Tema 2: Expresión génica en bacterias (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Microbiología Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 23
Fecha de subida 04/10/2017
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Tema 2. Expresión génica en bacterias.
¿Diferencia más significativa a nivel de expresión génica en una bacteria cuando lo comparamos con una célula eucariota? En procariotas la transcripción y la traducción están acopladas. Como los procariotas no tienen membrana nuclear, la célula puede hacer a la vez la transcripción y la traducción del RNA.
La RNA polimerasa va transcribiendo el RNA, se va enganchando a los ribosomas y se va traduciendo. Nos permite hacer gran cantidad de sistemas de control de la expresión.
• Codón de inicio en bacterias y eucariotas: AUG (ATG). Según la especie hay un • codón de inicio en el RNA que es el GTG.
Tenemos también una estructura que es un terminador de la transcripción. El bucle que se encuentra al final del RNA mensajero (en el 3’).
Codones de stop: 1. Ámbar = UAG (el investigador era sueco y su madre se llamaba así xd) 2. Ocre = UAA 3. Sepia = UGA (en mutantes de drosófila porque hacía que los ojos de las moscas tuvieran un color sepia o color ocre).
• Antes del codón de inicio de la traducción, hay un RBS, ¿qué es? Ribosom binding site: lugar de unión a los ribosomas. Muy importante en bacterias.
Inicio de la transcripción: (¿el primer nucleótido se traduce o se transcribe? Se transcribe.) El primer nucleótido que se transcribe se dice que está en la posición +1.
Normalmente es una G o una A . Tenemos una región promotora que ahora comentaremos.
Ribosome binding site (o Shine dalgarno): porque es el nombre del primer artículo en que se ha identificado esta región): tiene una secuencia consenso, es la que interacciona con el mRNA ribosomal (el ribosom bingid site).
• Cistrón: viene de la química orgánica, al juntar cis y trans (en cis: los radicales están en el mismo plano y los trans: los radicales están en distinto plano) Función: ser sintetizado en forma de prote o RNA y que como prote o RNA actúa, y, por lo tanto, puede complementar los defectos de una mutación que pueda tener la célula. En general, la mayor parte de genes que codifican protes en bacterias se pueden codificar por cistrones En general un cistrón se puede entender como un gen, o como una secuencia de ADN que será transcrita a ARN y traducida para dar lugar a una proteína.
A veces hay excepciones: gen tRNA del microrganismo Micoplasma pneumoniae. El círculo rojo, el gen tRNA, si lo transcribimos aparecerá la cadena complementaria. La región en rojo es la región del anticodón del tRNA. Hacemos la reversa complementaria del TCA: UGA = sepia Esto quiere decir que micoplasma pneumoniae, por ejemplo, tiene tRNAs en sus ribosomas que codifican un codón capaz de reconocer un anticodón sin sentido. Podemos colocar delante de un codón sepia un aminoácido y el codón de stop no será de stop (no indicará fin de la transcripción). No es que sea mutante, es de forma natural. Esto tiene una importancia grande. Si queremos sintetizar en E. Coli una prote de M pneuominae es posible que esté el triplete sepia, pero no como triplete de finalización sino como triplete codificante. Si lo colocamos en E. coli, ¿coli es capaz de reconocer un RNA sepia? No, entonces cabe la posibilidad de que esta prote de micoplasma no se exprese bien.
1. No todas las bacterias no tienen tRNAs capaces de reconocer un codón sin sentido.
Nota: codón sin sentido se refiere a un codón de terminación que la célula no reconoce que es de terminación.
2. Tiene importancia biológica porque en las bacterias capaces de reconocer un codón sin sentido puede afectar a la capacidad de producir protes heterólogas en E. Coli.
Tabla.
La importancia de la región Shine-Dalgarno: marcada en rojo se indican unas mutaciones en las regiones correspondientes a la región shine dalgarno del gen en concreto. Los efectos sobres la expresión (son ejemplos pero no aprender). En la región cambiamos una C por un Uracilo o una A, tenemos en rojo “up”, aumentamos la producción de la transposasa (por ejemplo), porque esta región es donde se engancha el ribosoma (la shine dalgarmo) si en esta región cambiamos la C por U, los ribosomas se enganchan con más eficiencia a esta región. Entonces ¿aumenta o disminuye la taxa de traducción? Aumenta. Modificando las regiones shine dalgarno podemos aumentar o disminuir la síntesis de proteínas.
Modulamos la síntesis de proteínas al regular la eficiencia de unión al ribosoma.
En bacterias desde el punto de vista de la expresión génica hay dos tipos de regulación: 1.
Negativa: una molécula llamada represor: inhibe, bloquea, disminuye la transcripción.
Hay una región específica a la que se engancha el represor que se llama “operador”.
Cuando inhibimos prácticamente no hay expresión. Hay dos tipos de controles negativos: 1.1.Inducción: operón lactosa, la molécula reguladora, como es un control negativo, será un represor, ¿por qué por inducción? El operón lactosa, cuando no hay lactosa, el represor se engancha a la región operadora y queda bloqueado. La lactosa interacciona con las moléculas del represor que se encuentran en el citoplasma y hay un desplazamiento del equilibrio químico y las moléculas del represor que estaban enganchadas al DNA se desplazan. La lactosa colabora a inducir el sistema, negativo porque hay un represor.
1.2.Represión: tenemos un represor porque es control negativo. El represor para engancharse al operador necesita que alguno le ayude, tiene el nombre genérico de corepresor (el amarillo), el corepresor se combina con el represor y estas dos moléculas unidas se enganchan a la región operadora.
El operón lactosa es un operón que se utiliza para degradar la lactosa, por lo tanto los operones implicados en la degradación acostumbran a tener un control negativo por inducción.
El operon triptófano está implicado en la biosíntesis de triptófano, si hay triptófano en el medio a la célula no le conviene sintetizar protes que intervengan en sus síntesis. Por tanto los operones biosintéticos tienen un control negativo por represión: colaboran en la represión del sistema porque como ya tenemos lo que queremos no hace falta que haya más.
2.
Situación intermedia: cuando modulamos la transcripción, en determinadas situaciones podemos aumentar y en otras disminuir, esto da lugar a los atenuadores.
3.
Positiva: una molécula llamada activador estimula la transcripción. El activador se engancha a una región específica del DNA (que no es el operador). Hay dos tipos de control positivo: 3.1.Inducción: hay una sustancia que participa en la inducción también. Tenemos un activador: molécula que activa en el DNA, activan la transcripción, no en el operador, en otra especifica. Hace falta un inductor, se forma la pareja que interacciona en una secuencia especifica. La molécula pequeña ayuda a estimular la transcripción, por eso inducción. (Operón arabinosa).
3.2. Represor: La prote activadora por si sola puede interaccionar con su secuencia específica y estimular la transcripción. Además, hay una molécula pequeña (corepresor) que puede interaccionar con el activador y hace que no se pueda unir al DNA entonces y no estimula la transcripción. Inhibe la función del activador.
Pensar: ¿la molécula pequeñita colabora en activar o inhibir la síntesis? En el inductor, activar y en el represor, inhibir.
Siguiente gráfica: localización física de las regiones reguladoras: hay un represor que se engancha al operador en el negativo y en el positivo un activador que se engancha a una región especifica.
Tenemos las coordenadas de genes a partir de la posición +1 (del primer gen que se transcribe!!) valores negativos a la izquierda del +1, son nucleótidos que no se transcriben (en teoría) ¿Hay regiones operadoras más allá del primer nucleótido que se trasncribe? Sí. (más positivas, después del primer nucleótido que se transcribe). Cuando pensamos en una estructura de control negativo, nos olvidamos de lo que sucede con el operón lac, porque puede haber un operador más allá de la región +1 (en el operón lac no). Los activadores prácticamente siempre se encuentran antes de la región -20, antes de los 20 nucleótidos que se encuentran antes de la posición +1.
16/02/17 Diferencia entre cistrón y ORF.
• • Cistrón: fragmento del DNA que da lugar a un producto funcional ya sea DNA o proteína.
