Tema 5 (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 31
Fecha de subida 11/02/2015
Descargas 71
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Tema 5. ESTRUCTURA PRIMÀRIA DEL DNA Conèixer l’estructura primària del DNA va requerir més dificultat. Sabem que el DNA va interessar com contenidor de la informació biològica i en temes anteriors aquesta funció tant important no ha estat tractada.
INTRODUCCIÓ HISTÒRICA: CONEIXEMENT DEL CODI GENÈTIC 1886, Descobriment dels gens. Aquests apareixen en la ment de Mendel com un concepte, una idea abstracta, de manera que no estan definits ni descrits des del punt de vista físic, es tracten d’una construcció intel·lectual basada en dades experimentals.
1990, teoria cromosòmica de l’herència. Aquest descobriment permet afirmar que els gens no són una idea abstracta sinó que tenen un lloc físic, els cromosomes.
1910, elaboració de mapes genètics. Això és important perquè és el camí per intentar arribar a la física dels cromosomes i dels gens i aquests mapes genètics són una combinació de genètica i bioquímica. Sabem que durant la meiosi és quan té lloc la recombinació dels gens de tal manera que el producte final són uns cromosomes recombinants gràcies al entrecreuament de les cromàtides. Gràcies a quests avenços es van poder construir mapes genètics (observem en la imatge el mapa del cromosoma 2 de Drosophila) i calcular distàncies entre gens de manera que, s’arriba a realitzar el quocient entre número de recombinants/total de descendent, en que un 1% és una unitat de mapatge o centimorgan. Els mapes genètics indicaran que els gens es troben ordenats seqüencialment de manera que els cromosomes no són estructures en branques sinó que són estructures lineals i per tant, tenim informació física d’aquests.
Més tard, quan es comencen a elaborar estudis genètics amb microorganismes (generalment s’empra E.Coli) es troba una ordenació seqüencial dels cromosomes però tancada sobre ella mateixa, de manera que, a vegades es trobaven cromosomes circulars on la ordenació seguia sent la mateixa.
1950-1953, es troba que els gens estan en el DNA, és a dir, en el material genètic. Es sap que el DNA és una molècula lineal que no té branques (no considerem que els cruciformes siguin branques perquè la formació d’aquests és circumstancial).
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Coneixement dels mapes genètics Amb aquests descobriments sorgirà un gran problema: els mapes genètics són molt interessants però són mapes relatius perquè estan basats en un mètode indirecte de posicionar els gens en el cromosoma de manera que l’aspiració de químics i físics serà l’obtenció de mapes genètics absoluts. Trobem dos tipus de mapes genètics (absoluts o físics) que es poden construir per mitjà de tres mètodes diferents: Tècniques citològiques, tècniques d’hibridació Un experiment d’hibridació in situ permet conèixer la ubicació física d’un gen en els cromosomes i això s’elabora fent una hibridació amb el DNA de la proteïna en qüestió que es vol localitzar. Sabem que coneixem el DNA que codifica per la proteïna de manera que podem elaborar una hibridació de manera que, es tracten els cromosomes perquè es dissociïn les dues cadenes i que per tant, la hibridació es produeixi.
Per elaborar aquests mapes es feien servir sondes (el DNA és una sonda) marcades radioactivament i la hibridació porta a un punt on es troba el gen.
En la imatge es pot localitzar (marcat amb una fletxa) com un cúmul de molts granets corresponents a la radioactivitat. Hem de tenir present que aquesta tècnica es pot elaborar amb radioactivitat o FISH.
Tècniques bioquímiques Aquestes tècniques estan relacionades amb enzims de restricció i per tant, els mapes que s’elaboren a partir d’aquestes són anomenats mapes de restricció.
Tècniques de seqüenciació Els millors mapes que podem obtenir són els mapes físics, que es basen en la seqüenciació. Si elaborem la seqüenciació dels gens aleshores els podem ubicar en una seqüència i per tant, tenim un lloc físic on localitzar-los. Aquesta es podria considerar també una tècnica bioquímica.
Projecte del genoma humà (Anys 90) El projecte del genoma humà pretenia tenir la seqüència del genoma humà de forma completa. Aquesta seqüència es va anar obtenint de forma progressiva, primerament es van elaborar mapes genètics humans bons, més tard mapes físics per els quals va ser necessari tenir tots els coneixements obre la seqüenciació.
9 El pronòstic d’un autor serà que per arribar a tenir el 3·10 parelles de bases del genoma humà totalment seqüenciades caldria treballar bastants anys tot (aproximadament al 2004) tot i que es va aconseguir arribar a aquesta meta al 2001, en que ja es tenia pràcticament tota la seqüència completa.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 CINÈTICA DE REASSOCIACIÓ DEL DNA La primera pista que va permetre conèixer com és l’estructura primària del DNA provenia d’estudis de la cinètida de reassociació del DNA. Per tal d’elaborar aquest tipus d’assaig cal que el DNA estigui ben preparat, és a dir, s’ha de purificar.
Purificació del DNA En temes anteriors vam veure una manera primitiva de purificar el DNA on s’utilitzava cloroform i fenol. Avui dia en cara s’utilitza aquest sistema però en trobem altres eines més comunes que ens permeten fer-ho. Trobem diferents kits per purificar el DNA, entre ells destaquem un que utilitza petites columnes que contenen reines de bescanvi iònic.
A la imatge veiem un esquema per la purificació d’un DNA circular o bé d’un plasmidi. Els passos que hem de seguir són: 1.
Cultivem les cèl·lules en les quals hi ha el DNA que volem purificar i a continuació, les sotmetem a una lisi alcalina. Amb això aconseguim que el DNA quedi dissociat en les dues cadenes; el DNA gros es quedarà dissociat però, el DNA petit (DNA plasmidi) podrà regenerar la doble hèlix.
2.
Inserim el material genètic a la columna que conté la reina de bescanvi iònic de manera que, el DNA quedarà adsorbit.
3.
A continuació, es fa un rentat amb unes determinades concentracions salines que dependran de quines són les condicions del DNA que tenim. Amb aquest pas aconseguim eliminar el RNA, la contaminació per nucleòtids, etc.
4.
A vegades, quan treballem amb el bacteriòfag M13 ens interessa obtenir DNA de cadena senzilla; per fer-ho, elaborarem l’última elució amb una dissolució salina d’una concentració més baixa.
Amb aquest procediment aconseguim un DNA molt ben purificat i aquest fet es pot constatar amb un gel electroforètic ja que únicament obtindrem una banda molt fina que fa referència a ssDNA.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Purificació automatitzada del DNA La purificació del DNA tendeix cada dia més a automatitzar-se de manera que, es treballa de forma massiva. El que en un laboratori es fa en columnes individuals es pot realitzar en una col·lecció de més de 90 columnes que s’introdueixen en una càpsula per anar més de pressa. En aquests casos, en comptes que l’elució es produeixi per gravetat el que es fa es connectar el tub d’una bomba de buit de manera que, les elucions siguin més ràpides.
Al final d’elaborar el procés obtenim un eluït que correspon al plasmidi que volem però per 96 mostres, ja que són les que conté la càpsula. Si fem una precipitació del DNA a cada tub amb metanol i isopropanol, obtindrem precipitats de DNAs diferents.
Existeixen robots de laboratori que són capaços de fer totes les pipetejades necessàries, afegir els líquids d’elució, elaborar el buit, etc. De manera que, sense gaire esforç obtindrem una gran quantitat de DNA purificat. Aquest fet té una gran importància per fer estudis mèdics ja que sense la purificació automatitzada no seria factible per una qüestió de temps.
Experiments de cinètica de reassociació 9 En temes anteriors ja vam veure que quan s’intentava renaturalitzar el DNA de vedella, d’unes 10 parelles de bases, no s’aconseguia una renaturalització completa tot i que es va aplicar un protocol adequat. En aquest cas, la reassociació total és possible però és un procés molt lent.
També es va elaborar un experiment amb el bacteriòfag M13 que té un genoma de 7.000 parelles de bases i es va obtenir que la renaturalització del seu DNA era completa i es produïa d’una manera bastant ràpida.
Per últim es va fer un experiment de cinètica de reassociació amb el DNA corresponent a un nucleosoma que conté 146 parelles de bases; aquest assaig es produïa d’una manera tan ràpida que fins i tot era un problema. Per tant, en aquest cas es produeix una reassociació instantània.
Fases en el procés de reassociació Recordem que el procés de reassociació d’un DNA es produeix en dues fases: 1.
