hagi moltes cels -> induïm la producció de la proteïna (ara ja no ens importa si el cultiu no continua creixent.
E. coli lac operó Contra d’un primer gent que codifica pel repressor lac que esta sota control del seu propi promotor.
Quan la prot es fa reprimeix el promotor lac Si en el medi hi ha lactosa (inductor) s’uneix a la proteïna repressora i no es pot reprimir el promotor> el promotor es actiu i s’expressen els gens del operó En absència de lactosa està tot reprimit. En presencia d’un inductor (lactosa) es pot fer.
El 1r promotor que s’utilitzava va ser aquest.
50 CTRIGUERO IPTG -> fa el mateix que la lactosa (és un inductor) però no es natura.
Lactosa es inductor i permet el seu propi metabolisme IPTG es inductor i no es metabolitza.
A partir del promotor LAC es va derivar per mutageniesi al lacUV5 Promotor LAC te expressió per catabòlit (si al mateix temps que hi ha lactosa, hi ha glucosa, l’operó lac no ‘s’activa fins que tota la glucosa s’ha reduit) LacUV5: no te la repressió per catabòlit -> li es igual si hi ha glucosa o no. El promotor s’activa igual.
A partir d’aquest i altres s’han generat promotors híbrids: TAC = conte part del opero triptòfan i un apart del promotor del operó de la lactosa És 10 vegades més fort i continua sent induïbles per IPTG.
Un dels que m’és s’utilitza: En el genoma de E. coli s’hi insereix un gen quimèric de promotor lacUV5 amb el gen T7 RNA polimerasa S’introdueix IPTG perquè es comenci a produït T7 RNA polimerasa La soca a mes a de tenir el vector d’expressió: tindrà clonat el gen de la proteïna que volem produir sota control d’un promotor que és activat per la T7 RNA polimerasa.
Una de les soques que més es fa servir de E. coli és BL21(DE3) DE3= s’ha inserit T7 RNA polimerasa Problema: El promotor lacUV5 és una mica leaky (quan no ha de funcionar, en el fons va actuant una miqueta) Si la proteïna es tòxica, encara que sigui amb petita quantitat va matant la cel.
Solució: fer servir una altre soca: BL21(DE3)-pLysS Esta fent un Lisozim que és inhibidor de la T7 RNA polimerasa -> tot i que s’estigui produint una petita quantitat, s’està inhibint.
Quan posem IPTG es fa en gran quantitat i el Lisozim no li afecta.
Tot el treball de DNA recombinant, es fa en una soca bacteriana que no permet la expressió -> son soques bacterianes només per clonar-> després ja li passes el plasmidi a les soques d’expressió.
PROTEÏNES DE FUSIÓ Perquè ens interessa? - Si tenim Ac dirigits conta el Tag, podem utilitzar els Ac per fer seguiment de purificació de proteïna mitjançant Western blod - Augment de la solubilitat de la proteïna - Fer que la proteïna un cop expressada sigui mes estable (mes resistent a les pròpies proteases) - Ajuda a purificar la proteïna per cromatografia d’afinitat - Que la proteïna s’exporti al medi de cultiu o al espai periplasmic (fent que el Tag sigui una senyal que envii la proteïna on volguem) Recordar que entre el Tag i la ORF hi haurà un lloc de tall de proteases.
51 CTRIGUERO Qualsevol element aliè que li estem afegint a la proteïna, pot tenir conseqüències negatives: - Podem perdre la funció de la proteïna (que es plegui malament..) - Que ens ho envii a un compartiment que no volguem Exemples d’etiquetes més utilitzats (DIAPO) (No cal saber-los) saber que hi ah moltes variants d’etiqueta i que poden ser uns pocs aa (pèptid) o prot de mida considerable Les que més s’utilitzen: - Cua d’Histidines (6-10 His) - GST (proteïna de mida considerable) - Proteïna d’unió a Maltosa L’objectiu majoritàriament es facilitat la purificació per cromatografia d’afinitat No sempre afegir una etiqueta fa que la proteïna sigui soluble! Conjunt de Vectors d’expressió: pGEX Produir les proteïnes fusionades al Glutatió S-transferasa El promotor és un híbrid. Plac A continuació etiqueta: Glutation S-transferasa A continuació seqüencia d’aa -> diana de reconeixement i tall de proteases A continuació el multicloning side (proteïna que volem) Quan clonem el cDNA ho hem de fer respectant el Marc de Lectura que hi ha.
pGEX-4T -> hi ha 3: que son idèntics però tenen una subtil diferencia: Les dianes estan mogudes 1 posició cap a la dreta o 2.