Un ORF: es la parte que se traduce al final a proteínas, necesita un triplete de inicio de traducción y uno de fin de traducción. ORF= proteína que vamos a fabricar. Es un codón de inicio y uno de final, eso es un ORF, también hay unos cuantos RNAs reguladores PERO no se traducen, simplemente están en la célula.
No se traduce porque su función no es una proteína, es actuar como RNA regulador, por tanto no es un ORF.
Conclusión: Cistrones: dan lugar a RNA reguladores + proteínas ORF: dan lugar a proteínas, RNA reguladores no porque no se traducen.
Localización física de las regiones reguladoras.
Las regiones operadoras (inhiben) pueden estar más atrás de la posición +1, pero también después. Las activadoras (estimulan) están antes de la región +1. Un represor es una proteína que inhibe la transcripción.
Nombre de gen que actúa como operón lac: LacI. Codifica al represor del operon lac. Se engancha al operador e impide el proceso de la RNA polimerasa. Peeeeeero, a veces sí y a veces no. Hay diversas posibilidades mediante las cuales los represores inhiben la transcripción: 1. El represor se encuentra en una región más allá del promotor y bloquea.
2. Cuando se engancha al RNA no bloquea la RNA polimerasa, si no que bloquea el acceso de RNA polimerasa al promotor. Hay una prote represora que nos impide reconocer al promotor (¿) 3. Un activador estimula la transcripción. Hay represores que se enganchan al operador del represor y coincide con la región física del activador. Si el represor se engancha a donde se tendría que unir el activador, el actividad no se unirá e inhibiremos la transcripción. No siempre los represores impiden la progresión de la RNA polimerasa.
Cuando un represor bloquea un operador por cualquier método de los 3, diremos que el sistema está inhibido o reprimido porque es control negativo, ¿quiere decir que NO HAY NADA DE EXPRESION? ¿Abolimos totalmente la expresión? ¿No podremos fabricar más RNA mensajero? No. (examen!) Cuando hay un control negativo NUUUUUUUNCA hay una abolición total de la expresión de este gen cuando un represor está inhibiendo. Siempre queda una expresión residual llamada nivel basal de expresión. Podemos escuchar “El operón lac cuando está siendo reprimido tiene una expresión basal de tanto”. Aunque el sistema esté reprimido fabricamos RNA mensajero. Si estamos reprimiendo el sistema, ¿cómo se puede fabricar este RNA residual que se fabrica? ¿A qué se debe esta expresión basal? La expresión basal es debida a 2 cosas: 1. Dinámica reversible: el represor no se engancha de forma irreversible (son interacciones por van der Waals, es reversible).
2. Replicación cromosómica.
Cuando reprimimos negativamente un gen SIEMPRE hay una expresión!!! Dinámica reversible.
Los represores son dinámicos. Tenemos un operador, se engancha el represor en los Open Reading Framess (ORF). (completar) Hay un desplazamiento, el represor que estaba unido se desengancha y el operador ya no está ocupado, la RNA polimerasa puede acceder al operador y hacer transcripción. Supósito donde se puede producir esto: degradación de represión libres, por ejemplo, ¿otro más fácil? División. Las células bacterianas se dividen, y cuando lo hacen se reparten de forma equimolar todo lo que hay dentro, pero a veces hay errores y una célula puede que reciba más cantidad de una det prote que otra. Si una célula se encuentra más represores citoplasmáticos de los que les tocaría (tendrá menos transcripción), la otra célula tendrá menos represores (es debido a que existe un equilibrio químico). Entonces habrá tendencia a que se separe el represor del operador (¿cuándo hay más o cuando hay menos?), menos, tendremos el operador libre e irá la RNA polimerasa.
Replicación cromosómica.
Replisoma: DNA polimerasa 3, helicasa… función abrir el DNA e ir copiando. Esta región se está replicando, el replisoma abre el DNA, los represores que están enganchados saltarán, si saltan los represores mientras estamos replicando, como sabemos, el acoplamiento entre transcripción, traducción y replicación en procariotas. La DNA polimerasa está replicando y antes de que vuelvan a engancharse los represores, en la parte ya replicada puede engancharse una RNA polimerasa y comienza a transcribirse formándose RNA mensajero.
Hay un nivel de expresión basal debido a la separación de los represores.
Son dos explicaciones de la expresión basal que siempre se da en cualquier sistema controlado negativamente.
En bacterias existen dos tipos de unidades transcripcionales: 1.
Monosintrónicas: el RNA que estábamos transcribiendo (transcrit) contiene una única ORF.
2.
Polisintrónicas: el transcrit (la unidad transcripcional) contiene más de un ORF ( pued llegar hasta 14 o 15 ORF diferentes).
Arriba: Tenemos una unidad funcional monosincrónica: promotor, atg, orf, terminador y codón de traducción: ocre (TAA).
Abajo: unidad polisicronica: hay varias atg, orfs.
¿Qué interés tiene esto? Vemos la polisincrónica, los 3 codones de fin de traducción, ¿tienen un efecto sobre la expresión de todo el sistema? Sí. Efecto polar sobre la traducción. OSO = POLO NORTE.
EL SUR ES DIFERENTE, HAY DOS EFECTOS POLARES, ya veremos.
Tenemos una unidad polisincrónica: la RNA polimerasa se engancha al promotor, empieza a transcribir y la RNA polimerasa, continua y llega a un triplete que es final, de sentido, cuando el ribosoma llega aquí acaba la traducción y el ribosoma lo que hará es irse. Acaba la traducción y se va. La RNA polimerasa continua a su bola caminando y continua fabricando RNA mensajero, pero no hay ribosomas!! Porque cuando acaba la traducción su tendencia es desaparecer. ¿Consecuencia de esto? Hemos fabricado proteína del r1 (¿orf?), prácticamente ninguno del rc2, y del 3 todavía menos. Conclusión: cuanto más lejos se encuentra un gen del promotor, menos cantidad de proteína fabrica = efecto polar, hay una polaridad sobre la traducción.
Esto es un desastre para la célula, fabricamos menos proteína 2 y todavía menos proteína 3, necesitamos inhibir este efecto polar. ¿Cómo lo haríamos? Este efecto es debido a que los ribosomas marchan, debemos conseguir que los ribosomas no se vayan. ¿Cómo hacemos? Las regiones shine dalgarno (RBS) tienen como función interaccionar con el ribosoma y hacer que se enganchen, por tanto, continuarán teniendo la afinidad con el RNA mensajero y son se irán.
Hay otra secuencia RBS ( en el punto 2 y en el 3) ¿por qué? Porque cuando llegue el ribosoma a la segunda, no puede colocar nada porque es un codón sin sentido pero no salta y se va, se encuentra un ribosom binding site, se queda el ribosoma. Luego de la región RBS encontramos un codón de inicio de la tranducción (ATG), volvemos a montar toda la estructura de inicio de la traducción. Cuando lleguemos al prox codón de fin de traducción pasa lo mismo, debería saltar pero hay un RBS, se queda retenido e inmediatamente después encontramos un ATG que es un codón de inicio de la traducción. Cuando llegamos al final no hay ningún ribosom binding size porque no hace falta. El ribosoma se desenganchará porque no hace falta que traduzcamos nada más porque ya hemos traducido las tres ORF de la unidad transcripcional.
El efecto polar al efecto de la traducción debido a la distancia entre un ORF y el promotor.
La región del operón arabinosa: TGA (sepia), después tenemos una región típica de ribosom binding site AGGA, nos quedamos por afinidad, y luego vuelve a empezar la traducción . El efecto polar se puede paliar gracias a la presencia de RBS internos en unidades funcionales bacterianas polisincrónicas.
Tenemos RNA polisincrónicos con RBS desde la primera. Esto tiene otra implicación. El hecho de que en un RNA ribosómico haya regiones internas shine galgarno tiene una consecuencia: según cual sea el plegamiento (estructura secundaria) del RNA mensajero puede que una parte de la región shine dalgarno quede expuesta al exterior, ¿qué sucede si esta secuencia del medio queda expuesta al exterior? El ribosoma la puede reconocer y comienza a traducir en esa parte (que puede que sea el tercer punto por ejemplo) en vez de empezar en el primer ORF. Dependerá del plegamiento secundario y la ¿. Directamente desde el interior podemos traducir un shine delgarno en una unidad polisincronica.