Fase de nucleació que és molt lenta i és on es troben els fragments complementaris.
2.
Fase de propagació que acull un parell de fases. Aquí es produeix la propagació o l’efecte cremallera i és fenomen molt ràpid.
En un DNA CCC el procés de reassociació és gairebé instantani ja que té enllaços topològics i per tant, no ha de “perdre el temps” en la fase de nucleació.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Cinètica de reassociació: Fase de nucleació En aquest apartat tractarem la fase lenta de la cinètica de reassociació, és a dir, la fase de nucleació. Per tal de realitzar aquest tipus d’experiments és imprescindible fer un trencament del DNA ja que sinó es formaria una xarxa insoluble que no ens permetrà fer un estudi.
El trencament del DNA es pot fer per diversos mètodes, que diferenciem en:  Ultrasonicació o sonicació. Amb aquest mètode es fa incidir sobre el tub de DNA ones emeses per un aparell d’ultrasons. Els ultrasons són ones sonores d’alta freqüència que són equivalents a ones mecàniques.
Concretament, a partir d’un transductor es fa vibrar una sonda sobre el DNA que genera uns sons d’alta freqüència i que provoca una agitació molt forta en el líquid; per tant, el DNA queda trencat en trossos petits d’unes 100 parelles de bases.
 Forces hidrodinàmiques. Un altre mètode consisteix en fer passar el DNA per forats molt estrets de manera que, està sota pressió i pateix forces hidrodinàmiques fent que quedi esmicolat.
Temperatura ideal en el procés de reassociació Els estudis sobre la cinètica de reassociació del DNA era un assaig molt comú entre els bioquímics ja que era la única manera que tenien per estudiar l’estructura primària pel DNA. És per aquest motiu pel qual van intentar esbrinar quina és la temperatura ideal perquè es produeixi el procés de reassociació.
Van obtenir que la temperatura ideal és 25° per sota de la temperatura de fusió. Cal tenir present que a la temperatura de fusió a ningú se li ocorreria fe els estudis de cinètica de reassociació però, la temperatura sí que ha de ser suficientment elevada com perquè la reacció tingui lloc.
Seguiment del procés de reassociació El monitoring del procés de reassociació es realitza a partir de mesures d’absorbància a 260 nm. Quan hi ha reassociació es produeix un efecte hipocròmic de manera que, l’absorbància va disminuint al llarg del temps.
Una altra manera de seguir el procés de reassociació és mitjançant l’ús de columnes cromatogràfiques d’hidroxiapatita en la qual es fa passar la mostra a diferents temps; únicament s’uneix a la columna el DNA de doble cadena. El DNA que feien servir estava marcat radioactivament.
Per tant, si es va fent la cromatografia al llarg del temps es pot fer una corba cinètica. Es va recollint el que passa per la columna i es torna a passar. Cal tenir present que, com més temps hagi passat, més quantitat de DNA s’haurà reassociat i això ho podem detectar per la radioactivitat a cada passa que fem.
El DNA inicial de doble cadena el fondrem per tal que es converteixi en monocadena; dues cadenes complementàries de DNA una que serà ssDNA (+) i l’altre ssDNA (-). Al llarg del temps el que passa es que es produeix el DNA doble cadena degut a col·lisions entre les dues cadenes complementàries. Cal tenir present que no totes les col·lisions seran efectives però algunes sí que ho seran. (imatge 0).
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Es tracta d’una reacció de segon ordre de manera que vindrà donada per una constant i dues concentracions: A la imatge de l’esquerra veiem el procés de reassociació d’un DNA eucariota. A l’eix d’abscisses es representa Cot que correspon a la concentració expressada en nombre de mols de parelles de bases/ L de DNA no reassociat a temps inicial.
A l’eix d’ordenades es representa la fracció reassociada.
Podem expressar la velocitat de reassociació tal com s’observa a la taula de la dreta. Quan estudiem un procés de reassociació el que realment ens interessa és la fracció associada i per elaborar aquests estudis hi ha dos paràmetres que podem modificar: Co i el temps (Cot). La fracció associada de DNA creix al llarg del temps i això també passa a mesura que les concentracions inicials són creixents.
Cal tenir present que si estudiem la cinètica d’un DNA que es reassocia de seguida, podem disminuir la concentració inicial per tal que no es reassociï massa de pressa; el fet d’una reassociació espontània pot ser un problema ja que pots no disposar dels mecanismes que et permetin estudiar-ho. Per una altra banda, si la cinètica de reassociació és molt lenta, podem augmentar la concentració inicial fent que aquesta sigui més ràpida.
En les corbes de reassociació tipus la que hem vist anteriorment és molt freqüent determinar quin és el valor de Cot 1/2 que fa referència a la concentració de DNA reassociat pel temps quan la reassociació és del 50%.
Una seqüència senzilla per analitzar seria per exemple una poliA on la complementària és una poliT. Quan aquestes dues cadenes xoquin aleatòriament ho faran amb xocs químics productius ja que poden generar ponts d’hidrogen i fer doble cadena. A la dissolució tenim moltes molècules del tipus poliA i moltes altres poliT, de manera que la concentració inicial efectiva serà igual a la concentració inicial mesurada químicament.
Si la seqüència és per exemple del tipus (AC)n, o una altra estructura amb dos nucleòtids, no tots els xocs seran efectius perquè hi hagi nucleació; aproximadament només ho seran la meitat. En aquest cas, la concentració inicial efectiva serà aproximadament un mig de la concentració química inicial.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Aleshores, a una determinada concentració inicial de DNA dissociat, la constant de segon ordre es fa més petita com més complexa és la seqüència que s’ha de reassociar. Cal tenir present que la constant (K 2) és una constant establerta per la natura que en el primer cas, on només tenim un tipus de nucleòtid, és màxima; quan tenim dos nucleòtids diferents a la seqüència la constant correspon a K2/2. Aquesta disminució és deguda que la meitat dels xocs són efectius, que vol dir el mateix que la constant de velocitat és la meitat.
Si tenim una seqüència del tipus (AGC)n, és a dir, una estructura amb repetició de 3 nucleòtids, la concentració inicial efectiva correspon a 1/3 de la concentració inicial de DNA reassociat. La constant de velocitat també disminueix ja que no tots els xocs són efectius i correspon a K2/3.
En general, podem dir que si tenim una seqüència aleatòria de longitud X repetida n vegades:  La concentració efectiva és igual a Co/X.
 La constant de velocitat fa referència a K2(màxima)/X.
Per tant, estem trobant una manera de conèixer, a partir d’un experiment molt allunyat de l’estructura primària, la complexitat del DNA. En aquests casos, la complexitat Estem trobant una manera de conèixer, a partir d'un experiment molt allunyat de l'estructura primària, la complexitat del DNA. EN aquests casos la complexitat va augmentant a mesura que el nombre de nucleòtids que augmenta. La complexitat és equivalent a la longitud de la seqüència de DNA que estem estudiant. Això es veu perfectament quan es treballa amb genomes senzills de bacteris i virus.
A la imatge veiem la corba Cot de diferents DNA amb diferents complexitats. Com a més senzill i amb menys pb trobem una seqüència polinucleotídica (poli U : poli A), seguit per una sèrie de fags (MS2 i T4) i un bacteri ( E. coli). Veiem que les corbes Cot es van desplaçant cap a la dreta a productes Cot de valors més grans.
Podem determinar, en funció dels valors de Cot, la complexitat de qualsevol dels genomes que estudiem. En el cas de MS2 la complexitat correspon a 3500, és a dir, la complexitat equival al número de parelles de bases en el genoma.
Als anys 70 – 80 van conèixer la primera cosa bàsica per estudiar l’estructura primària del DNA i era quina és la seva longitud. Una altra cosa important era saber la seqüència de nucleòtids però això és més complex i no ho van aconseguir.
Cal tenir present que la longitud es va poder determinar gràcies als experiments fets als anys anteriors ja que sense aquests no s’hagués pogut aconseguir.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Si ens fixem en detall en el gràfic que hem comentat anteriorment, podem veure que quan es fan les corbes Cot d’un DNA que no és de virus ni de bacteri sinó d’un organisme més complex com un mamífer, la fracció reassociada no està representada per una sola corba sinó que trobem 3 corbes entrellaçades on una continua a l’altra. Aquest fet ens permet separar el DNA genòmic en tres components:  Fast component que fa referència al component de reassociació ràpida ja que a poca concentració ja es reassocia. Veiem que aquesta primera transició va des del 0% reassociat fins el 25% i això implica que representa un 25% del DNA genòmic que estem estudiant.
