Tema 1 - Cultius cel·lulars (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 19/03/2016
Descargas 12
Subido por

Descripción

Tema 1

Vista previa del texto

Tema 1. Introducció a la Biotecnologia cel·lular. Biologia de la cèl·lula en cultiu. Semblances i diferències amb la cèl·lula en teixit.
PRIMERA CLASSE DESAVENTATGES - - - - Sensible vol dir que detecta quantitats molt petites de productes, característica dels cultius, però no és una desavantatge, com a desavantatge és que qualsevol mínim canvi pot canviar molt els resultats, doncs s’ha de seguir molt el protocol, i quan fem canvis, han d’estar molt controlats.
Cost de producció i quantitat de material, els sistemes de cultius cèl·lules, són molt costosos, el sèrum boví fetal, s’aporta 10% mig litre costa 600-900 euros. Per tant produir coses amb cultius cel·lulars, és molt costos. Però a vegades es una estratègia necessària, com per exemple fer proteïnes recombinants, l’única manera de fer-ho és dins d’una cèl·lula.
Inestabilitat: característica intrínseca dels cultius cel·lulars, des del punt de vista metodològic podem pal·liar-lo, si tenim un cultiu cel·lular i sembro moltes cèl·lules, el cultiu cel·lular el anem passant de placa i placa al cap d’un any, la composició de cèl·lules no serà la mateixa, ja que s’ha aplicat una pressió selectiva, doncs tindrem a cada placa un experiment evolutiu, que respon a la pressió selectiva que marquem amb els paràmetres del cultiu. El primer dia de treball, ens donen uns tubs congelats, l’hem de congelar i als tres mesos els tornem a descongelar tots els tubs, els cultius no es mantenen durant molt temps per tal de que no seleccionin. Sempre partim del mateix lloc, i sempre deixem passar un període curt per tal de que no es produeixi la inestabilitat. No desapareix, sinó que evitem l’efecte.
Validesa del model “in vitro”: qualsevol resultat que obtinguem en un cultiu cel·lular, doncs els resultats s’hauran de validar en algun altre model, s’han de realitzar en diversos models per arribar a conclusions importants.
Què podem cultivar? Esquema que mostra en la part central les poblacions que tenim en qualsevol mamífer adult, la majoria són cèl·lules diferenciades madures, la majoria no poden proliferar, doncs serà complicat, ja que no saben proliferar, aquestes cèl·lules estan un temps en el nostre teixit, que varia, però desprès moren, i aquestes són reemplaçades per unes cèl·lules que si que proliferen i s’anomenen precursors determinats, que es troben en tot el teixit, i aleshores es diferencien a madures. En alguns llocs del cos tenim cèl·lules mare (cèl·lules multipotents), que són més potents i poden diferenciar-se a més coses que els determinats, es troben sobretot en la medul·la òssia, però també es pot trobar en el teixit adipós blanc, cèl·lules mesènquimes.
Aquestes cèl·lules també es reprodueixen.
Hi ha una situació en que les madures també es divideixen, quan en un teixit normal es produeix un tumor, aquestes cèl·lules neoplàstiques són cèl·lules estranyes. No representen el que succeeix in vivo. Les dues fletxes indiquen les condicions que permeten passar d’unes cèl·lules a les altres.
Des del punt de vista de nomenclatura, és important utilitzar la mateixa tots, utilitzem una bibliografia tota en angles, utilitzem “tissue culture” a qualsevol tipus cel·lular, qualsevol estratègia que permet mantenir fora del organisme a cèl·lules. En funció de si l’estructura histologia es manté o no, li donarem diferents noms: - - - - Cultiu d’òrgans: agafem un tros d’òrgan (macroscòpic) i el posem en una placa de cultiu i la mantenim viva, al cap d’una setmana seguirem tenint un, però seguirà viva.
Imply a three dimensional culture of undisaggregated tissue retaining some or all of the histological feactures of the tissue in vivo.
Cultiu cel·lular: si agafem un teixit i el disgrego en cèl·lules individuals. Culture derived from dispersed cells take from original tissue, from a primary culturem or from a cell line or cell strain by enzimatic, mechanical or chemical dissaggregation.