Promotores bacterianos: donde está la RNA polimerasa y comienza la transcripción. Región -35, región -10. Lugar de inicio de la transcripción: 1 site start. Aprox 10 nucleótidos antes, hay una región en la que se engancha la RNA polimerasa, aprox a -35 hay otra región, y estas dos regiones forman el promotor porque permiten la unión de RNA polimerasa en este punto. Y, por lo tanto, de inicio de la transcripción. De forma genérica, entre la posición +1 y la -10 acostumbra a haber entre 5 y 9 nucleótidos y entre la -10 y la -35 acostumbra a haber 17, y esto forma el promotor. En E. Coli la frecuencias consenso son esas, pero no aprender. La presencia de estas dos secuencias con las distancias que hemos comentado hace que sean un promotor y que la RNA polimerasa lo reconozca.
• Tipos de promotores: 1.
Fuertes: tiene mucha afinidad por la RNA polimerasa, se enganchan muchas moléculas de RNA polimerasa y habrá una transcripción elevada.
2.
Débiles: no se engancha con mucha frecuencia la taxa de transcripción es baja.
Pueden tener mutaciones, como cualquier familia de DNA, hay dos bloques: 1. Bloque 1 -> promoter up: mutación en la región promotora que aumentará la afinidad de la RNA polimerasa por tanto habrá más transcripción del mutante.
2. Bloque 2 -> promoter down: disminuye la afinidad de la RNA polimerasa con el promotor disminuye la transcripción.
¿Todas las especies bacterianas tienen las mismas secuencias -35 y -10? NO.
¿Cómo puede afectar que una bacteria tenga la misma secuencia o diferente? Por el porcentaje GC.
• • E. Coli tiene un porcentaje de citosina-guanina del 50%. (Deberíamos recordarlo porque en laboratorio se utiliza muchíiiiisimo en biotec) Pseudomonas aeruginosa: gram -, cual es el % de C-G? 64%, estadísticamente en el cromosoma de pseudomonas hay mas cg que en e. coli, si la secuencia consenso en e coli es TTGACA y TATAAT, en pseudomonas habrá más C-G que no en el cromosoma de E. coli. Si cambia el % de C-G, la RNA polimerasa de E coli que reconoce esta secuencia difícilmente reconocerá la secuencia de pseudomonas (y viceversa). Hace que genes de pseudomonas puedan no expresarse en E. Coli y viceversa (con las consecuencias en las producción de protes).
Secuencias consenso en pseudomonas: TATCTC N17 TAGGCT. Muchas veces las RNA polimerasas de estos dos bichos no son intercambiables.
 Metilasa DAM: metila las regiones de GATC. No está presente en todos los grupos bacterianos. En otro organismo, clorobacter, tenía otra metilasa, la ccrm.
La función de la metilasa es inhibir la unión de prote DnaA al origen de replicación y alargar el tiempo de replicación. Las secuencias de metiasas de este estilo tb participan en la región de expresión génica y la reparación de errores y lesiones del RNA. Ahora nos cenraremos en la participación en la región de expresión génica.
Antes del promotor tenemos dos regiones del GATC que son sustratos de la metilasa dam.
Tenemos un represor que se engancha a un operador, casualmente desde el punto de vista evolutivo, hay dos regiones de GATC y la interacción del represor con el operador requiere que los radicales metilo del GATC hagan de puente entre el DNA del cromosoma y el represor. Cuando están metiladas el represor se engancha y no hay expresión.
Esto es imprescindible, por tanto, si tenemos un mutante DAM, las regiones de GATC no estarán metiladas y como el represor requiere el radical metilo , no se podrá enganchar al DNA y el sistema no estará reprimido. Hay operadores que requieren para su funcionamiento la metilación de las secuencias DAM!!!! Estamos hablando de represeores pero tb pasa lo mismo con los activadores.
Algunos activadores necesitan que las secuencias GATC estén metiladas para que pueda haber expresión. Si hay un mutante DAM, la adenina no estará metilada, el activador no se puede enganchar y no tendremos expresión.
Conclusión: GATC metilada (la metilasa no es un mutante) si actúa un represor no hay expresión y cuando actúa un activador hay expresión. Si GATC no está metilada, al engancharse el represor habrá expresión y al engancharse el activador no habrá expresión.
Cuando hablamos de activadores y represores debemos tener en cuenta la posible importancia de las metilaciones a través de la metilasa que estén presentes en el DNA. Peeeero, no quiere decir que todos los represores ni todos los activadores necesiten interaccionar con la región metilada, pero hay una variabilidad, algunos si y otros no.
Promotores: no siempre siguen el modelo típico del operón lac.
1. Promotores continuos. Cuadradito: unidad transcripcional que puede ser monosincrónica o polisincrónica, el codón de stop forma parte de esta unidad transcripcional, después hay un terminador. Antes hay dos promotores. ¿Esto para que nos sirve? ¿Para que le puede servir a esta unidad transcripcional tener dos promotores antes? Recordemos que la región -35 y -10 atraen la RNA polimerasa, entonces, hay dos promotores que atraen la RNA polimerasa, por tanto aumentaremos la eficiencia de unión de la RNA polimerasa. Aumentando los promotores continuos habrá más transcripción del sistema.
2. Hay 2 promotores solapados: podemos regular que en unas condiciones la RNA polimerasa se enganche al promotor 1 y otras al 2, podemos discriminar promotores para transcribir desde el promotor 1 o desde el promotor 2 (los de antes eran promotores iguales, estos son diferentes).
3. Promotores enfrentados. Tenemos la unidad transcripcional hacia la izquierda ¿para que nos sirve? Si unimos RNA polimerasa y va hacia la izquierda, la RNA polimerasa que vaya hacia la derecha puede verse dificultada (y viceversa, se dificultan entre sí) Esto se traduce en que si enganchamos una RNA polimerasa en el P2, hacia la izquierda, dificultamos y, por tanto, INHIBIMOS la RNA polimerasa que va hacia la derecha, es un sistema disyuntivo.
Jugando con la disposición física de promotores podemos modificar las transcripciones de unidades transcripcionales, por tanto, no todo es como el dibujito del operon lac, hay muchas formas de ordenar estos parámetros.
17/02/17 Ejemplos de organizaciones de los promotores (que ya comentamos).
1.
2.
3.
4.
Continuos Solapados Enfrentados Opuestos: unidades transcripcionales, uno va a la derecha y otro a la izquierda.
¿Ventaja de este sistema? Como son promotores adyacentes mirando a direcciones diferentes, ambos promotores pueden tener el mismo operador, que actuarán modulando o regulando (regulador o modulador).
5. Según cual sea el modulador o el regulador, según las condiciones ambientales, podemos fabricar varios cistrones o uno.
Incrementar los mecanismos de regulación de la expresión.
La RNA polimerasa (holoenzima) reconoce la región -35 y -10, que pueden variar según el grupo filogenético en base al porcentaje citosina guanina, y tiene consecuencias en la posible expresión heteróloga de protes (tenía puesto genes ¿?) Cuando la RNA polimerasa reconoce esta región se engancha de forma no covalente en esta región y le provoca una curvatura a la región. Esta unión y la curvatura son fundamentales.
Cuando la prote DnaA interacciona con las cajas hay una curvatura, se abre y entra el replisoma, aquí pasa más o menos lo mismo. Se forma una curvatura en el DNA y esta curvatura hace que se abra y la RNA polimerasa comienza a transcribrir el DNA. Curvatura adecuada para abrir el DNA y empezar a transcribir RNA.
Alrededor de las regiones -35 y -10 hay otras secuencias.
