Tema 1:Operaciones básicas en DNA recombinante 2/3 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 10
Fecha de subida 03/10/2017
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Tema 1 de Tecnología del DNA recombinante

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TEMA 1 OPERACIONES BÁSICAS EN DNA RECOMBINANTE TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
María Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología.
Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Actividad polimerasa 5’-3’.
La DNA polimerasa I si no hay un extremo 3’-OH sobre el que adicionar nucleótidos es incapaz de insertar nucleótidos. Aunque hubiera una concentración muy alta de nucleótidos no haría nada.
Sólo puede adicionar nts si hay una cadena molde. Necesita un 3’OH con unos cuántos nucleótidos.
Esto es igual para el resto de DNA polimerasas menos en una: la terminal transferasa.
La actividad terminal transferasa puede insertar nucleótidos sin molde pero requiere un extremo 3’ pre- existente.
El nucleótido entra por el grupo fosfato y gracias a la energía del fosfato alfa por el lado 3’ se formará el enlace fosfodiéster, se libera PPi y, así, la cadena crecerá por el lado 3’.
Actividad exonucleasa 3’-5’ (proof reading) Actividad exonucleasa en sentido inverso a la replicación. Elimina el nucleótido que acaba de poner, es la llamada actividad correctora de pruebas.
Degrada nucleótidos conforme va alargando la cadena. Cuando se está replicando en sentido 5’-3’ quita el nt del 3’ que acaba de poner.
Actividad exonucleasa 5’-3’ (Nick translation).
Actividad exonucleasa en el mismo sentido de la replicación. Esta actividad se denomina actividad Nick translation.
Añade nucleótidos a los agujeros hasta chocar con un 5’ pre-existente y lo degrada (lo quita y sintetiza por delante).
Si queremos una DNA pol sin actividad Nick translation la tratamos con subtilisina. Así eliminamos el dominio responsable de dicha actividad y se obtiene una DNA pol I modificada que recibe el nombre de polimerasa Klenow (pol K).
1 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Una vez se llega al extremo 3’ final todas las que no tengan actividad correctora de pruebas pondrán una A independiente de molde. Colocan un nucleótido, Y SOLO UNO, sin que haya molde que copiar (como si tuviera un poco de actividad terminal transferasa). Normalmente esto es una desventaja. Si utilizamos DNA polimerasa I pasará esto y es importante porque puede resultar un problema. Hay estrategias de clonación donde sí que pueden ser una ventaja.
Un concepto importante con las DNA polimerasas es el de procesividad. Corresponde al número de ciclos de polimerización (adición de nucleótidos) que pueden hacer sin desengancharse del sustrato/molde.
La DNA pol de E. coli es poco procesiva, es decir, pone unas decenas de nucleótidos, se desengancha, se marcha y ha de venir una nueva a continuar la síntesis.
La DNA pol del fago T7 es x órdenes de magnitud más procesiva que la de E. coli porque pone 1000 nucleótidos sin desengancharse del molde.
Las DNA pol que se usan suelen ser enzimas más procesivas que la de E. coli, por ejemplo, la del fago T7. Entonces la DNA pol I se utiliza para rellenar pequeños agujeros, pero no se utiliza en reacciones de secuenciación ya que nos evitamos pausas.
La actividad correctora de pruebas marca la efectividad (procesividad).
Si rellenamos pequeños huecos nos importa poco si tiene actividad correctora de pruebas o no ya que no es necesaria.
Sin embargo, para secuenciar tenemos que tener en cuenta esta tabla: Las enzimas poco procesivas y poco fieles (cuya actividad correctora de prueba es mala) deben evitarse en la secuenciación. La presencia o ausencia o la mayor o menor tasa de actividad correctora de pruebas también determina el precio de la polimerasa.
Reparación extremos sobresalientes.
q. 5’ sobresalientes: tratamos con polK (enzima Klenow) para asegurarnos de que no digiera todo el DNA y obtendremos dos cadenas largas.
Se puede quitar con exonucleasa sin llenar nada.
r. 3’ sobresalientes: con la T4 DNA polimerasa (que tiene actividad 3’-5’ exonucleasa). La actividad Nick translation degrada y llena 5’-3’, sobre el 5’ intacto no hace nada.
