Tema 3: Genoma eucariòtic (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura genètica molecular
Año del apunte 2015
Páginas 6
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 18
Subido por

Vista previa del texto

Tema 3. El genoma eucariotic Què se’n sap del genoma? El més important no és el genoma, sinó la funció de cada part d’aquest.
Genoma: gens + DNA inter-gènic de tots els cromosomes d’una cèl·lula (material genètic d’un organisme). 1 cromosoma correspon a una molècula de DNA. Per referir-nos a la posició que ocupa un gen dins del genoma parlarem de locus.
Genoma – transcripció  Transcriptoma (còpies RNA dels gens actius) – traducció  Proteoma (proteïnes cèl·lula) PROCARIOTES: No presenten nucli, la zona que ocupa el DNA dins del citoplasma s’anomena “nucleoide”, és un DNA haploide, és a dir, únicament hi ha una molècula de DNA de doble cadena circular. Els genomes contenen entre 1-6x106 bp, no contenen histones i pot tenir altres elements genètics no genòmics, com ara plasmidis i genomes fàgics.
EUCARIOTES: - Genoma mitocondrial Genoma cloroplasts (únicament en plantes) Genoma nuclear: la magnitud d’aquest s’expressa depenent del context.
o Cromosomes: n o 2n, on n és el nombre de cromosomes o Massa DNA: pico-grams (pg), s’usa sobretot quan treballem al laboratori o Valor c: quantitat de DNA respecte una cèl·lula germinal: c, 2c, 4c (en la metafase) o Longitud: en pb o nt, quan parlem de gens o de contingut total de DNA Totes les cèl·lules tenen la mateixa quantitat de DNA i nombre de cromosomes, a excepció de les germinals que contenen la meitat. El contingut total de DNA i el nombre de cromosomes varia àmpliament entre espècies diferents, tot i això, no hi ha correlació entra aquestes dues característiques, ja que el DNA no codificant influencia en la quantitat de genoma.
En el cas de procariotes, com més evoluciona un organisme, més quantitat de DNA tenen, això és degut a l’absència de DNA intergènic. En eucariotes, aquesta correlació es perd, de forma que té més sentit parlar de funcionalitats, no de gens. Aquesta última classificació és molt complexa perquè hi ha gens que codifiquen per proteïnes amb més d’una funció.
Com més complex és l’organisme, menor és la densitat de gens i major és el nombre d’introns per gen.
En una comparació de catàlegs de gens, trobem que a major complexitat de l’organisme, més gens hi ha per cada funció. Com en tot, hi ha algunes excepcions, com ara en Arabidopsis thaliana, que és una planta i té més gens de metabolisme perquè ha de dur a terme la fotosíntesi.
Com es distribueixen els gens en un cromosoma? No es distribueixen uniformement, una prova seria un cariotip amb colorant Giemsa, el qual té més afinitat per les regions AT. En el genoma tenim un 59% de regions AT i en els gens un 45-50% de regions GC, de forma que les zones més clares són les que tenen gens, i sabent això, podem observar la distribució de gens, que no és uniforme en diferents espècies d’eucariotes. Com més densitat de gens, trobarem més zones clares. Altres tipus de cromosomes serien: - - - Minicromosomes: tenen una alta densitat de gens i a la vegada són relativament curts, un exemple es trobaria en el pollastre, presenta un genoma distribuït en 39 cromosomes (6 macrocromosomes: 66% del DNA, 25% dels gens i 33 microcromosomes: 75% dels gens) Cromosomes B: s’observen únicament en alguns integrants de la població, els més comuns són en plantes i també se’ls coneix en fongs, insectes i animals. Són versions fragmentaries de cromosomes normals, que resulten fenòmens insuficients durant la divisió nuclear. Estan relacionats amb problemes de viabilitat.
Cromosomes holocèntrics: no tenen un sol centròmer, tot el cromosoma pot actuar com a tal (C. elegans).
http://www.unav.es/ocw/genetica/tema-1-3.html Com s’obtenen les seqüències d’un genoma? La seqüenciació del DNA té una gran importància tècnica, tot i tenir la tecnologia més avançada, no es poden obtenir les seqüències de segments de més de 750 parells de bases en un sol experiment, de forma que la seqüència llarga de DNA s’ha de construir a partir d’una sèrie de seqüències curtes. Això es fa trencant la molècula en fragments, determinant la seqüència de cadascun i per últim usant un ordenador per tal d’investigar superposicions i construir la seqüència mestre.