1. Antes está la UPS: (UP=superior, s = secuence) 2. Después está DS: downstream.
Regiones cuya función es colaborar en la unión de la RNA polimerasa (no provocar!!! Las que lo provocan es la -10 y -35). Con el objetivo de conseguir la curvatura adecuada que permita la obertura del DNA. No tienen una secuencia específica, dependen de cada DNA.
Hablamos del inicio de la transcripción y estamos diciendo que es fundamental la curvatura.
¿Diferencia entre la imagen de la izda y derecha? • • IZQUIERDA: la interacción de la RNA polimerasa es lo suficientemente adecuada para que se forme la curvatura necesaria para que se abra el DNA. es un promotor ideal ya que no necesita de nadie para tener la curvatura adecuada.
DERECHA: vemos que hay más proteínas (A y B), cuando la RNA polimerasa reconozca la región -35 y -10, por si sola es incapaz de provocar la curvatura adecuada para que se pueda abrir el DNA. Entonces, difícilmente tendremos transcripción. Hay situaciones como esta en las que hacen falta proteínas adicionales (A y B) que colaboran con la RNA polimerasa para interaccionar con el DNA y para provocar la curvatura adecuada y permitir la transcripción. ¿Qué ventaja que puede tener la participación de otras protes como la A o la B? Puedes unir o conectar factores externos con protes concretas que participan en el proceso de obtención de la curvatura adecuada. Factores externos: oxigeno, Ph, presencia de nitratos…etc. Por tanto, este sistema no es autista, puede conectar con su entorno y es una ventaja.
Ejemplo: Proteína FIS: induce curvaturas, en la transcripción se necesita la entrada de la RNA polimerasa pero no solo eso, tb la unión de la prote FIS. Mutación promoter up (aumenta la afinidad de la tasa de transcripcion del sistema). Tenemos el secA, no tiene nada que ver con el gen del que ya hemos hablado que era la prote que segrestaba las regiones hemimetiladas), este gen actúa en el proceso de secreción. Entre -35 y -10 eran sobre 17, y ahí hay 30. Cuando la RNA polimerasa reconoce la región -35 y -10 no consigue engancharse bien y no consigue la curvatura adecuada, hay dos protes que ayudan reconocen dos secuencias específicas y provocan una curvatura en esta región y topológicamente (no físicamente) reducen la distancia entre las regiones -35 y -10, así la RNA polimerasa puede engancharse, reconocer las dos funciones e iniciar la transcripción.
Abajo tenemos un mutante que en estos momentos tiene una distancia de 17 (sufrió una deleción), no solo topológicamente tb físicamente, es una distancia similar a la distancia standart, la RNA polimerasa puede reconocer e interaccionar con ambas regiones aumentando la transcripción, es un ejemplo de mutación promoter up.
RNA polimerasa.
Hemos hablado de un gen que es el Dnag que codifica una RNA polimerasa y que esta codifica un enzima que era una primasa. Esta RNA polimerasa (la primasa) es la encargada de sintetizar los primers PERO no tiene nada que ver con la RNA polimerasa de la transcripción (transcripcional). Esta RNa polimerasa es un holoenzima (enzima que tiene diversas subunidades, como la RNA polimerasa III) y está implicada en la síntesis de protes tb.
Nombres de las subunidades: 1. Subunidad beta: une los nucleótidos, es la que tiene actividad catalítica.
2. Subunidad beta prima: se engancha a la cadena molde y colabora con la interacción.
3. Subunidad alfa: interacciona o se une con el promotor (porque no es la que reconoce!!!) 4. Subunidad sigma: reconoce al promotor (ver dibujo).
Estructura clásica de una RNA polimerasa bacteriana.
Las 3 primeras forman lo que se denomina el núcleo, tiene: 1. UNA subunidad beta 2. UNA subunidad beta prima 3. DOS subunidades alfa.
A parte tenemos la subunidad sigma que reconoce al promotor (la región -35, -10 ) y permite que se enganche todo el complejo.
Ciclo.
La subunidad sigma reconoce el promotor, se engancha al núcleo de la RNA polimerasa, y el complejo nucleo + sigma provoca la curvatura que hemos comentado, esto determina la obertura del DNA y a partir de aquí comienza la copia. Una vez comienza la copia (la transcripción) la subunidad sigma se va (ya ha hecho lo que quería, abrir), se va a buscar otro promotor, se desengancha del sistema. La consecuencia inmediatamente es que quien hace toda la transcripción sea el nucleo de la RNA polimerasa (la sigma no).
¿Qué determina la unión al promotor? Sigma, ¿todos los promotores de las células bacterianas e expresan siempre o tienen conexiones con el entorno? Conexiones.
Familias de factor sigma y familias de frecuencia consenso en la tabla.
Sigma 70, en bacterias, porque tiene un peso molecular de 70 kdalton. Reconoce las secuencias -35 y -10 (con el spacer), pero hay otros factores sigma que reconocen otras cosas.
Ejemplo 1: el 38 en el gen RpoS. Se llama factor de fase estacionaria, ¿qué quiere decir? Las células en estado estacionario, ¿qué hacen? Hacen otras cosas diferentes que en fase exponencial porque cambian las condiciones por la diminución o aumento de presión parcial de oxígeno, agotamiento de nutrientes… etc Deben adecuar su fisiología: cambiar el factor de expresión génica, debemos readecuar la expresión de los genes. Debemos cambiar el factor sigma que reconoce a los promotores que se habrán de expresar en fase estacionaria. El gen RpoS (Rpo= RNApolimerasa, stacionary) Ejemplo 2: síntesis de flagelos, no siempre están fabricando flagelos, no los fabricará si no es necesario, cuando las condiciones sean buenas aparecerá un factor sigma 28 codificado en FliA y fabricaremos flagelos para por ej uir de Ph ácido (condición deletérea).
Ejemplo 3: proteínas que fabrica la célula para reparar las lesiones que se puedan producir en el DNA. Como consecuencia del aumento de la temperatura, por ejemplo.
Ejemplo 4: ¿Tamaño de la espora de E. Coli? No tiene esporas xd. NO HABRÁ FACTOR SIGMA QUE SE ENCARGUE DE esporar a e coli.
Clostridium o bacillus subtilis sí tienen, hay un factor sigma que van conectando paulatinamente unos genes que tienen como objetivo que se forme la espora. Cuando cambiamos un factor sigma podemos provocar que se expresen los genes, cambiarán las regiones -35 y -10.
Degradación (turnover) del RNA bacteriano.
Muy importante tenerlo claro para hablar de sistemas de control de la expresión.
¿Vida media estándar del RNA mensajero de E. Coli? 4 minutos. Hay de más y de menos pero esa es la estándar.
¿Cómo se degrada y por qué? Porque como son merquelianos xd degradamos nucleótidos que pueden ser utilizados para formar más RNA mensajero. Se degradan debido al degradosoma (si el replisoma son protes implicadas en la replicación, el degradaosoma es lo mismo pero degradación) no aprender las RNAsas. Empezamos degradando RNA, como consecuencia de esta degradación haremos fragmentos que serán procesados por el resto de ribonucleasas que podrán formarse.
¿Gracia de la transparencia? Xd hay dos tipos de ribonucleasas: 1. Tipo 1: endoribonucleasas: cortan una estructura interior de RNA mensajero.
2. Tipo 2: exoribonucleasas: degradan a partir de extremos libres RNA mensajero traduciéndose que tiene muchos ribosomas, tener muchos ribosomas dificulta la actuación de las ribonucleasas porque tienen una conformación secundaria. La vida media de RNA mensajero subirá. Cuanto más traducido esté, más afinidad tendrá un RNA por los ribosomas y más prolongaremos la vida media (estamos hablando de ribosom binding sites etc).
¿Cómo más podemos proteger los RNA? Con ribosomas, pero tb con otras cosas. Hay RNA mensajeros que tienen unas estructuras denominadas bucles “loops”. Cuando tengamos estructura en forma de loop en un RNA, dificultará la entrada de exonucleasas y más grande será la vida media.
Conclusión: podemos jugar con con la taxa de traducción y con las estructuras secundarias que pueda haber (mediante ribosomas y loops).
