Tema 2: Vectors de clonació en procariotes: plasmidis, bacteriòfags i altres (2015)

Resumen Catalán
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Tecnologia del DNA recombinant
Año del apunte 2015
Páginas 4
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 11
Subido por

Vista previa del texto

Tema 2. Vectors de clonació en procariotes: plasmidis, bacteriòfags i altres Molècula que transporta el DNA clonat dins d’una cèl·lula hoste, es replica dins de la cèl·lula bacteriana produint múltiples còpies, de forma que és responsable de l’amplificació del DNA clonat.
Escherichia coli és el bacteri més transformat (gram-negatiu rodejat d’una membrana externa), això és degut a que manté intactes les construccions de DNA i a una sèrie d’avantatges: és fàcil de créixer en un medi de cultiu barat, creix ràpid (en 20 minuts es duplica), el seu genoma està estudiat i mapejat, en el laboratori es fan servir soques segures putades per a que no es puguin propagar fora i posseeixen còpies extra-cromosomals de DNA (plasmidis i bacteriòfags) que s’usen per portar DNA forà.
Què és un vector de clonació? Característiques: contenen el seu propi origen de replicació, contenen elements per a la selecció de bacteris transformats i tenen dianes de restricció úniques. A més, han de tenir un baix pes molecular i un gran avantatge és que tinguin llocs únics per a diverses endonucleases de restricció (polylinker).
1. Vectors de clonació naturals: difereixen en la penetrància   1.1. Plasmidis bacterians: DNA circular de doble cadena covalentment tancat (cccDNA) que es replica de forma autònoma i pot tenir còpies múltiples dins de cada cèl·lula (fins a 200 per cèl·lula). Es troben àmpliament distribuïts en procariotes i tenen una mida variable de 1 a 250 kb. Aquests contenen gens que el bacteri necessita expressar en gran quantitat en determinades circumstàncies: resistència a un antibiòtic (permet selecció, aïllament i purificació de les cèl·lules bacterianes que contenen el plasmidi dins d’una mescla de bacteris), producció d’un antibiòtic, degradació de compostos aromàtics, fermentació de sucre, resistència a metalls pesats, producció de bactericina, inducció de tumors en plantes, entre altres.
Classificació segons la seva replicació: o Replicatius: no-integratius, són més petits i usen la maquinària del cromosoma bacterià per duplicar-se, hi ha alguns que són més grans i codifiquen pels gens necessaris per a la seva replicació o Episomes: poden tenir una fase d’integració en el cromosoma bacterià Classificació segons el nombre de còpies per cèl·lula i mida: o Astringents/Conjugatius/Grans: tenen 1 o dues còpies per cèl·lula i són conjugatius.
o Relaxats/No conjugatius/Petits: de 50 fins a 200 còpies per cèl·lules (pUC), són els més útils per a la clonació de DNA, ja que serà més fàcil introduir-los al hoste al tenir menys de 10 kb i ens permetrà inserir un fragment de DNA més gran.
Què és això de la conjugació? Els plasmidis conjugatius són portadors d’uns gens de transferència (transfer, tra) que promouen la conjugació sexual entre cèl·lules bacterianes, aquest tipus de plasmidis es transfereixen d’una cèl·lula a una altre en un cultiu. Els plasmidis no conjugatius, en canvi, manquen d’aquests gens tra però si estan en una cèl·lula que presenta plasmidis conjugatius aquests últims poden co-transferir aquests gens.
 Classificació segons les característiques/funcions codificades pels gens en el plasmidi: o Plasmidis F (Fertilitat): portadors únicament dels gens tra, no aporten cap altre funció. Ex: plasmidi F de E. coli o Plasmidis R (Resistència): porten gens que confereixen resistència a antibiòtics, bactericides o bacteriostàtics  cloranfenicol, ampicil·lina, tetraciclina, kanamicina, mercuri. En soques patògenes en humans, acostumen a expandir-se entre poblacions naturals que es convertiran en resistents als antibiòtics. Ex: RP4 de Pseudomonas es troba en altres espècies bacterianes o Plasmidis col: codifiquen per colicines, es tracta de proteïnes que maten a altres bacteris.
Ex: ColE1 de E. coli o Plasmidis degradatius: codifiquen per enzims que permeten el metabolisme de molècules inusuals com el toluè i l’àcid salicílic. Ex: TOL de Pseudomonas putida o Plasmidis de virulència: confereixen patogenicitat al bacteri portador. Ex: plasmidis Ti de Agrobacterium tumefaciens¸ que indueix el crown gall disease en plantes dicotiledònies.