No treballem amb una sola molècula de DNA, usem diverses i es duu a terme una digestió parcial per tal d’obtenir a partir de cada molècula de DNA diferents fragments. La digestió parcial consisteix en fer una barreja de cada molècula de DNA i enzims de restricció en unes condicions sub-òptimes per els enzims, ja que així aquests no treballaran al 100% i faran talls aleatoris. Això ho fem perquè hem d’obtenir fragments que es superposin entre ells, en el cas que l’enzim treballés al 100% obtindríem fragments que podríem seqüenciar però no ordenar.
Aquesta és bàsicament la tècnica usada en procariotes petits, que no presenten regions no-codificants ni repetitives, s’anomena Shotgun.
En eucariotes, el procés és molt més complex, ja que cal tenir en compte les regions repetitives i si aquestes estan en tàndem o disperses. Les tècniques usades es basaran en el mateix però estaran una mica més elaborades. Primer es generaran mapes, els quals es munten a partir d’uns marcadors que sabem on es situen en el genoma i l’ordre d’uns respecte els altres. Aquest mapa proporcionarà una guia per als experiments de seqüenciació al mostrar les posicions dels gens i altres característiques distintives. Un cop disposem del mapa d’un genoma, la fase de seqüenciació pot avançar de dues formes: 1. Mètode aleatori del genoma complet: adopta el mateix enfoc que el procediment aleatori convencional, però usa les característiques distintives del mapa del genoma per ajudar-se a l’hora de muntar la seqüència mestre a partir de la enorme quantitat de seqüències curtes que s’obtenen. Es seqüència tot el genoma i s’ordena a l’atzar, el clonem i identifiquem els marcadors.
2. Mètode de clons contigus: en aquest mètode primer es fragmenta el genoma en segments suficientment curts per poder seqüenciar-los amb exactitud mitjançant el mètode aleatori, un cop es completa la seqüència d’aquest segment, es col·loca en la posició correcta del mapa. Aquest mètode involucra més temps però la seqüència generada és més exacta i sense errors.
Els mapes inicialment no els tenim, es van elaborant a mesura que treballem amb el genoma. Hi ha diferents tipus: - Mapa genètic: es basa en l’aplicació de tècniques genètiques per construir mapes que mostren les posicions dels gens i altres característiques de les seqüències d’un genoma. Es construeix a base de l’anàlisi de lligament, en el cas d’animals es creuen individus i s’observa si ha hagut recombinació entre els gens i en cas d’humans es miren els arbres genealògics. Es segueix l’herència dels al·lels.
Marcadors genètics (no tenen perquè ser gens):   Gens que donen fenotip visible: per a que un gen sigui útil per a l’anàlisi genètic ha d’existir com a mínim en dues formes (2 al·lels) que especifiquin un fenotip diferent. En aquest cas, es tracta d’un examen visual, ja que antigament eren els únics gens que es podien estudiar.
Gens que donen fenotip bioquímic: els genetistes van advertir que hi havia una quantitat limitada de fenotips visuals dels quals es podia estudiar l’herència i molts cops es veien afectats perquè un fenotip es podia veure afectat per més d’un gen. La solució va ser recórrer a la bioquímica, la qual ha sigut important en microbis (molt poques característiques visuals) i humans (poden basar-se en tipificació sanguínia).
Respecte als dos tipus de marcadors genètics explicats: cal saber que com més propers són dos gens, menor és la seva freqüència de recombinació, els mapes es basen en aquesta freqüència de recombinació, la qual l’estudiem un nombre de cops que siguin lògics estadísticament per tal d’obtenir resultats fiables.
 Marcadors de DNA: un mapa basat per complet en gens no és molt detallat, ja que en eucariotes els gens estan molt espaiats entre sí, de forma que es necessita un altre marcador. Les característiques que usem per construir mapes que no són gens són els marcadors de DNA, els quals com a mínim han de tenir dos al·lels per ser útils.