La Ribonucleasa E es ENDO y reconoce una secuencia específica. Si reconoce una secuencia interna puede pasar que se rompa el RNA mensajero y de tener dos extremos libres podemos pasar a tener 4 (dibujo de abajo).
Bacteria Rhodobacter spharoides: gram – alpha proteobacterias, caracterizado por ser fotosintético, utilizado para fabricar carotenos e hidrógeno. Como es fotosintético tiene carotenos y clorofilas bacterianas empaquetados en el centro de reacción para hacer todos los procesos energéticos cuando les llega luz. En el centro de reacción se encuentra la bacterioclorofila que captará la luz y formará las cadenas de electrones, hay unas protes que compactan la bacterioclorofila. Abajo tenemos la estructura de lo que sería el centro reactivo, de las protes que empaquetan y compactan la bacterioclorofila. Tienen diferentes proteínas (4): 1. Blancas 2. Negras (pequeñas) 3. Rayas horizontles 4. Rayas verticales.
(grandes) Estequiometría en el dibujo de abajo: protes pequeñas blancas y negras, hay una relación equimolar entre ellas y de las grandes también, pero la relación entre protes grandes y pequeñas no es equimolar, hay muchas más protes peques. La célula (muy merqueliana) busca un mecanismo para fabricar más protes grandes pero no más de la cuenta.
¿Cómo hacemos? Parte de arriba. Estructura de la unidad transcripciónal “puf”, codifica los 4 genes que determinan la sínstesis de la prote grande. Tenemos prote B y A que son las peques, luego tenemos la L y la M que son las grandes. Luego tenemos el terminador transcripcional. Tenemos un promotor y a partir de este promotor fabricamos un ÚNICO RNA mensajero y a partir de aquí fabricamos todas las protes que están en el centro reactivo, ¿problema? Con este promotor así fabricaremos la misma cantidad de protes peques que grandes, esto no interesa. Queremos las mismas peques que grandes. ¿Cómo lo solucionamos? Siguiente diapo.
Q nos olvidamos.
Chupachups xd 3 de coca cola y uno de fresa, se llaman estructuras estabilizadoras de RNA mensajero. Son bucles que hacen que ni las exo ni endo ribonucleasas puedan acceder. Baja la eficiencia de reciclaje de fragmento de RNA. Baja la mRNA polimerasa y fabrica una única molécula de RNA mensajero, la vida media es de medio minuto.
PERO resulta que el RNA mensajero tiene una región de reconocimiento de la ribonucleasa E (que era endo!!!) Fabricamos RNA mensajero y vamos fabricando ribosomas, pero hay una región interna muy expuesta al exterior. Corta y como no hay bucle donde pone mRNA puede degradar este fragmento, llega al chupachups de coca cola y se va. La ribonucleasa E corta dentro y generamos extremos libres. Esta segunda especie de rNA tiene una vida media más grande que la anterior. Lo que obtenemos es un fragmento de DNA de 0,5 k que codifica las protes pequeñas B y A y tiene una vida media de 33 min.
Gracias a la combinación de la actuación de ribo y exo con la presencia de loops que protegen determinadas regiones del DNA, hemos conseguido un RNA grande de vida media 0,8 min (con protes peques y grandes) y uno pequeño de 33 min (peques) ejemplo de control de síntesis de la composición del centro de reacción.
Un terminador de transcripción es un bucle. A medida que traducimos RNA grande vamos formando fragmentos de RNA de los dos de abajo. Los bucles dificultan mucho la entrada de ribonucleasas.
Pequeño esquema donde están velocidades de transcripción, traducción y replicación en diferentes condiciones de cultivo etc (no aprender).
Complejo de traducción- transcripción, la RNA polimerasa estará haciendo transcripción y detrás (darrere) los ribosomas haciendo traducción. Podemos hablar de velocidad y de distancia que hay entre el complejo de transcripción. rna polimerasa y traducción (ribosomas) esta distancia es fundamental. Pueden haber factores que intervienen en bloquear o estimular la traducción. La RNA polimerasa irá por davant de los ribosomas pero cualquier elemento que ralentice o acele re la transcripción puede hacer que haya menos o más distancias descubiertas entre los dos.
¿Cómo? Requerimientos necesarios para que finalice la transcripción: 1. Aminorar la velocidad de la RNA polimerasa (sino no la podemos separar) 2. Desplazar la RNA polimerasa del DNA.
El orden de factores no altera el producto xd puede producirse cualquiera de las dos primero).
¿Cómo hacemos? Cuando se forma un bucle, la formación de un bucle comporta una disminución de la v de translación de la RNA polimerasa, ¿cómo la desplazamos del DNA? Dos métodos: 1. Prote RHO 2. Tendencia a la regeneración de DNA de doble cadena (tiene tendencia a cerrarse cuando lo abrimos) A partir de aquí hay dos tipos de mecanismos de finalización de la transcripción: 1. Isa: hay un sistema que utiliza la prote Rho (Rho dependiente) 2. Dalawa: no utiliza la prote Rho.
Jueves no hay clase.
20/02/17 Reflexión antes de hablar del fin de la transcripción: Tenemos la obertura del DNA durante el proceso de replicación, ¿qué mecanismo siguen las células bacterianas para evitar que una vez abrimos el DNA de doble cadena se vuelva a cerrar? Helicasa abre, viene SSB y estabiliza el DNA!! Una vez abrimos el DNA interaccionan con el DNA de cadena sencilla y hace que no se cierre.
¿Qué pasa cuando hablamos de obertura del DNA para transcripción? Aquí ya no participan las SSB. ¿Quién hace esta tarea? Los ribosomas. En bacterias, como sabemos, la traducción y la transcripción están acopladas. A medida que se transcriben los ribos se enganchan y van traduciendo y dificultan la tendencia innata del DNA de cerrarse. Desde este punto de vista, las protes SSB a nivel de replicación son equivalentes a los ribosomas a nivel de transcripción. Si los ribosomas desaparecieran no habría ningún otro impedimento. Además de sintetizar protes también estabilizan el DNA.
Fin de la transcripción.
Bucle, estructura típica que podemos encontrar en el DNA, hay de muchos tipos. Algunos bucles son los que actúan como terminadores de la transcripción, pero no todos. Lo que sí podemos decir es que todos lo terminadores de transcripción son bucles. Son estructuras palindrómicas del DNA. La formación del buble colabora en el proceso de fin de transcripción.
Tenemos el RNA, la RNA polimerasa ha transcrito y una vez terminamos tenemos un bucle terminador. Entonces el RNA acabado de formar, cuando La RNA polimerasa acaba de fabricar este RNA y la distancia que hay entre ellos es mínima (entre la RNA polimerasa y las regiones palindrómicas o con el RNA?). Tenemos 2 regiones palindrómicas (lo que serán un bucle, aún no son palindrómicas pero lo serán, son como los extremos del bucle/región palindrómica) tendrán tendencia a juntarse. El mRNA aunque está enganchado a la RNA polimerasa, los dos vértices del bucle tienen tendencia a formar el bucle, tirarán de la RNA polimerasa.
Función del bucle: disminuir la v de translación de la RNA polimerasa tirando de ella.
Ahora hace falta que se vaya. Los codones de fin de traducción están antes de los cosos rojos, hay 4 nucleótidos de distancia en el bucle. LA RNA polimerasa se ve empujada y disminuye la v de translación.
¿Qué tiene que suceder para que se vaya la RNApolimerasa? Tenemos 2 sistemas: Japonés: xd Ichi) Rho dependiente mi) Rho independiente Sistema Rho dependiente: Participa la prote Rho. Lo más interesante de ella para él es que es una RNA-DNA helicasa ¡!!!!!!!, separa la cadena, separa RNA de DNA. Si tenemos la RNA polimerasa antes transcribiendo, si actúa la prote Rho, está separando el RNA del DNA. Por tanto, la separación se produce por esta prote. Si separamos el RNA del DNA, la RNA polimerasa se ibera del DNA y finaliza la transcripción. Tiene afinidad por el RNA y lo que quiere es quitar del medio la RNA polimerasa. Reconoce una secuencia especifica del RNA. El resto que pone en la diapo el da igual.