 Intermediate component que està representat des del 25% reassociat fins una mica més del 50% i això implica que representa aproximadament un 30% del genoma.
 Slow component és la fracció de reassociació més lenta i representa un 40-45% del DNA genòmic.
El Cot1/2 augmenta a mesura que el component es reassocia més lentament. En el quadre podem veure que la 5 8 complexitat de les tres fraccions és molt diferent, en el primer cas és de 340 pb, en el segon de 6·10 i en l’últim de 3·10 .
Per poder entendre correctament el quadre hem de saber quant DNA conté cada cèl·lula haploide amb la que estem treballant i aquest valor el va haver de determinar.
Per fer-ho posaven en un tub d’assaig les cèl·lules que havien preparat i d’aquestes podies conèixer el número que tenies en un determinat volum. A continuació, mitjançant tècniques d’espectroscòpia es pot fer un anàlisi de DNA que ens doni el contingut total. Per tant, coneixent el DNA total i el número de cèl·lules pots determinar el contingut de DNA que hi ha a una cèl·lula. A més, cal tenir present que si hem fet l’estudi amb cèl·lules diploides però nosaltres treballem amb 8 haploides, s’ha de dividir el resultat entre 2. Van obtenir un valor de 6,8·10 pb/cèl·lula i si tenim en compte els percentatges de cada fracció que hem dit anteriorment, obtindrem els resultats de la taula.
8 8 En la fracció lenta, la complexitat (3·10 ) correspon a la quantitat de DNA que hem de considerar pel 45% (3·10 ) i això vol dir que en aquesta fracció és una seqüència única i exclusiva; cal tenir present que aquesta és una seqüència concreta però no té perquè ser continua. Van concloure que es tracta d’un DNA no repetitiu de seqüència única.
5 8 En la fracció intermèdia, la complexitat (6·10 ) no correspon a la quantitat del DNA que hem de considerar pel 30% (2·10 ) i aquesta diferència s’ha de justificar d’alguna manera. Van proposar que per que representés aquest percentatge, el DNA amb aquesta seqüència s’havia de repetir 350 vegades i per tant, es tracta d’un DNA mitjanament repetitiu.
En la fracció lenta també hi ha diferències en quant a la complexitat (340) i la quantitat de DNA que representa el 25% 8 (1,7·10 ). L’única manera de justificar-ho és dir que la seqüència poc complexa es repeteix 500.000 vegades per tal de donar aquest determinat DNA amb aquesta mida. Així doncs, es tracta d’un DNA altament repetitiu.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Els organismes diferents als bacteris, és a dir, els eucariotes, tenen una cinètica molt complexa i aquestes eren les primeres passes per saber la lectura.
Aquests estudis es van fer amb molts organismes i en la següent taula observem com en el cas dels bacteris no és repetitiu de la mateixa manera ho veiem en el cas dels llevats. Com més avall de la taula ens movem més DNA repetitiu trobem i observem que aquest pot arribar a ser fins un 50%.
ESTUDI DE LA QUANTITAT DE DNA: GRANDÀRIA DE L’ESTRUCTURA PRIMÀRIA Aquests tipus d’estudis són la primera passa i encara veurem més el tema tractat anteriorment, la reassociació. Alhora que s’estudien les seqüències també s’estudiava la quantitat de DNA que tenien els diferents tipus d’organismes, és a dir, no només s’estudia la cinètica sinó també la quantitat de DNA del genoma i per tant, el que s’està estudiant és l’estructura primària del DNA.
Determinació del valor C En la següent imatge observem la quantitat total del genoma haploide dels diferents organismes.
Observem el valor C que intenta relacionar la complexitat biològica dels organismes (complexitat morfològica). D’aquesta manera podríem definir el valor C com la quantitat de DNA d’un genoma haploide, amb el nombre aproximat de tipus cel·lulars que té l’organisme.
Observem que els mamífers, aus i rèptils estan per dalt de la gràfica, és a dir, tenen més tipus de cèl·lules i per tant, són organismes més complexos.
En el cas dels bacteris hi ha menys tipus cel·lulars.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Veiem com la complexitat augmenta cap a dalt de la taula i el que s’espera és que a major complexitat les dimensions del genoma també haurien de ser més grans però això no queda reflectit en els següents resultats. Així doncs, veiem com els mamífers si que tenen una gran quantitat de DNA en el genoma però determinats peixos, plantes o salamandres tenen més DNA tot i que no són més complexos que els humans.
Aquesta observació va ser anomenada la paradoxa del valor C que s’interpreta com que el DNA és una molècula ben triada per l’evolució biològica dels essers vius i la seva principal propietat és la de duplicar-se i reservar l’herència.
Aquesta propietat però pot provocar que aquest DNA vagi augmentant el que podria tractar-se d’una propietat intrínseca; com millor es replica més pot augmentar la seva mida de manera que hi ha espècies que de forma exagerada el seu DNA es va duplicant generació en excés, el que no comporta un problema. Aquests estudis van ser recollits en el llibre Selfhis DNA o DNA egoista.
Tècnica: hibridació Al estudiar tant profundament la cinètica de reassociació o hibridació obtindrem moltes qüestions tècniques. El domini tècnic de la hibridació és una de les tres portes fonamentals de la enginyeria genètica de manera que, observem el diferent resum de les condicions d’hibridació.
Parlem de severitat de la hibridació i això vol dir que podem elaborar una hibridació de forma relaxada, permissiva o bé una hibridació molt més precisa.
Mètodes d’hibridació Existeixen dos mètodes diferenciats per elaborar una hibridació: Temperatura alta i concentració salina baixa Al treballar en aquestes condicions el que fem és elaborar la hibridació amb una màxima desestabilització de la doble cadena, estem en un punt en que la doble cadena no és del tot estable. En aquesta situació només es poden hibridar les seqüències que siguin molt complementaries, aquelles que tinguin zones amb un aparellament incorrecte no s’hibridaran perquè es tracta d’una hibridació molt restrictiva.
Aquest tipus de tècnica és bona aplicar-la quan en l’experiment de la hibridació volem discriminar entre seqüències molt semblants de manera que necessitem una restricció important.
Temperatura baixa, concentració salina alta En aquestes condicions no treballem de manera tant restrictiva el que ens permet hibridar seqüències que no siguin 100% complementàries.
Tal com veurem més endavant en moltes tècniques de biologia molecular es passen per una hibridació en que s’utilitzen diferents instruments. El domini d’hibridació és tant potent fins al punt que hi ha instrumental i protocols que ens permeten elaborar una bona hibridació.
10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Experimentació d’hibridació (forma sofisticada) Importància del bacteriòfag M13 En aquest experiment es va utilitzar el bacteriòfag M13. Aquest està format er una càpside que conté un DNA circular monocadena que en infectar el bacteri ho fa penetrant pels pilis (filaments que tenen els bacteris que estan foradats pel centre) el que li permet entrar en la cèl·lula.
Sabem que aquest DNA del bacteriòfag necessita copiar-se, replicarse de manera que, ha de passar a la forma replicativa, que és de doble cadena. És molt fàcil en el laboratori preparar monocadena o doble cadena d’aquest bacteriòfag. Si ens volem quedar únicament amb la monocadena el que hem de fer és que els virus després de lisar la cèl·lula s’escapen, com que contenen DNA monocadena el que farem després de la infecció és quedar-nos amb els virus, que tenen el material genètic que volem.
Si el que volem és quedar-nos amb el DNA de doble cadena elaborem un centrifugat d’un cultiu bacterià infectat. En aquesta centrifugació diferenciarem, com en totes un sediment (DNA de doble cadena) i un sobrenedant (DNA monocadena).
Bases de la experimentació L’experimentació es basa en clonar un tros del DNA de M13 de forma atzarosa de forma que el que es clona és una seqüència corresponent al DNA d’un nucleosoma (el DNA nucleosomal és monocadena).
Elaborarem la clonació i obtenim el DNA circular i la cadena curta de DNA nucleosomal ficada dins aquesta cadena. Com que les 146 pb del clonal tenim una cadena positiva (+) i una negativa (-) sabem que únicament està integrada la cadena (+) mentre que la (-) no ho està.
El que volíem fer és que, donat que en elaborar la precipitació tenim moltes molècules de DNA nucleosomal de doble cadena (tenen 146 pb) el que volien era tenir dins d’un tub de dissolució la cadena (+) únicament i en un tub separat la cadena (-), és a dir, separar les dues cadenes.