Cultiu histotípic: utilitzem un sol model o tipus cel·lular. Implies that cells have been reaggregated or grown to re-create a three dimensional structure with tissue like cell density and properties.
Cultiu organotipic: utilitzem dos o més models o tipus cel·lulars. Is a kind of histotypic culture but makes use of recombination of cells of different lineages. Is an attempt to generate a tisse equivalent Per poder establir un cultiu partirem de material animal, aplicarem una seqüència de disgregació mecànica i altre de disgregació enzimàtica.
- Disgregació mecànica mínima.
Disgregació mecànica més efectiva: obtenim fragments petits ho anomenarem fragments....
Si tenim les dues disgregacions ho anomenarem cultiu cel·lular.
Agafem dos ronyons i trossegem amb bisturí fins a obtenir fragments de 1-2mm, això s’anomena explant primari, en realitat l’òptim és de 300-500 micrometres, (1-2mm és molt gran), ha de ser tant petit ja que si no és així l’oxigen no arriba a dins, i doncs morirà al cap de uns dies, si es tant petit doncs si que arriba i no mor. En aquest treball el fem tant gran, ja que no volem mantenir explants molts dies, però l’estratègia que utilitza es el outgrowth i és que fragments del explant s’uneixen al medi i al cap d’uns dies utilitzem aquells, traiem els trossos d’explants i mantindrem el cultiu que s’haurà escapat del teixit (sobrecreixement del explante).
- PBS. S Cross 1-2 mm Sedim / PBS. S 0’5ml CMed Positus 24h5ml El segon vídeo, part dels explants i els sotmet en una digestió enzimàtica (tripsina), va a incubar els trossos amb aquesta, es va a separar la cèl·lules que quedaran disperses i les sembra.
- - - - Trip flask: es caracteritza perquè és una ampolla on la barra central hi ha un imant, l’imant connectat a un agitador extern té una agitació suau, al treballar amb cèl·lules de mamífer, doncs hem de tenir molta cura. El flask també té dos forats on deixa entrar i treure substància. Les cèl·lules eucariotes serien com bombolles de sabó, qualsevol agitació trenca les membranes, no es pot vortexar, la turbulència trencaria les cèl·lules. La centrifugació es fa a 100g perquè sinó la velocitat en que xoca amb el fons provocaria que es trenquen.
PBS A: diferent a PBS S, que és solució tamponada de fosfat, aquest és complet. La diferència amb el A és que el A no té ni calci ni magnesi, això és degut a que inestabilitza unions, les unions entre cèl·lula matriu són estabilitzades per els ions divalents. Si posem calci i magnesi, doncs posem un quelant per tal de que es mantinguin les unions.
Tripsina (100x): proteasa que té la característica que té molta activitat contra moltes proteïnes diferent, va a atacar a receptors cel·lulars, quedarà la cèl·lula calba, doncs no podrà unir-se al substrat i morirà, entrarà en apoptosis, per aquesta raó el temps d’acció és curt.
30’ 37ºC low speed Centrifugar 100xg 5’ Sedimentar Vídeo 3: - Universal container: un tub de vidre estèril.
PBS S: li traiem el PBS S, medi amb calci magnesi.
Fig (-Ca/Mg) PBS A: el substituïm per PBS A, que no té calci i magnesi però que té tripsina.
4ºC, 18h: incubem un overnight, a 4ºC Tripsina: retirem l’excés de tripsina, deixem solament el que hi ha en els teixits.
- - 30’ 37ºC: el mantenim, a 37º, en comptes de 4º, ja que a 4º la tripsina no té activitat, que passa durant la nit a la nevera? Quan incubem el material en la cuina, quan tenim solució doncs volem que s’empapi, volem que la pepsina es difongui en el interior del teixit, de manera que quan ho tinguem a 37º, la tripsina s’activa, però com que esta dins del teixit, volem que actuï en la totalitat de la massa. S’anomena COLD TRIPSIN (l’anterior s’anomenava WARM TRIPSIN). Els enzims que utilitzem en la degradació són proteïnes que ataquen components de la matriu extracel·lular.