Después tratamos con Klenow.
2 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología La actividad 5’-3’ exo de la DNA pol solo puede ser usada en caso de que estemos haciendo una síntesis de DNA. No se puede degradar los extremos sin más.
TRANSCRIPTASAS INVERSAS (DNA POLIMERASAS RNA DEPENDIENTES).
Hay unas pocas DNA polimerasas que trabajan mejor si el molde del que copian es RNA. Estas son las DNA polimerasas RNA dependientes y son transcriptasas inversas, se sacan de retrovirus. Las que se suelen usar son: s.
MMLV: (Moloney Murine Leukemia virus) t.
AMV (Avian, mieloblastosis virus).
Son las dos polimerasas RNA dependientes que se usan en DNA recombinante.
u. DNA polimerasa I de Termus Termophilus: es una DNA polimerasa DNA dependiente, pero en presencia de manganeso tiene actividad transcriptasa inversa = RNA dependiente.
Es la única enzima que en presencia de magnesio tiene actividad polimerasa y en presencia de manganeso tiene actividad transcriptasa inversa.
Las dos que se usan son MMLV y AMV que son de virus eucariotas, pero termus termophilus es procariota y termoresistente. Esto le aporta ventajas sobre las dos primeras. Además, otra ventaja es que es mucho más procesiva que las otras dos transcriptasas inversas de origen viral que se han solido usar en DNA recombinante. Por ejemplo, MMLV y AMV pueden sintetizar trozos de centenares de nucleótidos sin desengancharse, pero pol I de Termus Termophilus como 1000 sin desengancharse.
REACCIÓN DE PCR.
Factores importantes en cuanto a la DNA polimerasa: - Procesividad.
Actividad correctora de pruebas.
3 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Además de la procesividad, debemos saber si trabajamos con actividad correctora de pruebas o sin actividad correctora de pruebas. Este concepto debemos tenerlo claro. Diseño de oligonucleótidos. Por lo que respecta a la polimerasa la podemos encontrar de dos tipos: 1. Con baja actividad correctora de pruebas (la tagl de toda la vida).
Así pues, tendremos una cantidad indeseable de mutaciones. La usaremos cuando tengamos reacciones de diagnóstico.
Es una enzima relativamente económica, la utilizaremos cuando no nos interesa el clonaje del producto de la PCR, simplemente si amplifica o no amplifica (siempre en motivos de diagnóstico no hay ningún problema).
Obtendremos extremos con As sobresalientes independientes de molde.
2. Con alta actividad correctora de pruebas cuando se trate de clonar (porque el producto de la PCR debemos recombinarlo para que se pueda expresar). Para que la proteína recombinante que expresaremos, se exprese correctamente y sin mutaciones necesitamos que la enzima tenga actividad correctora de pruebas. También necesitamos alta procesividad para hacer sondas y para secuenciación. Por ejemplo: la pfu, Deep vent, (ver diapo) son enzimas con una relación calidad precio relativamente buena y la cantidad de mutaciones que introducen es muy pequeña.
Obtendremos extremos romos.
Norma nemotécnica: cuando amplifiquemos con PCR con una enzima baja actividad correctora de pruebas de 20-30 % de las cadenas amplificadas llevan 1 mutación, con actividad correctora de pruebas bajas 2-3 órdenes de magnitud, 1% o 0.1%.
SECUENCIACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (MÉTODO DE SANGER-DIDEOXIS).
Respecto a la secuenciación de DNA nos hace falta utilizar enzimas con elevada procesividad y elevada actividad correctora de prueba. Cuantas más rondas hagamos, más procesividad.
Sanger es el único al que le dieron dos premios nóveles (uno por la secuenciación de DNA y otro por la secuenciación de proteínas) de los pocos en el campo de la biotecnología.
Su método consiste en utilizar nucleótidos dideoxi que llevan en su extremo 3’y 2’ dos hidrógenos.
En ausencia de OH, cuando se pone un didesoxi o dideoxi en el H no se puede adicionar un nucleótido nuevo en trans ya que hay un OH en 3’, por tanto, se detiene la síntesis.