Aquest aspecte es resol amb un procediment sofisticat d’hibridació: tenim la molècula A i tantes copies com volíem de doble cadena de manera que en obtenir el DNA de doble cadena de M13 i tallem aquest per tenir la quantitat desitjada.
D’aquesta manera tenim molt de material que correspon a la doble cadena i també tenim una gran quantitat de monocadena amb la cadena (+) dins.
11 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Elaborem el següent procediment: 1.
Escalfar a 100 graus. Això provoca que les dues cadenes que formaven la doble cadena es separin de manera instantània. Quan la temperatura anava baixat però, la reassociació es produïa de nou i es podia donar per tenir l’estructura original o bé per la reassociació de la cadena (-) amb la cadena (+) provinents del DNA circular. Així doncs, tenim un conjunt de molècules que segueixen la primer estratègia i un altre conjunt que segueix la segona.
Podem entendre el DNA circular com a competidor però per estequiometria el que passa és que sobra la cadena (+).
2.
Afegim una quantitat determinada de polietilenglicol, un agent que provoca la precipitació del DNA. Com afegim aquest component en baixa concentració sabem que no tot el que tenim en la barreja precipita de manera que únicament ho farà el DNA de doble cadena petit i el M14 generant aquest complex. En aquestes condicions la cadena (+) no precipita perquè és una monocadena que té una massa inferior a les anteriors.
3.
Elaborem una centrifugació, en el sediment tenim els components que han sedimentat mentre que en el sobrenedant tenim la part soluble, que és la cadena (+). Recollim aquesta amb una pipeta i la col·loquem en un tub per separat, anomenat tub A.
4.
El sediment anterior conté 2 components que es poden separar disminuint la quantitat de polietilenglicol (PEG).
D’aquesta manera resuspenem el sediment i afegim una concentració del 9% de PEG el que provoca que únicament ens quedi soluble el M13 i de forma insoluble només tenim la doble cadena.
5.
Tornem a elaborar la centrifugació, recollim el sobrenedant (doble cadena més petita de M13) ja que ens podria servir per una altra experimentació.
6.
En el sediment anterior tenim dues cadenes i si aconseguim separar-les podríem obtenir la cadena (-) aïllada. Així doncs, afegim PEG al 5% el que provoca la solubilització de la cadena (-) mentre que l’altre queda insoluble.
Aquest aspecte ens permet recollir la cadena (-) en un tub nou que anomenar tub B.
Per electroforesi podem comprovar que el tub A i B són purs.
Observem en el següent gel electroforètic on el carril (h) correspon a la banda de barreja de les cadenes (+) i (-) que migra més endavant perquè hi ha una part de doble cadena que migra més ràpid. En el carril (i) tenim únicament la cadena positiva i el carril (j) és la cadena negativa que no tenen cap contaminació per altres bandes.
12 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 ANÀLISI DE LES DIMENSIONS DE L’ESTRUCTURA PRIMÀRIA DEL DNA L’estructura primària d’aquesta particular molècula tècnicament ha representat un repte per poder-la analitzar en les seves dimensions ja que la manipulació és dificultosa.
Estudis amb el bacteriòfag T2 Elaborem un shock osmòtic amb aigua pura el que rebenta la càpside del bacteriòfag i permet la sortida del DNA.
S’elabora l’experimentació amb el mètode de Kleinshmidt en que s’utilitza el citocrom C.
Tenim una superfície de parafilm (és de caràcter hidrofòbic) i posem en aquest una goteta del DNA que volem visualitzar, tenint present que aquesta gota conté citocrom C. A més, posem una gota més gran d’un agent desnaturalitzant (formaldehid) i tapem amb una càpsula ja que el formaldehid és volàtil el que permet generar una atmosfera desnaturalitzant.
Aquesta atmosfera esmentada anteriorment permet la desnaturalització del DNA; es genera una capa de citocrom C desnaturalitzat amb la interfase aigua – aire (observable al microscopi) i com que el citocrom C té càrrega (+) el DNA té tendència a quedar-se atrapat en aquesta capa. Elaborem una evaporació de carboni per tal de generar una capa molt prima i transparents d’electrons.
Amb unes pinces toquem la superfície del carboni amb la superfície de la gota i aleshores, per adsorció el DNA unit al citocrom C s’uneix al carboni i després, quan ja tenim això elaborem una evaporació rotatòria per tal que el DNA quedi contrastat. Si introduïm plantí amb un angle de plantinació molt contrastant al final podem veure el DNA de forma molt clara. Observem però que obtenim com a diàmetre del DNA 20 nm (quan només en té 2nm) corresponent a un engruiximent per la capa de platí i citocrom C.
Cal saber que es pot observar el DNA sense elaborar tota aquesta tècnica però és més dificultós.
S’arriba a la conclusió que per cada micròmetre de DNA es necessitaven unes 3000 pb que el podem expressar com 3 10 nm/3000 pb = 0,33 nm/pb, un valor semblant als resultats de difracció del DNA.
13 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Estudis amb Drosophila En la següent figura veiem un intent d’estudi de la grandària del DNA; en aquest cas els autors van fer servir un altre material, la Drosophila i van elaborar un experiment que no es basava en la microscòpia electrònica ja que es tracta d’un organisme molt gran i per tant, van fer servir microscòpia òptica. Així doncs, el que fan és un treball d’autoradiografia d’un cromosoma de Drosophila.
Els autors van fer créixer les cèl·lules cultivades de Drosophila en presència d’un reactiu del DNA, entenem que aquestes cèl·lules es troben sobre una placa de vidre (portaobjectes) i com que el DNA es radioactiu podem elaborar una autoradiografia amb un material fotogràfic especial.
Les mostres van ser cobertes amb una emulsió fotogràfica (es va elaborar una pasta que contenia els mateixos components que el film fotogràfic i per tant, entre d’altres, contenia plata) i al cap de 5 mesos d0experimentació allà on el DNA estava van provocar una precipitació de planta, que és la base de la fotografia convencional. Així doncs, van obtenir en els llocs on hi havia DNA un senyal brillant. Ens fixem en la imatge anterior que està a escala 1 mm, de manera que en total tindríem una molècula de més d’un centímetre de longitud.
Hipòtesi uninèmica Els resultats obtinguts amb els experiments anteriors porten a la comunitat científica a la hipòtesi uninèmica. En aquesta hipòtesi es planteja que cada cromosoma contenia una sola molècula de DNA, que normalment té longituds molt grans: en Drosophila per exemple en vist que estava al voltant d’un centímetre; en humans sabem que en cada cromosoma (cromàtida) hi ha varis centímetres i en amfibis la totalitat de cada cromàtida pot superar 1 metre.
L’organisme eucariota que fins ara sabem que té un DNA més gran és una planta anomenada paris xicolita que té en cada cromàtida 3 metres seguits.
Tècnica citològica: separadors de cèl·lules amb activitat fluorescent Aquesta tècnica permet resoldre el problema de l’estructura primària. Els FACS (separadors de cèl·lules amb activitat fluorescent) són instruments que es fan servir per separar cèl·lules però en el límit també ens permeten separar cromosomes sempre que estiguin en la metafase i compactats. En el cromosoma (també es pot anomenar cromàtida) tenim una única molècula de DNA i en l’altre cromàtide una altra.
Si poguéssim separar els cromosomes humans tindríem que en un determinat tub hi ha el cromosoma 1,2... si tenim aïllats aquests cromosomes tenim accés en el DNA contingut en aquests de manera que, estem aïllant el DNA.
Per aconseguir les cèl·lules mitòtiques afegirem colcemid en un cultiu de cèl·lules n creixement. Aquest compost aturarà totes les cèl·lules que arribin a metafase de manera que, es van apilant cèl·lules en metafase, on tenim els cromosomes ben condensats. Lisem les cèl·lules elaborant un shock hipotònic de manera que obtindrem els cromosomes aïllats i els podrem portar als separadors de cèl·lules.
14 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Un separador de cèl·lules el que fa és canalitzar amb un rajolí prim els cromosomes de manera que es genera un raig on els cromosomes van un darrera l’altre perquè es tracta d’un fil de líquid realment prim. A més, el DNA està tenyit amb colorants fluorescents (Hochst 338 i cromomicina A) el que permet aconseguir que cada cromosoma a part de tenir una grandària diferent als altres també té una coloració fluorescent suficientment diferent de manera que entre la grandària i la fluorescència podem aconseguir separar-los.