10 ml med pp/disp Corent/serd Diferencia entre el que és un cultiu d’òrgans explantes i un cultiu de cèl·lules disgregats (diapositiva) Gràfic. X: setmanes en cultiu, Y: número de cèl·lules Pot tenir lloc que la població proliferi, després d’un decrement inicial la població augmentar de número moltes vegades. De tal manera que el que hem fet ha estat augmentar molt gran en el número de les cèl·lules, arriba un moment en que la població arriba a la fase de plató, i a continuació a la senescència. De repent tota la població mor, si una línia mostra aquest comportament s’anomena línia primària. Obliga a ser aïllada periòdicament. Es mor per diferents raons, però si fem un experiment en el qual introdueixo en el interior de les cèl·lules humanes un gen que codifica per la telomerasa funcional humana sobreexpresada, doncs obtenim que dura molt més, però acaba morint igual, creix molt més, i moltes vegades fins i tot desconeixem si la senescència acaba morint. Doncs sabem que les cèl·lules primàries doncs tenen poca telomerasa, es perden gens dels extrems, això és el que porta a la fase de senescència, la població es mor degut a moltes causess. En l’esquema es mostra amb ratlles verticals, doncs agafem poques cèl·lules d’una placa i les creixem en la següent, i les deixem créixer i repetim el procés, això és un replaqueig, agafar una part de la població i posar-la en una altre placa, per tal de que tinguin més lloc, ja que solament es divideixen si tenen lloc, sinó s’inhibeix la divisió, per les unions laterals.
Una línia primària, quan tenim una placa i sembro en la següent, doncs no podem aplicar més de 1/3 o màxim 1/4, vol dir que en una placa agafem una quarta part i la sembrarem a la següent, que ocuparà després la totalitat de la placa. Si no les posem suficientment empaquetades no detecten senyals de cèl·lules veïnes i moren, no són capaces de proliferar, això ho anomenem Split ratio, és la fase de dilució d’una placa a la següent, doncs també hi ha inhibició per poca dilució.
Posem un exemple: tenim un milió de cèl·lules en una placa, de les quals el 50% són viables, i sembrem, (35mm de diàmetre) i sembrem 250.000 cèl·lules, la Split ratio és de ½. Ja que solament la mitat estan vives, els cadàvers no ens importen.
Tenim una placa de 100mm de diàmetre, i volem sembrar una ampolla de la mida que sigui, el màxim que produeix la placa és 10 milions de cèl·lules, i sembro en una ampolla, on sembro un milió de cèl·lules que venen d’aquí, però sé aquesta botella em produeix moltes cèl·lules ja que és molt més gran. La Split ratio ens parla del factor de dilució (si poséssim 1 i obtenim 10, és 1:10), però aquí sembro 1 i obtinc 100, doncs és una Split ratio 1/100, és un factor de dilució. Depèn del rendiment del cultiu inicial, s’han de diluir més o menys com a màxim sembrant una cèl·lula i deixant espai per tres més, ens dona igual la mida de placa, sempre respectant que una deixi espai per tres més (1/4).
Si tenim 10·10^6, volem fe una Split ratio de 1:4, doncs posarem 0’25·10^6, però si la placa és el doble de gran, podem posar 0’5·10^6.
En aquest gràfic, hem dit que la població podia reduir-se al llarg del temps, això s’anomena cultiu primari, això arriba a senescència o mort, això s’anomena línia primària, també pot tenir lloc que alguna petita part de la població no es mori, que s’hagi fet immortal, s’ha immortalitzat per un fenomen que anomenem transformació, que seria equivalent a una neoplàsia in vitro, un tumor, de manera que prolifera de manera incontrolada, s’obté d’una línia primària i té creixement infinit, doncs anomenem línia secundaria o continua.
Tota línia primària es caracteritza per tenir una senescència o mort, es produeix després d’una sèrie de passos, on es dona una sèrie de divisions cel·lulars o generacions. Anem a donar un número que anomenarem límit de hayflick, que és el número de generacions abans de senescència.
 En una línia secundaria el límit de hayflick, és infinit.