Hi ha tres tipus de seqüències de DNA que satisfan aquest requeriment: o RFLP (Polimorfismes de longitud de fragment de restricció): els enzims de restricció tallen el DNA en seqüències de reconeixement específiques, de forma que, una molècula de DNA, quan es tracta amb un enzim de restricció, sempre ha de produir els mateixos fragments. Hi ha alguns llocs de restricció polimorfs, on hi ha dos al·lels i un d’ells presenta la seqüència correcta per al lloc de restricció i l’altre no. De forma que l’al·lel que presenta la seqüència és tallat per l’enzim de restricció específic i el que no, no es talla, ja que no té un lloc de restricció que l’enzim pugui reconèixer.
Trobem 2 possibles al·lels.
o SSLP (Polimorfisme de longitud de seqüències simples): es tracta de seqüències repetides que presenten variacions en la seva longitud, es a dir, diferents al·lels que contenen diferent nombre d’unitats de repetició. Poden ser multial·lèlics, ja que cada SSLP pot tenir una quantitat de variants de longitud diferent.
 Minisatèl·lits: coneguts també com VNTR (nombre variable de repeticions en tàndem), on l’unitat de repetició té un màxim de 25pb.
 Microsatèl·lits: coneguts també com STR (repeticons en tàndem simples), on les unitats de repetició medeixen 13pb o menys.
o SNP (Polimorfisme d’un sol nucleòtid): 2 al·lels que varien en un únic nucleòtid en una determinada posició, si aquesta posició és reconeguda per un enzim de restricció, podria tractar-se d’un RFLP.
Aquests dos al·lels es formen a partir de mutacions puntiformes que s’han anat transmetent al llarg de diverses generacions i han arribat a trobar-se en un 1% de la població com a mínim. Per a que haguessin 3 tipus d’al·lels, s’hauria de produir una mutació en el mateix nucleòtid i que també es transmetés de generació en generació, cosa molt complicada.
- Mapa físic: un mapa genètic no acostuma a ser suficient per seqüènciar un genoma, primerament perquè la resolució d’un mapa genètic depén del nombre d’entrecreuaments que s’han evaluat. En cas de microorganismes, és senzill obtenir molts descendents en un periode curt de temps, però en el cas de la majoria d’eucariotes, el problema es troba en la dificultat d’obtenció d’un gran nombre de descendents, de forma que es poden estudiar poques meiosi i el poder de resolució de l’anàlisi de lligament és limitat. A més, presenten una exactitud limitada, ja que, tot i haver punts calents de recombinació, els entrecreuaments són aleatoris en els cromosomes. En els mapes físics, no es fan creuaments ni s’estudien herències, únicament es miren les molècules de DNA, trobem 3 tipus: 1. Mapa de restricció: es comparen les mides de fragments quan es digereix una molècula de DNA amb dos enzims de restricció diferents (reconeixen diferents seqüències diana). Com menys dianes de restricció hi hagi, més senzilla serà la construcció del mapa, a més, es tracta d’una tècnica útil per molècules de DNA que són relativament petites. Posteriorment, es fa una digestió doble, en la qual barregem la molècula de DNA amb els 2 enzims de restricció. S’obtenen dos mapes de restricció, per saber quin dels dos és el correcte, es duu a terme una digestió parcial, es a dir, amb un dels dos enzims en condicions sub-òptimes, on obtindrem una barreja de fragments a partir dels quals podrem fer deduccions.
2. De FISH: ens permet l’observació directa de la posició d’un marcador en un cromosoma o una molècula de DNA estesa. El marcador és una seqüència de DNA que es visualitza per hibridació amb una sonda fluorescent.
3. Mapeig dels llocs de seqüència identificada (STS): seqüència de 100-500bp (amplificables per PCR) fàcilment reconeixible de la qual coneixem la seqüència i per tant, podem amplificar amb PCR.
Una altre característica important és que sol es troba un cop en el genoma. Localitzem aquestes seqüències dins de la genoteca de cada espècie i sabrem en quin clon és troben i podrem trobar fragments d’un clon que es solapen amb un altre. A més, també marquem tots els clons on no hem trobat el nostre marcador. És de moment la tècnica de mapeig física amb major rendiment i que a donat lloc a la generació de la majoria dels mapes detallats de grans genomes.