Hem de tenir present però, que aquesta tècnica no és 100% perfecte però si que aconsegueix separar a la majoria de cromosomes. Els separadors tenen detectors que permeten veure la fluorescència que tenen els diferents cromosomes, aplicant un raig laser i mesurant la fluorescència que s’emet. Es pot mesurar la fluorescència i la llum dispersada de manera que, el detector és capaç de conèixer quin cromosoma viatja en cada gota.
Suposem que en l’experiment volem separar el cromosoma 1 i el 10 d’aquesta manera les gotes en qüestió tindran un o l’altre. Assignem a aquelles gotes amb el cromosoma 1 una càrrega negativa mentre que a les que tinguin el cromosoma 10 els hi donem una càrrega positiva.
Apliquem un camp elèctric amb uns elèctrodes el que provocarà que les gotes positives marxin cap a l’elèctrode negatiu i les negatives cap al positiu; aquelles gotes que no tenen cap cromosoma dels que ens interessa seran eliminades, no són retingudes.
Amb aquest mètode s’aconsegueix separar els cromosomes i per tant, tenir accés químic al DNA que contenen el que ens permet estudiar el DNA corresponent a cromosomes concrets.
15 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Tècnica de separació: electroforesi El problema que tenim principalment amb una electroforesi és que no pot resoldre cadenes de DNA massa llargues.
Sabem que podem elaborar gels de poliacrilamida o d’agarosa: Tipus de gels Gels de poliacrilamida Observem que segons la concentració que es posen dels monòmers que queden polimertizats podrem separar unes grandàries de DNA o unes altres.
La acrilamida si la poses molt concentrada (20% pes/volum) serveix per separar fragments que estiguin entre 6-100 pb mentre que a menys concentració (8%) serveix per separar fragments més grans ja que el gel és menys esponjós.
El mínim de concentració és 3,5% el que ens permet separar fragments de 1000-2000 pb i aquest no és un cromosoma eucariòtic on tenim aproximadament de 30-6000 megabases. Hem de tenir present que aquest és un mínim perquè sinó el gel deixa de ser consistent.
Gels d’agarosa Aquests gels permeten la formació de porus molts grans i el límit s’estableix a 0,3% mentre que el màxim és 2% on passats aquests valors el gel també deixa a de ser consistent. Amb un 2% podem arribar fins a resoldre 2kb però si volem augmentar i analitzar molècules més grans ho haurem desfer amb menys concentració d’agarosa fins arriar a un màxim en que només podem separar 50kb (fragments de 50kb). En aquest cas tampoc no podem diluir més l’agarosa perquè sinó el gel deixa de ser consistent.
16 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Límit establert pels gels Observant els següents resultats entenem perquè hi ha un límit: en la següent gràfica es representa la distància migrada respecte l’origen electroforètic i observem que hi ha una relació lineal respecte el logaritme de la massa molecular i la distància mirada. En aquest cas tenim el logaritme del nombre de parelles de bases però hem de tenir present que és un número proporcional a la massa molecular.
Es tracta d’un gel d’agarosa i tenim diferents concentracions d’aquesta, la més petita és 0,5% (si s’hagués elaborat amb 0,3% seria el mateixa) i hem de saber que la linealitat es compleix per un ampli rang. Arriba un moment que, independentment de la concentració totes les corbes tendeixen a posar-se paral·leles a l’eix d’ordenades (y) de manera que, la migració és pràcticament la mateixa, independentment del nombre de parelles de bases, per una certa grandària de les molècules de DNA.
Quan es passa aquest límit que és d’aproximadament 50 kb els gels d’agarosa són incapaços de fer la separació, de maner que, tenen un límit de resolució experimental. Aquest aspecte es satisfà també am els gels de poliacrilamida.
Millora capacitat resolutiva: electroforesi de camp polsant En un laboratori de Columbia es va aconseguir millorar la capacitat resolutiva del DNA el els anys 1980-1981 dissenyant un mètode de PFGE (electroforesi de camp polsant) que permet anar més enllà de la resolució explicada anteriorment.
Aquest consisteix en sotmetre el DNA a una electroforesi en el qual el camp elèctric no serà constant, normalment en una electroforesi convencional s’elabora un camp elèctric en el que el DNA sempre corre cap al pol positiu perquè té càrrega negativa però en aquest cas els camps elèctrics van variant.
En la imatge (E) es produeix una inversió de camp. El DNA es posa a les butxaques (pous) i aleshores s’inicia la electroforesi i per tant, el DNA de tots els pous comença a baixar perquè té l’elèctrode positiu al final. Quan el gel ja ha corregut durant una estona s’elabora una inversió, l’elèctrode positiu es col·loca a dalt de manera que, el DNA que estava baixant aleshores puja i aquest canvi es va elaborant a una freqüència determinada el que provoca la pujada i baixada de DNA i doncs el que ens permet és allargar més el recorregut del DNA i conseqüentment obtenir millors resultats.
En el cas (A) és un camp ortogonal o camp perpendicular. Un camp és el negatiu i positiu, que va d’adalt a baixa i l’altre és de negatiu a positiu que va d’esquerra a dreta. El gel es carrega com sempre i per tant, el DNA comença a corre cap a vall però al cap d’una estona es gira 90 graus de manera que correrà cap a la dreta. S’elaboren canvis amb una determinada freqüència el que ens permet també, augmentar la resolució.
17 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Amb aquesta metodologia Biologia Molecular T5 des del començament s’aconsegueix separar un DNA molt més gran que amb el límit establert amb anterioritat (aproximadament 50 kb). En la següent imatge observem un resultat primerenc en que totes les bandes tenen un pes molecular que queda reflectit en un gel no agradable a la vista. Amb el temps van aconseguir desenvolupar camps que tot i ser alternants tenen un producte final amb un bon resultat (imatge dreta), un resultat semblant a una electroforesi convencional i aquest s’aconsegueix fent servir el sistema (D) de la figura anterior.
Aquest sistema (D) parteix d’una forma hexagonal i és anomenada homogenius electrifal field on no són camps ortogonals sinó que estan d’acord al perímetre d’un hexàgon. Amb aquesta disposició aconsegueixen que els carrils siguin verticals però el que és més important és que la banda superior correspon a 2000 kb, el que ens permet veure que la resolució realment ha augmentat moltíssim.
Aquestes bandes que viem, cadascuna d’elles corresponen al DNA de llevat eucariota que es poden separar perfectament fent servir aquesta metodologia. Hem de tenir present però que més enllà d’aquesta resolució no podem anar.
Per exemple podem generar un pols cap a baix de 100V i l’altre també de 100 V però invertit, el primer es donarà als 10 primers segons mentre que el següent es donarà als 5 segons, repetint el cicle varies vegades. Si és una molècula curta de DNA, de 100 b per exemple, és fàcil de calcular: si fem baixar la molècula 10 segons mentre que únicament puja durant 5 segons sabem que corre 5 unitats netes, que formen part del numerador. En el denominador correspondria al temps que correria sense haver canviat la polaritat, és a dir, 15 segons (si el camp fos constant). Així doncs estem fent un equivalent d’una migració 5/15=1/3 que únicament és correcte si la molècula és petita ja que si és molt gran perd temps reorientant-se de manera que l’electroforesi permet discriminar de les molècules grans i les petites.
18 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Demostració que la hipòtesi és correcte Una prova a favor que aquesta hipòtesi és correcte es va elaborar de la ma de Carlos Bustamente, fent un treball que combinava la microscòpia de fluorescència amb l’electroforesi de camp polsant. Va preparar un gel electroforètic d’agarosa entre dos cubres del microscopi; en el gel hi havia molècules de DNA bastant grans i com que aquest DNA està unit a agents intercalants fluorescents el microscopi de fluorescència ens permetrà veure el DNA com a molècula única al mateix temps que s’està produint l’electroforesi. Cal tenir en compte però, que la molècula de DNA ha de ser petita perquè no es sobreposin les dades en l’experiment.
Observem en la següent imatge que durant estona la molècula ha elaborat la primera electroforesi cap a l’esquerra i desprès ha passat a elaborar-la cap a baix. El vector força principal s’ha començat a generar a 1,86 fins que domina completament i s’ha encarrilat cap a dirigir-se en el sentit cap avall. Hem de tenir present sempre que com més gran és la molècula més trigarà en reorientar-se, cosa que explica la capacitat discriminativa de l’electroforesi de camp polsant.
Tècniques de preservació de l’estructura primària del DNA Per elaborar aquest tipus de tècniques cal actuar com a químics i biòlegs, per analitzar dades grans és necessari el desenvolupament que ens permetin tenir el DNA intacte i per tant, parlem de tècniques de preservació de l’estructura primària, el que ens permetrà estudiar aquesta.