1.2. Plasmidis en eucariotes: sol s’han descrit en llevats (fons unicel·lulars)  Saccharomyces cerevisiae (cercle o plasmidi 2 micres). La cerca de plasmidis en fons filamentosos, plantes i animals no ha donat resultat.
1.3. Bacteriòfags (genoma/cromosoma de virus bacterians): cccDNA i/o DNA lineal, el virus injecta el seu DNA víric en el bacteri i aquest es replicarà de forma independent al cromosoma bacterià, les bactèries infectades acaben produint múltiples còpies del virus. Ens centrarem en concret en els bacteriòfags de E. coli, com tots els virus únicament contenen àcid nucleic que cofifica per gens necessaris per a la replicació del virus i una càpsida proteica.
Patró general del cicle d’infecció d’un bacteriòfag: unió al bacteri i injecció del DNA  replicació del DNA (normalment amb enzims codificats pel propi fag)  síntesi de proteïnes de la càpsida, encapsulació del DNA i lisi cel·lular amb alliberació de virions.
 Classificació segons la seva estructura: o Cap i cua: Fag ƛ Estructura fag: 48,5 kb de doble cadena lineal, els gens es troben agrupats de forma física i funcional (en clústers): components de la càpsida, integració i escissió, expressió primerenca, síntesi de DNA, expressió tardana (COS), lisi del hoste, una regió no essencial (b2) que es pot substituir pel DNA que volem clonar, mantenint la mida de 49 kb del genoma de lambda.
- - o Cicle lític: bacteri infectat és lisat i mor  la replicació del DNA del fag és molt més ràpida que la divisió del bacteri (20 minuts); el DNA del fag no es manté estable dins del bacteri, de forma que les bactèries infectades moren i es formen calbes de lisis en cultius en gespa.
Cicle lisogènic: el DNA víric queda retingut per la cèl·lula hoste, la que no mor. S’integra el DNA del fag en el cromosoma (com els episomes) en forma de pròfag, on es manté durant centenars de divisions mitòtiques dins del cromosoma. En un moment donat (degut a múltiples factors) el pròfag es separa del cromosoma i s’inicia la fase lítica.
Filamentosos: M13 (6407 pb), f1, fd.
Estructura fag: contenen una cadena de DNA senzilla, circular i envoltada per una càpsida de proteïnes que està composta principalment per la proteïna g8p i unes altres quatre en menor quantitat. Sol duen a terme el cicle lisogènic i fan replicació per Rolling circle, poden infectar E. coli a través del pili.
Mecanisme per crear DNA circular de cadena simple que s’empaqueta en partícules víriques: 1- 23- 123- Com es replica el virus dins de la cèl·lula hoste? (primera imatge) El bacteriòfag M13 injecta el DNA dins de la cèl·lula mitjançant el pilis, aquest DNA és de cadena simple, un cop dins de la cèl·lula, es sintetitza la segona cadena per tal de tenir un DNA de doble cadena, el qual serà la forma replicativa (RF) Es repliquen els RF per produir noves molècules de doble cadena (Replicació per Rolling Circle) Els RF es repliquen per Rolling circle per produir molècules de DNA lineals i de cadena simple, aquestes recircularitzaran, s’acoblaran a la càpsida i s’alliberaran partícules de fag M13 madur.
Replicació per Rolling-Circle (segona imatge) Una cadena és tallada per una endonucleasa, generant un extrem 3’ lliure que serà estès per la DNA polimerasa El extrem 3’ és allargat mentre els punts de creixement giren a través del motlle circular. L’extrem 5’ és desplaçat i queda com una cua de DNA de cadena simple que està fora del cercle.
La cua de cadena simple es converteix en una doble cadena de DNA mitjançant una síntesi que implica primers de RNA, com en la cadena retardada de la replicació de DNA Cicle lisogènic: el virus es replica en DNA contínuament, s’acoblen els components vírics i es secreten virus. No hi ha integració en el genoma ni lisi del bacteri, però aquest creix mes a poc a poc.
Avantatges dels fags filamentosos: el DNA es replica en forma de doble cadena (RF) que pot ser manipulada com un plasmidi, a més, tant aquesta doble cadena com la cadena senzilla serveixen per transformar E. coli, i un dels avantatges més importants é que la mesura de la partícula vírica depèn del DNA, es a dir, no hi ha restricció de longitud del fragment de DNA (fins 6 cops la mida de M13).