D’això depèn que pugui funciona ro que no funcioni.
Exemple: Choosing the right pGEX...
Si s’ha inserit una base-> ja no estarà respectant el marc de lectura.
Exemples de com s’utilitza una etiqueta per purificar: GST-Tag Resina de glutatió: La glutatió S- transferasa s’hi enganxa Rentem amb tampó per treure tot el que no es la meva proteïna Eluim: - Fer passar tampó que contingui glutatió -> el glutatió lliure desplaça el de la columna, es desenganxa i elueix la proteïna de fusió - O bé fer passar una solució que conte la proteasa que reconeix el punt de tall que hi ha al mig -> va tallant i elueix la proteïna que m’interessa (ja sense el GST) HIS-Tag Es fa servir una resina que porta units àtoms de níquel (IMAC= utilitzant ions metàl·lics immobilitzats) Histidines estableixen enllaços de coordinació -> rento Eluir: - Afegeixo imidazol-> competició pel níquel entre el imidazol i les histidines-> imidazol desplaça proteïna de fusió i aquesta elueix.
- O be afegint proteasa que talles la cua de His.
52 CTRIGUERO Es poden utilitzar diferents proteases per talles les fusions entre la proteïna i la etiqueta.
- Factor Xa - ...
EXPRESSIÓ EN EUCARIOTES Sistemes procariotes no fan modificacions post-traduccionals Una de les que no fan el procariotes es la glucosilació (MOLT IMPORTANT) Si sabem que la proteïna s’ha de glucosilar-> ens passem a sistema Eucariota Però no tots fan les mateixes glucosilacions i tmb s’ha de tenir en compte.
Els patrons de glucosilació amb N tmb son diferents entre llevats, mamífer, insectes.
En qualsevol cas, en línies generals podem definir sèrie d’elements que es troben en els vectors d’expressió eucariota: Totes les manipulacions per construir el vector recombinant el farem en bacteris (molt més fàcils de treballar) Ha de tenir: - Origen de replicació - Gen resistència a antibiòtic (marcador selectiu) El transformem en cel eucariota-> ha de tenir: - Ori per cels eucariotes - Marcador selectiu que sigui útil per detectar presencia del plasmidi en cels eucariotes (amb promotor eucariota i terminador) - Un lloc de clonatge múltiple situat d’arrere d’un promotor eucariota (perquè s’expressi un cop estigui dins la cel eucariota) El que s’utilitza més: LLEVAT - Fa molts anys que es treballa i es coneix molt bé la seva genètica, bio mol, metabolisme, etc.
- És unicel·lular - Creix molt de pressa en medis fàcils de preparar - Econòmic - Es pot passar molt fàcilment de petita a gran escala - A més es coneixen promotors que són fort però fàcilment induïbles.
- És un eucariota Segur (no es perillós de cara a la salut humana) - De forma natural segrega poques proteïnes al medi-> si fem que s’enviï al medi , purificar-la pot ser més fàcil.
- No produeix pirògens (bacteris sí) - No hi ha patògens o virus de llevats que afectin els humans.