El que es va fer és fer servir un motlle que permetrà tenir intacte el DNA. Hem de tenir present que el DNA és una molècula fràgil que es pot trencar si el fem passar per llocs estrets, esforços mecànics, enzimàticament.... generalment podem trencar l’estructura del DNA per dues accions diferenciades:  Accions mecàniques: amb el tractament per pipetes o compressions  Accions enzimàtiques: una petita contaminació humana és suficient per trencar el DNA. Aquestes estan presents en l’aire i les mans de manera que, alhora de treballar amb el DNA sempre s’ha d’anar amb molt de compte Els autors d’aquesta tècnica s’inventen un motlle que és un bloc de plàstic amb diferents forats. En la part de sota es posa parafilm o algun tipus de cinta de plàstic i llavors ja es poden agafar les cèl·lules a estudiar. Introduirem un tampó de lisi (amb detergent SDS i proteïnasa K) de manera que les proteïnes quedaran trencades i separades del DNA.
19 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Si agafem n volum d’aquestes cèl·lules tractades (trencades i amb el DNA separat de les proteïnes) i els hi afegim un volum d’agarosa a 50 ºC (segueix sent líquida) mentre es barreja hi ha temps podem anar omplint els forats del motlle.
Sabem que amb un temps curt aquesta agarosa es solidificarà però dins tenim el DNA i aquesta no ha estat contaminat ja que el gel d’agarosa és pur. El motlle està perfectament net perquè no hi ha cap proteïna que estigui activa i una vegada tenim això podem treure el parafilm interior i s’agafa el bloc que volem amb una espàtula per obtenir un cub d’agarosa que té la mida exacta dels porus de les electroforesis.
El DNA que està dins, en realitzar una electroforesi surt del cub i està intacte de manera que, es manté l’estructura preservada, que és essencial en l’experimentació.
Enzims de restricció Els enzims de restricció estan associats a uns estudis realitzats per la modificació química, que està associada principalment a la metilació. En els procariotes pot quedar metilada tant l’adenina com la citosina. Aquest aspecte de la metilació està relacionat amb la epigenètica, que representen termes de genètica que van més enllà del que és l’estructura primària del DNA.
Podem utilitzar aquests enzims de restricció com a eina per estudiar l’estructura primària del DNA. Tenim una càpsula de Petri plena de bacteris en la qual introduirem el bacteriòfag λ, que si posem el medi necessari creixerà exponencialment amb els bacteris. On ha caigut el bacteriòfag durant el creixement s’acaben generant unes taques (calbes) que corresponen a zones clares de lisi provocades per la infecció. Durant l’experimentació es va utilitzar el bacteriòfag per infectar la soca E. coli K12, en la qual el bacteriòfag és altament infectiu. Es va utilitzar el mateix bacteriòfag per infectar la soca E. coli B i no es va observar tant infecció (-0.1%). Ara bé, els virus que resulten actius i generen calbes és perquè tenen els bacteriòfags. Hem de tenir present que cada soca té un tipus de variant del bacteriòfag λ que provoca una gran infecció.
El bacteriòfag infecta el DNA del bacteri on el DNA λ presenta seqüències reconegudes per nucleases bacterianes encarregades de fer la restricció. Si trobem aquesta seqüència la tallen i el bacteriòfag no pot fer res per perquè li estan tallant el DNA. Ara bé, si algun bacteriòfag té la sort que abans de la restricció, un altre enzim de tipus metilasa li posa metils en determinades posicions podrà evitar que la maquinària de tall actuï de manera que aquest bacteriòfag podrà infectar. A més, com que el DNA del bacteriòfag té metils farà que sigui més infectiu ja que dona menys feina a la maquinària de degradació.
Smith principalment estudiant els enzims de restricció va reconèixer un tipus d’enzims que tallen seqüències molt específiques, la qual cosa ens permetia obtenir fragments de DNA de seqüència i longitud definida.
20 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Hi ha tres tipus d’endonucleases, és a dir, que tallen la part interna del DNA: endonucleases tipus I i II que tenen les mateixes característiques aproximadament i endonucleases tipus II.
Sabem que les nucleases tenen activitat nucleasa i metilasa. En el cas de les de tipus I i II aquestes activitats es troben en una mateixa zona, que està allunyada de la zona de reconeixement. Les de tipus II no compleixen els aspectes anteriors i són les que Smith afirma que son unes grans eines per la biologia molecular ja que si no hi ha metilació no actuen. Així doncs hem de tenir present que tant els enzims de restricció com les tècniques d’hibridació han permès grans avenços en l’enginyeria genètica i biologia molecular.
Dins dels enzims de restricció tipus II cal remarcar la importància de EcoRI, un dels enzims que tenen com a bacteri E.
coli. aquest talla la seqüència de la imatge anterior que va de 5’a 3’ tenint en compte també la cadena complementària.
La fletxa indica el punt de tall i s’ha de mirar la simetria de tall per l’altre costat. La cadena és palindròmica i té un eix de simetria binari, és a dir, fent un gir de 180 º s’obté la mateixa seqüència. Quan es separi hi ha haurà trossos monocadena de manera que talla en extrems cohesius.
Un altre exemple de enzims de restricció tipus II és la Sma1, que talla en el centre de la seqüència de reconeixement i també és de caràcter palindròmic. En aquest cas no es generen extrems cohesius sinó que són roms o plans.
Hi ha que tallen seqüències de reconeixement curtes i la seqüència de reconeixement més llarga de la taula correspon al famós enzims Not1, que talla una seqüència de 8pb. En general no reconeixen seqüències molt llargues i aquest aspecte és important perquè en el genoma se’n troben moltes i hi hauria molts llocs de tall amb aquestes seqüències.
Sabem que els enzims de restricció poden reconèixer diferents seqüències de nucleòtids i en funció del genoma que estem estudiant, trobarem més o menys aquesta seqüència i per tant, hi haurà més o menys llocs de tall.
21 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Probabilitat de tenir una seqüència reconeguda per un enzim de restricció A continuació veurem un exemple per tal de veure quina és la probabilitat de tenir una seqüència que pugui ser reconeguda per algun dels enzims de restricció que trobem a la taula anterior.
Definim n com la mida del genoma i en aquest cas . Recordem que el nostra genoma és de 3 Gb.
Primer de tot calculem quantes vegades trobarem una A en el genoma. Cal tenir present que aquest valor coincideix per a les altres bases (G, C i T). Ho fem sabent que:  La proporció d’A respecte de les altres bases possibles és de ¼=0,25.
 Disposem d’un DNA de doble cadena i per tant, tindrem 2·10 pb.
9 La probabilitat de trobar una A en el genoma serà de: També podem calcular quina és la probabilitat de trobar una determinada seqüència en el genoma. Per exemple, podem calcular la probabilitat de trobar: GAATTC (6 nucleòtids) com: Obtenim que la probabilitat de trobar aquesta seqüència de 6 nucleòtids pren un valor molt elevat. Si el càlcul el fem per a una repetició de 8 nucleòtids, la probabilitat serà més petita que en el cas anterior però continua sent molt gran. Per tant, podem concloure que els enzims de restricció tallen per molts llocs.
Per tenir enzims de restricció que tallin per pocs llocs, necessitem tenir una seqüència específica d’uns 12 nucleòtids. Si fem el càlcul de probabilitat obtenim: En aquest cas obtenim que la probabilitat de trobar una seqüència de 12 nucleòtids repetida és de 119 i en aquest cas el nombre de llocs és molt més petit. Cal tenir present però, que a la natura no en trobem cap enzim de restricció que sigui específic per a tants llocs de tall.
Les dades que observem a la gràfica són coherents amb els resultats que hem obtingut anteriorment. Veiem representats per seqüències més variades (de fins a 20 nucleòtids) quin és el logaritme del nombre de llocs de tall per genoma. Veiem que a mesura que la seqüència de reconeixement és més gran, el número de llocs de tall és més petit.
Cal tenir present que la dificultat per resoldre l’estructura primària continua tot i tenir enzims de restricció. Aquests ens ajudaran però necessitem d’altres tècniques que ens complementin.
22 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Reconeixement de seqüències específiques Un es pot imaginar que el DNA és una estructura monòtona, és a dir, un cilindre sense diferencies estructurals i aquest fet el diferencia molt de les proteïnes ja que poden adoptar un munt de conformacions. Cal tenir present que aquesta estructura no és completament monòtona ja que sí que hi ha dos elements, el fosfat i la ribosa, que es mantenen però el tercer que fa referència a la base nitrogenada ser de 4 tipus (A, G, C i T).