4 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología 1. Cantidad variable de los didesoxi con los + adicionales de la derecha, se para la reacción de los que acaben en A (ddATP) o T (ddTTP) o G(ddGTP) o C(ddGCP).
2. Corremos en un gel de acrilamida + urea.
3. Leer de 5’-3’ de abajo a arriba.
SECUENCIACIÓN AUTOMATIZADA DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
5 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología A partir de mediados de los 90 hasta hoy en día la secuenciación de Sanger se hace utilizando nucleótidos dideoxis cada uno marcado con un fluorocromo diferente. Por cada cuatro se corre una.
1. Tenemos los didesoxis que teníamos antes, pero marcados cada uno con un fluorocromo diferente. En sus extremos 3’ y 2’ tienen hidrógenos, por tanto, la DNA polimerasa no puede poner un nucleótido nuevo.
2. Misma reacción de secuenciación, pero ahora se corren de forma simultánea.
3. Un láser con un detector se detecta el color del fragmento que pasa segundo su peso molecular. Nos determina el fragmento de DNA que corresponde directamente a la base que lleva en su extremo y se puede determinar la secuencia de nucleótidos.
Si acabamos de hacer un clonaje de un fragmento de 3kb de DNA y queremos asegurarnos de que no hemos introducido ninguna mutación, haremos una reacción de Sanger en un sistema automatizado y por un precio de 50 euros nos daría la secuencia que queríamos, no recurriríamos a la secuenciación.
Si tratamos genomas enteros, haríamos otra secuenciación, pero sería mucho más cara. Las reacciones de ultra-secuenciación las veremos en el tema 3. Muchas están basadas en el método de Sanger.
Conclusión: Si queremos obtener un trozo de 5-10 kb de su secuencia utilizamos Sanger, si es más grande se puede hacer otra secuenciación, pero 5 reacciones de Sanger son 10 euros por reacción, mientras que otra secuenciación puede costar 2000 euros.
FOSFATASA ALCALINA Y T4 POLINUCLEÓTIDO QUINASA.
Dos enzimas que trabajan en parejas (no necesariamente) pero siempre van juntos porque uno hace la forma reversa de la otra.
1. Fosfatasa alcalina .
- Elimina los grupos fosfatos de los extremos: entrantes, sobresalientes o romos.
- En los tres casos, es capaz de coger un extremo 5’ P (fosfato) y cambiarlo por un extremo 5’ OH.
- Con una quinasa cortamos un plásmido y genera extremos cohesivos, no queremos que se vuelva a ligar por tanto con la fosfatasa alcalina transformamos los extremos 5’ fosfato de este plásmido en extremos 5’ OH.
6 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología - Como la presencia de un grupo fosfato es esencial para que la DNA ligasa pueda hacer la reacción en la cual se acaba produciendo la formación de un enlace fosfodiester, si previamente tratamos este plásmido con fosfatasa alcalina este será incapaz de ligar consigo mismo.
- Podrán ligar con un DNA foráneo si este en sus extremos lleva grupos fosfato.
- Es una manera de que el grupo vector de clonaje se comporte de una forma eficiente, tratando con fosfatasa alcalina.
2. Polinucleótido quinasa.
- También se puede utilizar la fosfatasa alcalina para marcar los extremos 5’ del DNA en conjunción con la polinucleótido quinasa.
- Hace la reacción reversa a la de la fosfatasa alcalina adicionando un grupo fosfato sobre el extremo 5’ que previamente tenía un OH.
Pasa un 5’-OH a 5’P.
- Si se quiere marcar con extremos radioactivos, la fosfatasa alcalina esta reacción de conversión de P a OH la hace de forma muy eficiente, pero también podemos no tratar con fosfatasa alcalina y la polinucleótido reductasa es capaz de hacer, no con tanta eficiencia, la reacción de intercambio.
Si tenemos una molécula de DNA en presencia de polinucleótido quinasa y un deoxi ATP (Datp), reemplaza el fosfato gamma del nucleótido (de los 3 que tiene) por el Datp, es decr, puede reemplazar al fosfato correspondiente al extremo 5’ del DNA.