Problemes: - La glucosilació no és idèntic al de les cels de mamífer. Te certa tendència a hiperglucosilar les proteïnes - Introdueix un tipus de glucosilació preferentment sobre N que pot fer que la proteïna sigui preferentment al·lergògena 53 CTRIGUERO Vectors d’expressió: - Plasmids episomals (YEps) - Plasmidis que s’acaben integrant dintre dels cromosomes del llevat (Yips) - Cromosomes artificials de llevat (no s’utilitzen)(YACs) VECTORS D’EXPRESSIÓ- PLASMIDIS EXTRACROMOSOMALS Basats en plasmidi de 2μm (natural) Elements important: - Origen de replicació que funcioni en bacteris - Gen de resistència marcador de la presencia del plasmidi en el bacteri - Lloc de clonatge múltiple amb el cDNA que vulguem amb promotor com GAPDH i un senyal de terminació que es pugui poliarilar - Marcador que ens permet saber is les cels de llevat han incorporat el plasmidi -> en el cas de llevats s’utilitza marcadors auxotròfics (es fica en llevat per exemple que no pot fer Leucina=soca auxotròfica per Leucina-> perquè pugui créixer s’ha d’afegir Leucina; si transformen la soca amb el vector que porta una copia del gen de Leu, la soca recupera la capacitat de sintetitzar leucina.-> selecció: en medi sense leucina-> nomes creixeran els cels que han incorpora el plasmidi) Es pot fer amb la Histidina(HIS), Triptòfan(TRP), Leucina (LEU2) o URA Nivells d’expressió amb aquest tipus de vector són alts.
21/12/16 Promotors induïbles o regulables (preferència) VECTOR D’EXPRESSIÓ – INTEGRACIÓ EN CROMOSOMA LLEVAT Les cels tenen tendència de perdre els plasmidis (representen carrega) Per evitar que es perdin els plasmidis -> utilitzar vector que s’integra Transformem el llevat amb un plasmidi i abans de passar a la expressió, s’integra en el genoma.
Quan la construcció esta integrada, cada vegada que el llevat es duplica, tmb ho fa la construcció.
Coses a tenir en compte: - Els plasmidis que utilitzarem per fer això ja no necessiten origen de replicació - Si el transgen s’integra en el genoma del llevat, hi haurà només 1 copia -> el nivell d’expressió es sempre mes baix que si utilitzen un plasmidi extracromosomal.
(això tmb pot interessar) Partim d’un plasmidi: - Origen de replicació procariota (funcional a E.coli) - Gen de resistència a ampicil·lina -> per treballar en e. coli - Construcció GOI = gen d’interès - LEU2: gen marcador per auxotròfia-> per seleccionar llevat - A1 i A2: idèntiques a les seqüències que poden estar situades al extrem d’un dels gens que el llevat porta i que sabem que no és essencial.
54 CTRIGUERO Es linealitza S’aïlla el segment S’introdueix dins del llevat-> es produeix doble recombinació homòloga -> Reemplaçament On abans hi havia un gen, ara hi hem inserit el que ens interessa Podem saber que s’ha incorporat pe marcador auxotròfic Nomes tindrem 1 còpia.
CROMOSOMES ARTIFICIALS DE LLEVAT (YACs) Vectors que estan dissenyats pe comportar-se com si fossi n un cromosoma més.
Gran capacitat de clonatge-> es poden posar fragment de DNA de mes de 100 kb Son estables Els elements distintius claus son: - Seqüencies ARS: de replicació autònoma (un Origen de replicació dels cromosomes) - Seqüencia centromerica: per correcta divisió - seqüencies telomeriques Inicialment es Circular ESQUEMA DIAPO Es talla amb Bam i Sma -> afegim el fragment que volem clonar Es comportarà com un cromosoma (No es fa servir per proteïnes recombinants) El llevat que s’utilitza normalment es Sacharomyces cerevesiae però es poden utilitzar altres soques de llevat EXPRESSIO EN CELS DE MAMIFER AVANTATGES: - Bona solubilitat - Es secreta - Modificacions post-traduccionals - Mètode òptim per produir una proteïna en els eu estat natiu, forma activa INCONVENIENTS: - Es car - Requeriments per cultivar-les es mes complicat - Rendiments baixos - Molt més temps - Expressió transitòria: en plasmidi, element extracromosomal, no s’integra al genoma -> al final es perd o es degrada - Expressió estable: s’integra al cromosoma Rendiment: Proteïna a petita escala-> suficient amb transitòria Proteïna a gran escala-> expressió estable.
Transitòria: poca productivitat però es molt més ràpida Estable: gran quantitats de proteïna però molt mes temps i esforç.