En un principi va sorgir la idea que els enzims de restricció havien de reconèixer seqüències específiques, és a dir, havien d’interaccionar amb les bases. A la següent imatge veiem representats els ponts d’hidrogen que es formen quan les bases interaccionen; la part superior de la imatge fa referència al solc gran i la inferior al solc petit.
En el cas de la interacció A – T veiem que l’oxigen és un potencial generador de ponts d’hidrogen i que actua com a acceptors. També tenim una amina on l’hidrogen pot actuar com a donador i després un nitrogen que pot actuar com a acceptor. Per tant, en el solc gran, la parella AT té la capacitat de fer 3 ponts d’hidrogen: 2 amb acceptor i 1 amb donador; en el solc petit observem que es poden elaborar 2 ponts d’hidrogen i tots dos per acceptor. Aleshores, trobem que la formació de ponts d’hidrogen és diferent en el solc gran i petit.
En el cas de la interacció C – G observem que en el solc gran es poden produir 3 ponts d’hidrogen: 2 acceptors i 1 donador i en el solc petit: 2 acceptors i 1 donador.
Amb ajuda de la imatge podem veure que la disposició és diferent en els dos casos i les distàncies també ho són. Per tant, se suposa que és aquesta la causa per la qual es produeix un reconeixement específic de les seqüències que tenen els enzims de restricció.
La interacció específica proteïna – DNA serveix perquè els enzims de restricció puguin tallar les seqüències de DNA i també perquè els factors de transcripció reconeguin seqüències específiques i s’uneixin. Amb els coneixements que es tenen avui dia sobre aquest àmbit es poden explicar i nosaltres veurem en detall el cas de Eco RI, un enzim de restricció molt estudiat.
Com a concepte antitètic a l’anterior trobem la interacció inespecífica proteïna – DNA que l’estudiarem a partir d’un seminari de problema.
23 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Experiments fets amb cocristalls EcoRI A l’any 86 es va publicar un estudi en el qual els autors van fer un cocristall que contenia l’enzim EcoRI i una seqüència d’un oligonucleòtid concret que contenia la seqüència reconeguda per l’enzim de restricció. Van elaborar la resolució d’aquesta estructura amb raigs X però el que veiem a la imatge no és tota l’estructura completa ja que si la posem completa no es veu res de tot el volum que ocupa. Concretament, veiem representat l’oligo i la meitat de la proteïna. Recordem que les seqüències reconegudes tenen un eix de simetria binari que fa referència a la meitat; així doncs, es tracta d’un dímer que és la estructura més senzilla que coneixem i que té simetria.
Si representem més globalment el complex, tenim les dues subunitats on el DNA va en una altra direcció, concretament el DNA es veu des de la part superior, i queda molt més interactuat per la part dreta que per l’esquerra, En la imatge podem comparar la interacció de la proteïna (dreta) amb la seqüència de reconeixement (esquerra). Les bases no estan apilades de manera vertical perquè vol reflectir la forma helicoïdal de l’estructura. En verd veiem subratllat la subunitat β i en blau la subunitat α.
L’aminoàcid número 200 de la subunitat β és una arginina que es destaca perquè fa ponts d’hidrogen, actuant com a acceptor, amb la primera guanina i els pot fer amb el N7 de o bé amb el O6 de la G. Aquestes interaccions es podien preveure abans de demostrar-ho.
El glutàmic de la posició 144 de la subunitat β pot fer dos ponts d’hidrogen amb l’oxigen, actuant com a acceptor amb una A del pis de sobre i amb una A del de sota.
L’arginina 145 de la subunitat β pot fer dos ponts d’hidrogen on actua com a donador i interacciona amb dos nucleòtids de T.
Per tant, la subunitat β té la capacitat de fer 6 ponts d’hidrogen. Per una altra banda, la subunitat α fa el mateix però de manera simètrica. Com a conseqüència d’aquestes interaccions tenim un reconeixement perfecte i específic de la seqüència i els talls es produiran on indiquen les fletxes de la imatge de la dreta.
24 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Enzim modificador: metilasa A la imatge veiem un esquema de la reacció catalitzada per un enzim modificador , una metil transferasa, i que va ser el primer enzim en estudiar-se en cocristall.
El cocristall va permetre veure com es produïa el reconeixement; en aquest cas hi ha alguna diferència respecte EcoRI ja que el reconeixement provoca alhora una deformació de la doble hèlix, tal com podem veure a la imatge. L’enzim per modificar i metilar el que fa és agafar la base, treure-la de la doble hèlix i ficar-la dins del centre catalític.
A la figura de la dreta només veiem el DNA i com la base que ha de ser metilada surt de la doble hèlix. Els autors d’aquest treball van fer servir un substrat modificat de manera que en el cocristall, l’enllaç transitori que elabora l’enzim amb el DNA no es trenqui.
Quan van preparar el cocristall ho van fer en absència de magnesi. El motiu d'això és que per fer l'activitat catalítica, aquest enzim necessita de la presència de magnesi com a cofactor. Al fer el cocristall sense magnesi, l'enzim reconeix el lloc, s'enganxa però no pot fer la catàlisi. En conseqüència, aconseguim tenim el complex enganxat i sense progressió.
Això fa que els autors puguin dir que han aconseguit un cristall a la forma prèvia al tall ja que ells pensen que hi ha dues conformacions: una prèvia al tall i una altra posterior.
Els enzims de restricció, els enzims modificadors com les metilases o qualsevol enzim que faci interacció específica, elaborarà el reconeixement mitjançant ponts d’hidrogen.
25 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Tècniques que utilitzen enzims de restricció Producció de DNA recombinant Imaginem que tenim dos DNA llargs (DNA I i DNA II) que contenen la mateixa seqüència de reconeixement per EcoRI, representada a la imatge. Si apliquem EcoRI es produiran fragments que presenten extrems cohesius fent que fragments dels dos DNA inicials puguin interaccionar entre ells i es produeixi una hibridació. Si afegim una lligasa es podran unir els dos DNA i així obtindrem una molècula de DNA recombinant o també coneguda com molècula quimèrica que contindrà una part del DNA I i una altra del DNAII. Aquest fet és la base de la enginyeria genètica.
Amplificació de DNA recombinant El DNA recombinant que hem produït el podem amplificar per obtenir tantes còpies com en vulguem i això ho podem fer a partir de bacteris. El DNA que volem amplificar l’introduïm prop d’unes seqüències que puguin ser tallades amb enzims de restricció en el vector i que generin extrems cohesius. Per tant, si tenim un vector de clonació que tingui dianes que poden ser tallades pels enzims de restricció, podem fer que els extrems cohesius interaccionin i s’uneixin (aplicant lligases) per tal d’obtenir un plasmidi o el DNA d’un bacteriòfag amb el gen que volem. Per poder inserir el vector en els bacteris es farà un tractament amb clorur de calci.
Normalment, se solen afegir seqüències que donen resistència a antibiòtics i d’aquesta manera, després de fer la transformació amb els vectors, podrem reconèixer quins bacteris han quedat transformats i quins no ja que únicament creixeran aquells que han incorporat el plasmidi. Així doncs, mitjançant tècniques de microbiologia bàsiques podrem amplificar aquests bacteris.
26 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Southern blotting Recordem que els enzims de restricció tallen en llocs específics però tallen per molts llocs. Per tant, si tenim un genoma i el digerim amb enzims de restricció, tindrem molts llocs de tall i molts fragments que no ens permetran estudiar l’estructura primària de la seqüència que nosaltres volem.
Aquest fet s’ha aconseguit solucionar amb la tècnica de transferència de membrana o la tècnica de blotting que vol dir assecar, xuclar quelcom que està en una superfície. En aquest cas l’efecte secant serà entre el gel i el paper de filtre que posem damunt el gel electroforètic.
Partim d’una electroforesi en la qual hem posat DNA a les diferents butxaques: en la primera haurem carregat un marcador de DNA digerit amb fragments de pes molecular conegut i en les altres les nostres mostres d’interès que haurem digerit amb enzims de restricció. Com que hi ha tants llocs de tall tindrem moltes bandes de PM molt divers i el que observarem serà una llapisada. Amb això no podem saber quina és la banda que correspon a la seqüència que ens interessa, amb el que ens estaríem apropant a l’estructura primària que és el que volem. L’investigador Southern es va inventar la manera de poder fer aquest reconeixement.