 En una línia primària dependrà de la línia. En cultius normalment utilitzem pell humana, tenim un exemple on una de les fonts es comporta com a límit de hayflick, de 9·11, amb l’altre estratègia s’utilitzen nens. La pell de senyora és molt fàcil d’obtenir ja que hi ha molta cirurgia plàstica, la pell que obtenim de nen és el tros que s’elimina de l’operació de fimosis, pell meravellosa ja que és d’individu jove, les cèl·lules de l’organisme tenen edat, doncs el límit depèn de l’edat de les cèl·lules d’on ho obtenim.
Les poblacions proliferants són cada vegada menys ploriferants, per això tenim menys límit.
En els precursors hematopoètics també veiem diferencies. Per aquesta raó hi ha un límit de donants de medul·la.
Sempre hi ha excepcions: per exemple un cultiu de cèl·lules sanguínies, no cal dissecció, solament cal dissoldre. Un cop aïllat, tenim una població de cèl·lules molt complexes, poden aleshores passar tres coses: línia primària o que alguna de les cèl·lules muti i sigui immortal (línia secundaria o continua, és una línia rara, ha passat alguna cosa en el sistema biològic).
Es comparen el contingut de cromosomes per nucli, d’una línia primària i una secundaria. X: nº cromosomes, Y: nuclis contats. En un normal esperaríem 46 cromosomes, en realitat tenim una mitjana de 46, però hi ha alguna variació. Per tant probablement això és un error experimental. Però de la línia secundaria, la mitjana és de 66, això vol dir que han mutat, però a més la variació és molt més gran, i això no és un error experimental, sinó que hi ha molta variabilitat de població, s’han produït canvis molt importants que influeixen en el seu genotip.
- - - - La primera línia diu transformació, és el procés de primària a secundaria, doncs una primària no està transformada, però la secundaria si.
Les continues acostumen a ser heteroploides i aneuploides (no completes). Les primàries acostumen a ser diploides i euploide.
Majoritàriament les primàries no són tumorogèniques, però les secundaries acostumen a no ser-ho. Però sempre hi ha excepcions. TUMOROGÈNIC: quan forma tumors, i això ho sabem si ho posem en un animal i fa tumors. Capacitat de escapar-se del cicle cel·lular i té la capacitat de formar masses tumorals en un animal i immunodeficient no pot controlar. Els tumors es formen in vivo, doncs per això ho hem de posar en un animal.
Ancoratge: significa que les cèl·lules poden créixer en dues situacions. Flotant (limfòcit) o adherida al substrat (s’uneixen a la matriu). Les continues són menys dependents, no creixen en suspensió, però el grau de dependència és molt menor.
Inhibició per contacte: quan una cèl·lula està en una placa de cultiu es dividirà fins que trobi la veïna per tots els costats, aleshores para de créixer, ja que no té lloc. Això passa sempre a les primàries, però les línies continues, depenent de la línia poden escapar-se d’aquesta inhibició, com ho fan? Quan no poden dividir-se en un cert pla, doncs canvien de pla, i es divideixen cap a dalt, doncs formen muntanyes de cèl·lules.
Alguns cassos escapen de la inhibició per contacte.
Depenent de la densitat per créixer: les primàries són depenent, doncs molt important la Split ratio, per tal de rebre senyals. Però les continues podem diluir-les moltíssim.
Per acabar el tema, definirem diversos termes:  Diferenciació: indica la adquisició de les propietats diferencials d’un tipus cel·lular en cultiu (per exemple: línies progenitores de la sang).
 Desdiferenciació: si volem d’una cèl·lula diferenciada que proliferi, doncs s’haurà de desdiferenciar, ja que sinó no prolifera. Doncs si solament passem a la situació de proliferació ho anomenarem a desdiferenciació. Indica la pèrdua de forma irreversible, de les propietats diferenciades d’un tipus cel·lular en cultiu (per exemple: hepatòcits / emmagatzemar glucògen).
 Desadaptació: quan passem a la situació de proliferació i al mateix procés el passem de nou a una cèl·lula diferenciada de nou. Doncs el mateix procés de diferenciada a des-diferenciada ho anomenem desadaptació. Implica que les característiques especialitzades de determinats tipus cel·lulars es troben regulades per factors que poden introduir-se de forma controlada en els cultius cel·lulars (per exemple: cèl·lules epitelials de la glàndula mamària i producció de proteïnes làctiques).
...