¿Cómo va? El ribosoma acaba su traducción y tiene la secuencia Rut que es la que reconoce la helicasa Rho, reconoce a Rut y una vez se ha enganchado separa el RNA del DNA. La RNA polimerasa la tenemos casi completamente aturada y se va. Se despide del DNA. Fin de transcripción. Rho dependiente porque gracias a que Rho reconoce a Rut, la RNA polimerasa se va. Interacción de la prote Rho con esta estructura, PERO aunque no haya esta región rut también se puede producir. ES DECIR, NO ES IPRESCINDIBLE QUE RUT ESTÉ PERO SI ESTÁ RUT ES MUCHO MÁS EFICIENTE, MUCHO MÁS PROBABLE LA UNIÓN DE RHO Y LA SALIDA DE LA RNA POLIMERASA (Y LA SEPARACIóN DEL DNA).
Sistema Rho independiente: Ejemplos de terminadores, de loops que son Rho independientes que se encuentran detrás (darrere) el último ORF. Son dos estructuras diferentes, ¿qué tienen de común? Son bucles, uno más grande y otro más peque. En el extremo 3’ a la derecha hay un poliU (muchos U seguidos) esto quiere decir que la interacción de esta región con el DNA será lábil, no fuerte.
Con lo cual los terminadores Rho independientes se caracterizan porque en su extremo tienen un poli u. Orta cosa interesante: hay mucho C-G en el bucle, que al contrario de U-A es una estructura muy potente, como están en el bucle y cuando se forma el bucle ayudamos a tirar de la RNA polimerasa, hace que la formación del bucle sea muy estable, tira mucho de la RNA polimerasa. La región poli U hace que haya poca afinidad entre este extremo del RNA mensajero y el DNA. Cuando se forma este bucle no hace falta la prote Rho.
¿Cómo va? En este caso tenemos los ribosomas que están traduciendo, llega a un triplete stop, si es el último stop, ¿detrás habrá otro RBS? No. Cuando lleguen los ribosomas aquí se pararán, como tenemos un bucle como los que acabamos de hablar, muy potente porque hay mucho GC, se forma y tira de la RNA polimerasa. Además, esta región es una interacción muy lábil porque es un poliU. Tendencia innata del DNA de doble cadena en cerrarse. No hay prote SSB, los ribosomas ya se han ido. La RNA polimerasa se separa y acaba la transcripción. Proceso de fin de transcripción independiente debido a las características del microentorno en el que se produce.
Efecto polar en pingüinos, polo sur xd. En los osos los ribosomas se desenganchaban y no producían… A nivel de trnascripción no traducción! Cepa polisincrónica, la cepa salvaje produce Mrna y en la mutante aparece una región ámbar UAG, no es que no podamos traducir es que se frena la síntesis de RNA que son dos cosas diferentes. El otro día hablábamos de que el RNA que estábamos fabricando no lo podíamos traducir, aquí hablamos que tb como un codón sin sentido se frene la síntesis de RNA, la trancripción.
Mutaciones polares porque tiene un efecto direccional, como consecuencia de esta mutación, no es que dejemos de traducir el resto de cistrones, es que ya no fabricamos el RNA mensajero que codifica al resto de cistrones. Tiene unas polaridades sobre los ORF que se encuentran detrás que el RNA ya ni se fabrica.
Diferentes ORF, triplete sin sentido, llega RNA polimerasa los ribosomas han saltado, la RNA polimerasa continua. Si hemos desenganchado los ribosomas, como estos hacen de paraguas y tapan la RNA polimerasa, ¿quién persigue la Rna polimerasa? Rho (RNA-DNA helicasa).
Entonces, la RNApolimerasa ya no tiene paraguas, la proteína Rho va, interacciona con la RNA polimerasa y la echa fuera. Por tanto la presencia de una mutación sin sentido (codón ambar), no solo dificulta la traducción (oso polar) sino que también inhibe la transcripción (pingüino).
Efecto polar transcripcional.
Como consecuencia de esto el RNA mensajero de los ORF 2 y 3 no se fabrican.
¿Toda mutación sin sentido dentro de un ORF de una unidad transcripcional polisincrónica tendrá un efecto polar sobre la transcripción? No. ¿De qué dependerá? Volvemos a hablar de algo que sabemos. Todo este efecto polar se debe a que los ribosomas se marchan. Al desengancharse la prote Rho que va persiguiendo a la RNA polimerasa, si desaparecen coge la RNA polimerasa la echa fuera. Para paliar esta situación debemos hacer que los ribosomas no marchen, lo hacemos porque hay RBS internos. Tenemos una mutación UAG1 que es ámbar y una UAG 2. ¿Las dos mutaciones tendrán un efecto polar transcripcional? No. Una sí y otra no, ¿cuál de ellas? En el UAG1 (transcripcional) porque está muy lejos de RBS, cuando llegue ahí el ribosoma, caminará un poco, no encontrará nada y el ribosoma se va. En el UAG2 llega ahí el ribosoma, se encuentra un condón sin sentido, pero luego hay un RBS y dice “pos me quedo” y seguirá protegiendo la RNA polimerasa de la prote Rho. Dependiendo de la distancia que haya entre las regiones RBS y la mutación que se ha producido. Si la distancia es muy grande generalmente tendremos efecto polar y si es muy pequeña no.
Control de transcripción por atenuación (como utilizamos lo anterior para controlar la expresión génica): Hasta ahora sabemos que hay positivo y negativo, y ahora atenuado , es inhibitorio pero no tan drástico como la inhibición (el negativo). También hay de dos tipos: Viednamita xd.
Mot) Dependiente de traducción.
Hai) Independiente de traducción.
Operón de biosíntesis del triptófano. Es biosintético, entonces es negativo generalmente, si hay triptófano no lo fabricamos. El negativo puede ser por inducción o represión.
Represor. Una molécula peque colabora a reprimir. Si es de biosíntesis de triptófano cuando haya triptófano la célula no fabricará enzimas que codifiquen para la síntesis de triptófano.
Los operon es anabólicos son controles negativos por represión. ¡!!Negativo porque reprimimos y represión porque la molécula implicada (triptófano) colabora en la represión.
En el dibujo vemos: promotor, operador (pq es control negativo) en negro las diversas ORF que codifican los enzimas implicados en la síntesis de triptófano. Después del O hay una región L, ¿de dónde viene? De Leader. En esta región tenemos el atenuador. Este sistema se caracteriza porque cuando hay mucho triptófano, con independencia del control negativo del represor, la RNA mensajero que se forma, ¿qué característica tiene? Es muy pequeño, de 140 bases, que no codifica en absoluto genes de biosíntesis y que tiene como función atenuar la transcripción. Con baja concentración de triptófano, codificamos todo el RNA mensajero que codifica todos los genes. Esta región es la que permite que según la concentración de triptófano fabriquemos un RNA más pequeño o un RNA más grande.
Lo mismo de antes. La región líder la hemos abierto, la hemos ampliado. Tenemos un péptido, un ORF que tiene la región líder y dentro de ella tenemos un ORF... Tenemos dos tripletes UGG, ¿qué codifica UGG? Es uno de los tripletes que codifica triptófano. Además, tiene 4 inverted repeats, una región sepia UGA… siguiente transparencia.
Estos cuadrados, ¿qué hacen? 1, 2, 3 y 4 son los inverted repeats que están en el RNAm y en el DNA. Pueden aparearse entre sí.
Ejemplo: 2 y 3 Si el 2 se empareja con el 3: • • El 1 no se puede aparear con el 2 El 4 no se puede aparear con el 3 Por tanto, este bucle impide la formación de los bucles de arriba.