Así pues, no hace falta previo tratamiento con fosfatasa alcalina (pero es menos eficiente). No es necesario que haya extremos 5’OH para que actúe la polinucleótido quinasa, pero esta reacción es poco eficiente, para hacerla más eficiente debemos tratar con fosfatasa alcalina y después utilizamos la polinucleótido quinasa.
- A parte de marcar extremos 5’ de moléculas de DNA mediante esta adición de reemplazo sea mediante la fosfatasa alcalina o por el fosfato gamma y el Datp, la policucleótido quinasa se utiliza para obtener oligonucleótidos 5’fosfato, el 95% es para obtener oligonucleótidos 5’P (sino se hace nada se obtendrían siempre 5’P).
7 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Evitar la religación del vector.
1. Incubamos el DNA y hacemos un choque térmico a 42 grados.
2. La molécula puede tener dos Nicks, circular, pero con dos Nicks en cada una de las dos cadenas.
¿Qué es lo que aguanta esta molécula de forma circular? Por los puentes de H del vector, pero, fundamentalmente, por los puentes de hidrogeno que hay en el inserto, si los quitamos queda lineal porque tenemos un Nick en cada una de las dos cadenas del DNA.
Dicho en otras palabras, el éxito de esta reacción depende exclusivamente de que el inserto sea suficientemente grande como para hacer el choque térmico a 42 grados, sino nos quedaría una molécula de DNA lineal.
3. No podríamos utilizar polinucleótido quinasa para esto, bueno, sí, pero haría falta algo más. Deberíamos añadir otra enzima, la más barata de todas: la ligasa de E coli, que va muy bien. La ligasa no puede hacer un enlace fosfodiéster, porque tenemos un 5’OH del vector que impide hacerlo. La ligasa de E. Coli es la más barata y mejor para reparar el.
También podemos hacerlo con ligasa del bacteriófago T4, aunque es más caro.
OTRAS ENZIMAS DE UTILIDAD EN DNA RECOMBINANTE.
Terminal transferasa.
Se utiliza básicamente para adición de colas de homopolÍmeros durante la síntesis de DNA y se utiliza para facilitar el clonaje de DNA sobre diferentes tipos de vectores.
La terminal transferasa es una DNA polimerasa que se aisla a partir de células precursoras del sistema inmunitario.
8 Belén Pérez Sanmartín - 2º Biotecnología Es muy eficiente sobre ssDNA, aunque tb es relativamente eficiente sobre dsDNA y , especialmente, sobre extremos 3’ sobresalientes de dsDNA (que por definición es como si fueran ssDNA). Es muy poco eficiente sobre extremos 3’ entrantes y romos.
Es la única que puede adicionar nucleótidos sin necesidad de copiar, la secuencia es aleatoria y depende exclusivamente de los nucleótidos que hemos puesto. Si hemos puesto solo una cola de adenina, de homopolímeros, pues si ponemos C-T será diferente, una mezcla de ambas en cualquier orden. Su uso es básicamente a la hora de facilitar el clonaje de moléculas de cDNA.
Exonucleasa III - Se usa en técnicas linker scanning mutagénesis.
- Nos sirve para determinar la presencia de zonas funcionales en un ácido nucleico.
- Se basa en eliminar de forma creciente secuencias del extremo de una molécula de DNA hasta que pierde una determinada función, en este momento quiere decir que la hemos matado. A continuación, se digieren los extremos de DNA. Se puede hacer mediante un único enzima que es la Bal31.
Es una enzima de Escherichia coli encargado de degradar los extremos de dsDNA siempre que correspondan originariamente a un fragmento de DNA romo o con un 3’ entrante, ya que si tenemos un extremo 3’ sobresaliente la exonucleasa III no actuará.
PCT1 causa extremos 3’ sobresalientes y la exonucleasa III no actúa, hacemos una digestión y se generan extremos 5’ sobresalientes.
Si lo que queremos es formar en 3’ extremos romos sobresalientes, haremos un tratamiento del fragmento de DNA con nucleasa S1.
Nucleasa S1: Actua sobre ssDNA y lo degrada de forma endonucleotídica. Si tenemos un DNA nickado esta nucleasa sería capaz de romper el enlace fosfodiéster del otro lado y elimina los 9 ...

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