55 CTRIGUERO Estructura general vector en sistema eucariòtic: - Element per constricció procariota - Origen de replicació eucariòtic - Per Seleccionar cels transformades - Construcció per expressar la proteïna que ens interessa.
TRANSGEN: - Incorporar 5’-UTR i posar un intró per facilitar la transcripció del transgen - Tmb conservar la 3’UTR per donar estabilitat al mRNA quan es tradueix - Es recomanable revisar l’entorn del codó d’inici de traducció-> que s’ajusti el mes possible al que es el consens òptim - Tag - Seqüencia senyal que es secreti, que vagi a la membrana, al RE, etc.
Agents de selecció: Els que mes s’utilitzen: - Geneticina - Metotrexat (MTX) EXPRESSIÓ ESTABLE: Integrar al genoma Inicialment es feia integració al atzar, en qualsevol locus del genoma -> perill: es pot integrar en una zona que no sigui trancripcionament activa (quedar silenciat) Dissenyar sistemes per integració més dirigida Transposases modificades per que funcionin be en cels de mamífer Les cels es transformen simultàniament amb 2 vectors: - Helper: permet l’expressió només de la transposasa - Donador: porta la construcció corresponent al nostre transgen i un marcador i 2 repeticions terminals invertides Quan la transposasa s’expressa, reconeix les repeticions terminals invertides i ho integra al genoma Aquesta integració és una recombinació no homologa (al atzar) Les transposases s’han modificat perquè tinguin mes tendència a inserir el transgen en regions que siguin actives.
Un altre sistema: Utilitzar recombinasa (Flp recombinasa) Tenim 2 plasmidis - Helper: expressa la recombinasa - Donador: porta la construcció amb el transgen i 2 seqüencies que reconeix específicament la recombinasa En aquest cas si que es recombinació homologa -> s’ha d’introduir en una línia cel·lular que prèviament ha estat modificada amb 2 seqüencies idèntiques en el locus on volem que s’integri el gen.
56 CTRIGUERO INDUCIBLE OVEREXPRESSION TRANSGENIC SYSTEMS Sistemes regulats Promotors que puguem controlar quan s’expressen Desenvolupar sistemes induïbles.
El que més s’utilitza: Tet-ON, Tet-OFF DIAPO: parts necessàries An ideal regulat...
An ideal inducer...
Es fonamenta en el funcionament del Operó de la tetraciclina q es troba en el trasposo Tn10 Aquest Opero dona resistència a la tetraciclina Elements que ens interessen: - Repressor Tet (TetR) -> s’uneix a les seqüencies del operó (Tet O) i la resta de gens del operó no s’expressen - Quan apareix la Tetraciclina, s’uneix al Repressor, el Repressor no es pot unir a les seqüencies operadores i si que hi ha expressió dels gens del operó (hi ha un que es una bomba que agafa tetraciclina i la expulsa cap a fora) TET-OFF: Consta de : - Primers 207 aa del TetR amb un fragments de 127 aa d’un virus = Proteïna hibrida tTA Te capacitat de unir-se al Tet O -> quan s’uneix al operador, enlloc de reprimir la expressió Activa la expressió.
- Si afegim Doxicilina (una tetraciclina) -> s’uneix a la part del repressor de la proteïna hibrida -> Reprimeix la transcripció  La adició de antibiòtic bloqueja la transcripció Perquè el sistema estigui reprimit, hem d’estar donat l’antibiòtic TET-ON AL reves, que quan es doni l’antibiòtic es posi en marxa i quan no hi ha antibiòtic estigui reprimit.
S’utilitza domini d’activació de virus com abans però ara s’han canviat 4 aa de la part del Tet R rtTA és igual que tTA per amb 4 aa diferents S’aconsegueix que ara NO es pugui unir-se al operador -> encara que s’estigui produint, la transcripció no esta activa Quan afegim l’antibiòtic, es converteix en un activador transcripcional  Si no administrem antibiòtic, no s’expressarà  Si afegim antibiòtic, s’activarà la transcripció 57 ...

Comprar Previsualizar