Si el 1 y el 2 no se aparean, el 3 y 4 SÍ se pueden formar. Formación dicotónica, según se formen el 2 o 3, se formará o no el 3 y 4, el 3 y 4 es un bucle terminador Rho independiente. Por tanto, es muy fuerte y entonces arrancaremos la RNA polimerasa cuando se forme este bucle, este bucle se formará cuando no se forme el bucle 2 y 3. Dicho de otra forma, si formamos el bucle 2-3 no formaremos el terminador. Pensar cómo nos las apañamos para ligar esto con la presencia o ausencia de mucho triptófano en el medio. ¿Los círculos rojos que serán? Son los codones triptófano UGG. ¿Qué sucede cuando en el medio de cultivo hay concentración baja de triptófano? POCO TRIPTÓFANO.
Esto implica inmediatamente, concentración baja de un aa (el triptófano), significa una concentración del RNA del triptófano baja, habrá pocas moléculas de tRNA cargado de triptófano, y la concentración de triptófano en el Trna libre es elevada.
Estamos fabricando RNA mensajero, tenemos dos UGG (en rojo los círculos). Es probable que en el codón del DNA se enganche un tRNA libre. ¿Qué hace el ribosoma cuando se coloca un tRNA libre? No tiene ningún aa, no lo utilizamos, lo tiramos, el ribosoma no puede continuar avanzando porque sino no fabrica la proteína. Como hay una concentración muy elevada de tRNA libre es muy probable que vuelva a entrar en el ribo otro RNA libre, esto significa que el tiempo de residencia del ribosoma en esta zona será alto!! Porque los iría quitando seguido y pasaría tiempo. No se forma el 3 y 4.
Este ribosoma (mirar imagen) está solapado con el 1 inversed repeat, por tanto, el número 1 está ocupado por el ribosoma y no se puede formar el bucle 1-2, entonces se podrá formar el grupo 2-3 y si se forma el bucle 2-3 no se puede formar el grupo 3-4 que era el terminador.
Hemos bloqueado el invertead repeat 1, todo por ello. La RNA polimerasa puede continuar la transcripción. Es lo que queríamos xd?.
MUCHO TRIPTÓFANO.
Entonces la cantidad de Trna cargado (de triptófano) será alta y la concentración de Trna libre será baja. Cuando el ribosoma llegue a las dos tripletes de triptófano (2 bolas rojas) se engancharan dos trnas cargados se enganchara al ribosoma y fabricara protes. El tiempo de residencia será más bajo que en el caso anterior. Tenemos los codones triptófano y luego un codón stop. Cuando llega el ribosoma el ribosoma llega al final del ORF donde hay un codón de fin de traducción. El ribosoma lo que hace es quedarse “stalted”, tiene una cierta parálisis justamente damunt (arriba) del codón fin de traducción, que justamente está a la entrada del inverted repeat número 2. Por tanto, el ribosoma se queda parado y no se puede formar el bucle 1,2 ni el 2,3 pero se puede formar el 3,4. Y es un terminador.
21/02/17 Concentración de triptófano baja, no se forma 1 y2, tampoco se forma 2y3, se forma 3 y 4.
Como antes del codón de stop están los codones del triptófano, ahí en esa zona aumenta el tiempo de residencia (en la de los codones).
Situación 1. Sucede cuando en general hay una concentración muy baja de todos los aminoácidos. La cantidad de ribosomas cargados es muy pequeña, por tanto, hay una alta concentración de todos los tRNAs libres. Los ribosomas quedan aparcados forman 1,2 y 3,4.
Region poliU Rho independiente muy fuerte.
Proceso de atenuación dependiente de traducción.
• • Triptófano, esa es la región libre. La W significa triptófano. Tenemos los dos residuos (aa triptófano que hemos comentado).
En la histidina hay una región líder, aquí es más exagerado, tenemos 7 residuos histidina, si hay una disminución de histidina habrá mucha concentración libre, tiempo de residencia muy grande, afecta a la formación de los bucles 1 y 2 y 3 y 4. Con threonina leucina y asi lo mismo. La estructura del atenuador es normal en bacterias gram negativas ¿?ver más adelante y modula la expresión.
El péptido líder desde el punto de vista de proteína la única función que tiene es su formación, según la cantidad de tRNA cargado provocará que se forme o no el bucle terminador pero no tiene ninguna función específica.
El operón pyrBI es una unidad transcripcional que codifica el enzima aspartato carbanilasa que interviene en la síntesis de uracilo. También tiene un sistema de atenuación. ¿Por qué lo pone? Porque podemos modular la expresión de operones ANABÓLICOS, de biosíntesis de aminoácidos!!! Jugando con la posición o cantidad de tripletes en cuestión al RNA mensajero. Imaginar que queremos hacer algo similar con el operón de biosíntesis de uracilo, no podemos hacer lo mismo porque el operón codifica la síntesis de uracilo, no podemos poner un triplete que codifique uracilo. Debemos modificar para que tengan un me canismo de control de atenuación, pero no la misma.
Al final de traducción tenemos la región TAG, 2 cistrones en verde, terminador Rho independiente con un poli T (porque estamos en el DNA). Vamos a hablar de la región lila que es el equivalente al péptido leader, pero no podemos hablar de péptido leader porque aquí no tenemos tripletes que codifiquen. Se caracteriza porque tenemos una elevada cantidad de Us. ¿Cómo funciona? RNA polimerasa va transcribiendo y van los ribosomas, tenemos 2 situaciones: 1.
Bajo nivel de UTP: ¿quién utiliza el UTP? Una parte la biosíntesis de DNA pero otra parte (la que nos interesa) la RNA pol. La velocidad de translación de la RNA polimerasa será baja y como detrás de la RNApol vienen los ribosomas, la distancia entre RNA pol y ribosomas será muy peque porque va muy lenta. Transparencia coches de carreras. Tenemos la región rica en Us y un terminador (bucle), como está prácticamente enganchada al ribo (distancia muy peque) no quedará espacio para que el bucle una vez formado el RNA se pueda formar. Si no se puede formar el bucle no se puede formar el terminador, entonces la RNA pol no se irá, tendremos los rRNAs mensajeros donde haremos la síntesis de uracilo (los verdes), es decir, fabricaremos los RNA mensajeros que codifican los enzimas implicados en la síntesis de uracil.
NO FINALIZA LA TRANSCRIPCIÓN.
2.
Alto nivel de UTP: la v de translación de la RNA pol será rápida, podrá copiar la estructura más rápido, habrá más distancia entre RNA pol y ribosoma, podrá formarse el bucle Rho independiente y la RNA polimerasa se irá, saltará pq es un bucle rho independiente fuerte y no fabricaremos los RNA mensajeros que codifican los enzimas implicados en la síntesis de uracilo no se formaran porque no hace falta, ya tenemos suficiente.
En vez de utilizar un péptido leader que no podemos hacer… utilizamos una región muy rica con el nucleótido mediante el cual estamos controlando la traducción de determinada x cosa. La táctica es diferente. Aumentando la concentración de Us y modificando la distancia entre RNA pol y ribo. Van más o menos enganchadas, depende de traducción porque participan los ribosomas.
Proceso de atenuación independiente de traducción.
El operón triptófano de Bacillus subtilis (gram +): varia la táctica. Tenemos el Operón triptófano, cuando 1. hay triptófano en el medio -> fabricamos un Mrna MUY CORTO y 2. No hay triptófano en el medio -> fabricamos un Mrna MUY LARGO (igual que antes).
La filosofía es la misma. ¿Cómo controlamos? Tenemos la región atenuadora Leader, tenemos de nuevo 4 fragmentos: A, B, C y D emparejables entre sí, podemos tener diversas conformaciones: 3. IZQUIERDA: bucle con un poliU. Por sí mismo podrá echar la RNA pol y terminar la transcripción.
4. DERECHA: Hay un bucle, pero el poliU está en la estructura de dentro, no tendremos fin de transcripción y podremos fabricar las protes implicadas.
Volvemos a tener situación disyuntiva: o se forma una o se forma otra. INDEPENDIENTE DE TRADUCCIÓN, POR TANTO, AQUÍ NO JUGAREMOS CON TRIPLETES.
ALTA CONCENTRACIÓN DE TRIPTÓFANO.