2. Vectors de clonació sintètics 2.1. Plasmidis sintètics: en els primers experiments de clonació, s’usaven plasmidis naturals (Col E1 i pSC101), aquests són petits i tenen llocs individuals per les endonucleases de restricció comuns, però tenen un nombre limitat de marcadors genètics per la selecció de transformats.
Nomenclatura: p (de plasmidi) BR (cognoms dels descobridors) 322 (nombre de plasmidis que es va haver de fer servir fins arribar al disseny final del plasmidi).
2.1.1.
2.1.2.
pBR322: es tracta d’un vector molt usat en enginyeria genètica, té una mida de 4361 bp, està seqüenciat i té un mapa de restricció ben caracteritzat. Presenta 40 llocs de restricció (es considera que són pocs), 11 dels quals són en el gen TcR (resistència a la tetraciclina) i 6 en el gen ApR (resistència a l’amplicilina). Aquests llocs de restricció ens permeten una correcta selecció, ja que s’apagarà la resistència a un dels dos antibiòtics si s’ha inserit el nostre fragment d’interès.
pUC18/19: se li han afegit característiques molt importants per a la selecció i la lligació. A més dels gens de resistència, tenim el gen de l’operó Lac, dins del qual trobem un polylinker.
2.2. Bacteriòfags Derivats del fag ƛ: el fag lambda no és el més apropiat per usar com a vector perquè té moltes dianes de restricció i poca capacitat d’acomodar l’insert. Els objectiu dels vectors derivats són augmentar la capacitat d’acomodar DNA insert, la incorporació de dianes de restricció úniques, facilitar la selecció i altre millores per facilitar el treball amb llibreries genòmiques.
2.2.1.1. Vectors d’inserció: l’insert es pot introduir de la mateixa forma que per als plasmidis, es a dir, es talla l’insert i el DNA del fag amb els mateixos enzims de restricció i s’obté el vector amb el nostre insert. Aquests admeten fragments petits, sinó no es poden empaquetar les càpsides víriques.
2.2.1.2. Vectors de substitució: quan es requereix una mica de DNA a clonar major, es pot incorporar eliminant prèviament la part del genoma víric que no es necessita per a la infecció i la replicació.
Una de les limitacions és que es pot tornar a lligar el fragment que hem escindit, ja que hi ha la mateixa probabilitat que s’uneixi un fragment o un altre. Quan s’elimina la regió no essencial, els vectors de substitució admeten inserts de major tamany sense superar el límit per a que es puguin empaquetar.
2.2.2. Millores de M13: 2.2.2.1. M13mp1: contenen una regió lac útil per la selecció, però sol conté dianes de restricció úniques per tres enzims: AvaII, BglI, PvuI 2.2.2.2. M13mp2: conté a més una diana per EcoRI 2.2.2.3. M13mp7, mp18-19: contenen polylinkers 2.2.1.
Els gens clonats en vectors basats en M13 poden recuperar-se de cultius de E. coli infectades: 1- En la forma replicativa (RF), com DNA circular de doble cadena  com plasmidis 2- En forma de DNA de cadena simple: útils en tècniques de seqüenciació i mutagènesis in vitro 3- S’usen per la tècnica de “phage display”, en la que es detecta si dues proteïnes interaccionen entre elles 2.3. Còsmids: es tracta de quimeres que combinen característiques de plasmidis i fags per combinar els avantatges de tots dos. El fragment plasmídic proporciona les característiques de mida petita, circularitat, origen de replicació, nombre de llocs de restricció, marcadors de selecció i propagació en bacteris. Del fag lambda s’agafen les regions “cos” que proporcionen la capacitat dels fags de ser empaquetats en càpsides víriques in vitro (explicat a mà). De forma que infectarà E. coli però no la lisarà (comportament plasmidi) i es seleccionaran per resistència a l’ampicil·lina, a més, admetran fragments d’entre 35 i 45 kb 2.4. Fagèmids: plasmidi al que se li ha incorporat l’origigen de replicació d’un fag filamentós (M13 o f1).
D’aquesta forma, es mantenen totes les utilitats dels plasmidis i a més tenim la capacitat de produir DNA monocatenari.
...

Comprar Previsualizar