Per fer un mapeig d’una sèrie de STS es requereix un conjunt de fragments de DNA superposats d’un sol cromosoma o de tot el genoma (en el cas de la foto és un sol cromosoma). La probabilitat de que dos STS estiguin presents en el mateix fragment dependrà de la proximitat d’aquests en el genoma, com més propers estiguin, més cops apareixeran junts, si estan més separats, uns cops estaran en el mateix fragment i altres no..
La distància en el mapa es basa en la freqüència amb la que es produeixen ruptures entre marcadors.
Recordem que en l’anàlisi de lligament aquesta distància es calcula a partir de la freqüència d’entrecreuaments entre dos marcadors. D’on obtenim STS? - EST (Etiquetes de seqüència expressada): seqüències expressades que s’obtenen sobretot de llibreries de cDNA - SSLP: microsatèl·lits i minisatèl·lits - Seqüències genòmiques aleatòries Els diferents mapes es complementen per tal de seqüenciar un genoma.
A partir d’aquí, coneixem la seqüència del nostre genoma, però amb això no n’hi ha prou, hem de saber què conté aquesta seqüència i com s’expressa aquest genoma.
Què conté un genoma? o - Localització dels gens: es combinen 2 tipus de tècniques.
Tècniques informàtiques: inspecció de seqüències per buscar característiques especials de les seqüències associades a gens  Escombrat de ORF (Pautes de lectura obertes): una seqüència té 6 possibles pautes de lectura (tres en una direcció i tres més en la direcció inversa) que donaran 6 possibles pèptids diferents. Ens hem de basar en el codó d’inici i els tres possibles codons de STOP, a més, ha de tenir una mida que pugui indicar-nos que es tracta d’un gen (això dependrà també de l’espècie amb la que estem treballant, cadascuna té unes longituds promig).
Problema: en eucariotes tenim introns, que són seqüències on no hi ha codons i podem confondre’ls amb un codó d’inici o de STOP. Els introns poden trencar la pauta de lectura. S’usa però s’ha de complementar amb altres tècniques. Hi ha programes informàtics que poden definir si es troba un intró o no (no ens asseguren 100%): - o Biaix de codons: ens diu que, tot i saber que tenim un codi genètic, hi ha espècies que usen de forma preferent uns codons i altres uns altres. Si un aminoàcid està codificat per tres codons, hi ha espècies que presenten preferència per un d’aquestes tres. En el gen, trobaríem els codons típics de l’espècie, en un intró en canvi no.
Biaix de codons fa referència al fet de que no tots els codons s’usen amb igual freqüència en els gens d’un determinat organisme, cada espècie té el seu propi biaix.
- Límits intró-exó: hi ha unes seqüències consens que s’han trobat a partir d’observacions. Està més definit el de upstream que el de downstream, tot i així, són seqüències consens que poden presentar variació.
- Seqüències reguladores up-stream: els gens tenen seqüències consens del promotor, si trobem aquestes, probablement el que vingui darrere sigui un gen. Exemples d’aquestes seqüències serien els límits intró-exó i illes de CpG que es troben upstream dels gens en vertebrats.
 Localització de RNAs funcionals: es basen en les estructures que formen els RNAs, aquests no tenen pautes de lectura. L’estructura del tRNA es manté per aparellament de bases (ponts d’hidrogen), hi ha 4 seqüències que són complementàries reverses, a més sabem la mida dels bucles. Molts RNAs reguladors formen estructures hairpin (hi ha programes que estimen la seva estabilitat). Ens hem de basar en la llargada de les bases complementàries, el %G-C (com més hi ha, més ponts d’hidrogen s’estableixen i més estable és l’estructura) i la mida del bucle.
 Cerca d’homologia: quan mirem les pautes de lectura d’una seqüència, mirem si alguna pauta de lectura coincideix amb un gen que ja està seqüenciat. Es pot mirar en el mateix organisme o en organismes/espècies diferents (genòmica comparativa  es busquen gens homòlegs). En cas de no trobar un gen homòleg recorreríem a l’anàlisi experimental. En aquest anàlisi, s’investiguen bases de dades de DNA per determinar si una seqüència completament nova és similar a algun gen conegut perquè, si és així, hi ha una probabilitat de que les seqüències de prova i la comparable siguin homòlogues.
 Anotació automàtica de seqüències de genomes: ordinador combina tota la informació per construir/predir on es troben els gens, RNAs i els DNA no codificants. Són programes informàtics que combinen diferents eines analítiques en un únic sistema. Així, es poden dur a terme en paral·lel diferents enfocs per la localització de gens i comparar automàticament els resultats.