Aparece una prote llamada Trap, es una prote que puede interaccionar con el triptófano, cuando interacciona se engancha con la región A del RNA mensajero!! Si se engancha Trap con triptófano en A, no se puede formar el bucle AyB ni el ByC, por tanto, inmediatamente tendremos terminación. Hay triptófano, ¿hace falta fabricar más triptófano? NO. El triptófano se junta con TRAP y con A, A y B no se pueden formar, se forman CyD, hay poli u y fin de la transcripción.
CONCENTRACION BAJA TRIPTÓFANO.
Trap no engancha triptófano, no puede interaccionar con la región A, se puede formar el bucle A Y B no hay poli U, no hay fin.
Quien determina esto es Trap respondiendo a la cantidad de triptófano que haya: sobre todo en GRAM POSITIVOS! • Antiterminador: Proteína que interacciona con el RNA y abole la estructura del terminador, la deshace. Hay muchos ejemplos, ya hablaremos del bacteriófago Landa.
Hasta ahora hemos visto el sistema de triptófano en E. Coli con los tripletes y el sistema de biosíntesis de uracilo, que no podíamos utilizar tripletes porque estábamos fabricando un nucleótido. GRAAAAAAACIAS RESUMEN <3 Seguimos en el caso de E. Coli, tenemos el operón bgLG (Beagle xd) es de la degradación de betaglucosidos (azúcares). Después de lo que hemos visto, vamos a ver ahora como podemos hacer un atenuador en un operón que codifica la degradación de un azúcar.
AA(aminoácido) -> TRIPLETE NUCLEOTIDO -> POLI U ¿Sistema de atenuación de un operón de biosíntesis (degradación?) de azúcares? BgIG gen que codifica la prote antiterminadora, 3 protes que intervienen en el proceso de degradación del betaglucósido. Misma estrategia, diferente táctica.
Condición sine qua non (sin esta no hay nada, imprescindible xd) para que una célula bacteriana se pueda comer cualquier (un) azúcar: ¿cómo entran todos los azúcares dentro de la celula? Transportadores, y en el proceso de transporte fosforilamos el azúcar para activar la molécula y facilitar la actividad posterior de los enzimas que intervienen. Pensamos en este “fosfo”, si hay un azúcar se introduce y se fosforila, si no hay azúcar no puede ser fosforilada ni introducida dentro de la celula porque no está xd.
A la izquierda tenemos el transportador bgIF, y a la derecha lo mismo cuando no hay betaglucósidos.
1. IZQUIERDA: fosforilamos el azúcar, entra dentro de la célula y se degrada. ¿Quién fosforila? Fosforila BgIF, que es una prote que está en la membrana, fosforilamos y lo comemos.
* 2. DERECHA: no hay beta glucósidos, no podemos fosforilarlo obviamente xd el transportador debe hacer alguna cosa con el fosfato que tiene ahí, ¿qué hace? El transportador que es un vago y se aburre xd transfiere la fosforilación a la proteína BgIG, por tanto, bgiG se fosforila y cuando está fosforilado está en forma inactiva por tanto no hace nada. Si está inactiva significa que cuando estamos transcribiendo esta región se puede formar un bucle terminador Rho dependiente y nadie lo impide.
Entonces la RNA polimerasa saltará y pararemos la traducción en la zona de BgIg, lógico si no hay azúcar para que queremos enzimas (bgiB bgiH que degraden? Xd.
*A la izquierda bgIG no es fosforilada porque el BgIF (enzima transporte) puede fosforilar el azúcar (tiene mucha más afinidad por el azúcar que por bglG) y dejaremos a bglG no fosforilada y está de forma activa, interacciona con el bucle (circulo verde) y lo deshace.
Como el bucle es un terminador, la transcripción no se frena. Eliminamos el terminador y la trasncripción continua. Fabricaremos los enzimas implicados en la degradación del azúcar que en este caso sí hay.
Si hay azúcar no inhibimos porque esto es un operón catabólico, si no inhibicimos la formación del bucle se formarán las enzimas de degradación que eremos.
Quien hace que se forme o no se forme es una prote activa.
Control por riboswitches.
Un riboswitch es una región de RNA que tienen una región que según la conformación que adquiera activaremos o no la transcripción del sistema. Y así modulamos la transcripción, traducción o estabilidad.
Tenemos un RNA con un bucle, un ORF… el bucle puede interaccionar con un ligando, la consecuencia es que se produce un cambio en la conformación 5’ y podemos generar: 1.
2.
3.
4.
Terminador Rho independiente.
Rho dependiente porque hay una secuencia Rut que quede expuesta.
Estimular la degradación del RNA mensajero y que baje la eficiencia de la prote.
Atenuación del gen tyrS en B. Subtilis.
Gen Tyrs, la tyr-aminoacil Trna sintetasa es la enzima que coloca el aa en el RNA. Veremos cómo podemos regular la expresión génica a partir de esta enzima. A la derecha tenemos el gen tyr, justamente delante de (davant) la región codificante del gen tys. Tiene 2 conformaciones: abajo y arriba. La misma región según un ligando que haya puede tener una de las dos.
 Tenemos un Trna que puede cargado o descargado según la concentración que haya de tirosina 1. ARRIBA: readthrough no se inhibe la transcripción, Trna DESCARGADO, poca tirosina, nos interesa fabricar aminoacil trna sintetasa. Rrna no cargado puede interaccionar con la región leader de varias formas: 1.1. De la forma codón-anticodon o 1.2. Con un triplete que codifica tirosina que codifica este bucle 1.3. El extremo 3’, como está libre, tiene una región complementaria (un codón que se encuentra en la 5’ del RNA que está siendo sometido a control) se puede enganchar y fabricamos enzima.
2. ABAJO: se forma un bucle con un poliU. La gracia está en que se forme o no se forme el bucle. Cuando está cargado tenemos mucha tirosina y además tb quiere decir que hay suficiente enzima como para fabricar suf cantidad de Trna, por tanto, interacciona la región anticodon-codón, pero en el ejemplo 3’, como está cargado, hay una tirosina y este aa está tapando el 3’ que tenía una región complementaria, ahora no puede interaccionar. Cuando está el aa, hay la interacción codón-anticodon, pero el otro no, la estructura secundaria de esta región es diferente y tenemos el terminador. Paramos la síntesis del gen que codifica a la aminoacil trna sintetasa.
.
En drosofilas los exremos 3’ del Trna SIEMPRE ACABAN IGUAL: CCA.
Dibujo, vemos los codones que participan. Tenemos un poliU cuando se forma el terminador, sino no se formaría porque la región U está implicada en el bucle. Tenemos el anticodón del codón del Trna, por tanto, en este caso sería donde se engancha el trna tirosina, la t- box (terminación-caja). Porque los extremos de los tRNAs bacterianos, ¿qué secuencia tienen? CCA, si tenemos una CCA tenemos en la caja algo complementario, por tanto, el tRNA libre interaccionará con esta zona.
Cuando esté cargado no podrá interaccionar con esta zona y cambiará la conformación.
En función de si el tRNA tiene o no tiene aa permite o no la transcirpcion. Es un sistema muy escalpat en bacterias sobre todo gram +.
Aumentar o disminuir según queramos fabricar un det tipo de aa. Diversas especies, diversos genes, codón específico de cada aa. Codón que codifica el tRNA: 1. Parte específica 2. Parte genérica: parte complementaria del extremo 3’ del tRNA porque es el mismo para todo (en la t box).
Síntesis de metionina: Unidad transcripcional, según cómo tengamos la conformación del extremo 5’ del RNA mensajero: 1. DERECHA: esa conformación: bucle con poli U, un terminador Rho independiente fuerte. ¿Qué hace que se forme uno u otro? Mucha metionina, metionina interacciona en la zona A y permite la formación del bucle AyB, no se puede formar el bucle ByC y se puede formar el CyD y acabamos la transcirpcion.
Si se forma byc no tenemos c d y no tenemos terminador.
Modulamos la síntesis de protes según las características que tengamos.
Resumen de las diversas cosas que hemos visto para que lo estudiemos.
...

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