Tècniques experimentals:  Proves d’hibridació: per determinar si un fragment té seqüències transcrites. Si és un gen, es transcriurà a RNA. S’agafa un grup de cèl·lules, s’extreu el RNA i tenim tot el que s’ha transcrit (tenim la informació dels gens), podem fer córrer el gen amb una electroforesi. Fem una sonda (sintetitzem la seqüència complementària coneguda sintèticament) i la marquem amb un fluorescent/substància radioactiva i fem una hibridació (tampons, temps, temperatura adequats) i per aparellament de bases es produirà la hibridació i la podrem detectar: Si tenim una banda fluorescent, significa que el gen s’està expressant perquè el trobem en el RNA de les cèl·lules, sinó, no.
A vegades hi ha gens que donen lloc a més d’un transcrit (splicing alternatiu: un sol gen que dona diverses proteïnes), un altre problema molt habitual és el de les llibreries de cDNA és que no ens donen la informació de tot l’organisme en tot el moment, ens donen informació sobre el moment en que hem extret el DNA (depèn de moltes coses). Totes les cèl·lules tenen tota la informació genètica però no l’expressen a la vegada.
És millor treballar amb DNA que RNA. La principal deficiència important en la sèrie d’instruments per RNA és l’absència d’enzims amb el grau d’especificitat de seqüència mostrat per les endonucleases de restricció, que són molt importants en les manipulacions de DNA. A més el RNA és fàcilment degradable per les ribonucleases alliberades quan es trenquen les cèl·lules durant l’extracció de RNA i que estan presents en les mans dels empleats de laboratori i tendeixen a contaminar els objectes de vidre i solucions, i això fa dificultós treballar amb ell. S’han d’adoptar procediments de laboratori rigorosos per mantenir intactes les molècules de RNA. Alternatives:   Seqüenciació de cDNA: agafem la llibreria i tot l’organisme, fem la genoteca i la seqüenciem. Es seqüencia tota la genoteca mirant si hi ha un gen o no. El problema és que depenem de la biblioteca de cDNA, com en el cas anterior.
Altres mètodes més precisos Funció dels gens: també tenim eines informàtiques i experimentals, moltes tècniques que es combinen: - o o Eines informàtiques: sobretot basades en homologia. Mirem en altres espècies si hi ha seqüències molt semblants, normalment es mira amb seqüències d’aminoàcids abans que amb DNA (perquè tenim 3 per cada codó). Softwares informàtics que fan alineaments: BLAST (bioinformàtica). A vegades petites variacions fan que la funció sigui diferent i hi ha gens que tenen funcions associades incorrectes en les bases de dades.
L’homologia pot donar-se també únicament en un fragment (domini), es poden assignar funcions a gens de malalties humanes que tenen homòlegs en Saccharomyces cerevisiae.
- Eines experimentals: Anàlisi genètic convencional: estudiem amb mutants Anàlisi reverse: mutem el gen i veiem el resultat. Es poden fer mutacions per recombinació homòloga (en llevats és possible).
 Inactivació d’un gen: tenim el gen que volem estudiar, preparem un vector on posem seqüències homòlogues als extrems de la seqüència que estem estudiant, quan hi ha la recombinació, es substitueix el que hi havia dins del gen que volem estudiar pel que hi ha al vector: tindrem un llevat sense el gen que volem estudiar. Altres cops la seqüència que hi ha entre les seqüències homòlogues del vector són marcadors (resistència a un antibiòtic). Només ens creixeran els recombinants que ens interessen.
Quimeres són organismes que són una barreja.
 RNA de interferència: serveix per inactivar gens sense eliminar-los del cromosoma. Es basa en afegir molècules de RNA de doble cadena, que s’ha vist que en organismes és degradat. És una tècnica per silencia gens. En l’anterior eliminàvem del cromosoma, en aquest cas sí que el tenim, però el RNAm es degrada. C. elegans.
 Tècniques per sobre-expressar gens: Es pot provar amb medis diferents, diferents condicions en el cas que no s’observin canvis en el fenotip (pot ser que no n’hi hagi, perquè hi ha gens que tenen homòlegs que els supleixen en cas que els primers siguin danyats).
...

Comprar Previsualizar