Després de fer la electroforesi actuarem d’una manera o altra en funció de les característiques del nostre gel:  Si el gel no era desnaturalitzant, per poder aplicar el següent procediment cal desnaturalitzar-lo.
 Si el gel era desnaturalitzant, cal sucar-lo en una dissolució de medi alcalí (NaOH) suficientment bàsica com perquè les cadenes de DNA es dissociïn.
Una vegada hem fet l’estratègia anterior, damunt del gel col·loquem una membrana (filtre) que farà la funció d’assecant i que sol se de nitrocel·lulosa o de Nylon. Per tal que es produeixi la transferència de les bandes a la membrana el que fan és posar sota del gel un líquid (tampó) que estigui en contacte amb ell. A la part superior el que es posa són papers assecants que no tinguin gens de líquid i en conseqüència, per capil·laritat, el líquid passa a través del gel i anirà a tocar la membrana de Nylon o nitrocel·lulosa fent que les bandes del gel quedin reflectides a la membrana. Això és el que es coneix com a blotting.
27 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 El fet de posar-ho en el paper ens permet fer després una hibridació de reconeixement. En el gel, tot i ser porós, les bandes de DNA no estan accessibles a la hibridació però en el paper sí ja que aquí, les molècules de DNA estan enganxades.
La grandària del model de Southern recau en el fet que es pugui fer una hibridació de les diferents bandes. Aquest fet és molt important i es creu que va concebre la tècnica quan era jove però no va patentar el seu mètode. En conseqüència, van haver-hi dues còpies: va aparèixer el Northern blotting que utilitza el mateix principi però aplicat a RNA i el Western blotting que està aplicat a proteïnes.
El DNA monocadena que queda unit als filtres està molt perifèric de manera que existeix el perill de perdre’l quan elaborem rentats ja que es pot desenganxar. A la pràctica no es desenganxa fàcilment però per evitar que passi hi ha dues tècniques: 1.
Incubar la membrana, després de fer la transferència, a una temperatura adequada.
2.
Si treballes amb membranes de Nylon i la irradies amb UV, es produeixen enllaços covalents entre el DNA que està adsorbit i la membrana de manera que queda fixat.
Una vegada fet això, s’agafa la membrana i es posa dins d’un sac de plàstic amb un tancament hermètic i dins d’aquest sac s’afegeix el líquid d’hibridació fent que el DNA que tingui la seqüència complementaria hibridi. Aquet mètode de posar-hi dins d’un sobre de plàstic és una forma més primitiva i avui dia tenim estufes d’hibridació que simplifiquen el procés.
1.
Disposem d’uns taps de vidre de forma cilíndrica i amb un tap que rosca molt bé on enrotllem el filtre com un papir romà i l’omplim de líquid.
2.
Ho introduïm dins de l’estufa on va donant voltes, fent que el líquid i la sonda toquin tota la superfície de la membrana, tot i estar enroscada.
Aquest segon mètode ens permet hibridar una membrana de dimensions més grans, que poden arribar a tenir fins a mig metre.
Només en els llocs on hi ha hagut hibridació, si la sonda és radioactiva, quan fem la autoradiografia mitjançant un film fotogràfic i revelant, veurem únicament bandes allà on hagi hagut hibridació. Per tant, de l’embolic de bandes tant gran del qual partíem hem arribat a un reconeixement d’unes determinades estructures primàries que ens permetran fer treballs.
Així doncs, hem detectat seqüències específiques i les hem localitzat en un gel electroforètic, la qual cosa ens permetrà seguir avançant en l’estudi de l’estructura primària.
28 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Aplicacions dels enzims de restricció Mapes de restricció Els enzims de restricció també ens permeten establir mapes de restricció que són una mena de mapes físiques que es poden fer del genoma.
Imaginem que tenim un fragment de DNA al qual hem una marca radioactiva en l’extrem 5’, si apliquem un enzim de restricció com EcoRI, aquest tallarà per on tingui especificitat i només tindran radioactivitat alguns dels fragments.
Si fem una electroforesis i posteriorment una autoradiografia, obtindrem una sèrie de bandes que ens permetran, en relació al terminal 5’ que hem marcat, establir una sèrie de punts de talls que corresponen al mapes del restricció.
Elaborar aquest tipus de mapes pot ser important per fer experiments posteriorment.
Si combinem els mapes de restricció amb una hibridació amb sondes podem arribar a obtenir un autèntic mapa físic d’un genoma. Veurem l’aplicació a un cas concret on pretenien establir el mapa físic d’E. coli K12 on volien determinar si el mapa físic era molt diferent respecte el mapa genètic.
Van fer un esquema linealitzat del genoma d’E. coli, ja que recordem que aquest és circular. El bacteri té un genoma petit si el comparem amb el nostre però tot i això podem dir que es tracta d’un genoma gran, d’uns 4 milions de pb. Van elaborar digestions amb diferents enzims de restricció i el que més va ajudar va ser el Not I que talla reconeixent 8 pb; en E. coli aquest enzim de restricció fa talls però no masses i això és bo per poder estudiar l’estructura primària.
Tenien un problema i és que amb l’electroforesi convencional no es poden separar trossos mot grans i en conseqüència van haver d’elaborar una electroforesi de camp polsant. Aleshores, amb sondes corresponents a diferents gens d’ E. coli que hibriden seqüències específiques, el que van fer és mitjançant la tècnica de Southern veure a quins gens corresponien les bandes que havien obtingut. Cada ratlla corresponia a la posició física d’un gen d’E. coli.
Finalment van veure que a grosso modo, el mapa genètic i el mapa físic d’E. coli lliguen. Hi ha algunes desviacions, però globalment sí que lliguen. Cal tenir present que el mapa físic és superior ja que és una demostració clara de la posició dels gens en un genoma determinat.
29 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 Polimorfisme en la longitud dels fragments de restricció Imaginem que, pel motiu que sigui com ara diagnòstic clínic o un cas de medicina forense, volem saber si una mostra de DNA complicada com una taca de sang o DNA tret d’un fetus humà tenim un gen en forma d’al·lel I o d’al·lel II on l’al·lel II pot ser una mutació patològica.
Per fer-ho agafem el DNA d’aquestes mostres i el digerim amb enzims de restricció adequats per l’experiment.
Elaborem una electroforesi i posteriorment un Southern blotting i hibridació amb les sondes adequades. En aquest cas concret, l’al·lel II quedarà representat com 2 bandes al gel i l’al·lel II únicament presentarà 1 banda. Això és degut que l’al·lel I té 3 llocs de tall a la regió d’interès i en conseqüència obtenim 2 bandes (fragment A i B); en l’al·lel II únicament trobem dos llocs diana i en conseqüència obtindrem un únic fragment que és molt més llarg que els anteriors (fragment C) representat en 1 banda.
Aquest fet ens permetrà determinar si un al·lel presenta la mutació o no. Així doncs, amb un bon disseny experimental obtindrem uns resultats molt clars i és en l’elecció de les sondes on resideix la complexitat en aquest tipus d’estudis.
L’exemple que hem vist ens indica que els llocs de tall en el fragment són heretats segons les lleis de la genètica mendeliana clàssica.
Les aplicacions d’aquesta tècnica són molt importants i principalment són:  Diagnòstic de malalties hereditàries.
 Identificació d’individus. Els genomes humans tenen una gran variabilitat en la seva seqüència; hi ha uns mètodes que estan posats a punt amb els enzims de restricció adequats que ens permetran determinar si una mostra de DNA pertany a un individu o a un altre.
Aquest tipus d’estudis estan sotmesos a tota mena de problema d’anàlisi química, és a dir, es podria amplificar també el DNA d’una persona que era ocasional en aquell escenari, poden haver-hi contaminacions ambientals... i és per aquest motiu que no és una proba totalment fiable en algunes ocasions.
Per treballar en aquest àmbit s’ha de ser un especialista. També trobem una altra especialització i és en l’àmbit de la bioètica, és a dir, marcar fins a quin punt l’analítica és fiable.
Tot i que amb els estudis que hem vist no arribem a la seqüència primària, hi ha tècniques que sí que ens donen informació sobre aquesta, quan fèiem servir el polimorfisme dels enzims de restricció per identificar individus.
30 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Biologia Molecular T5 En un altre experiment que van fer, van aconseguir separar les dues cadenes d’un fragment de DNA de 146 pb que havien clonat i que corresponia a un nucleosoma. Quan es van analitzar les cadenes amb un gel de poliacrilamida, tot i tenir la mateixa longitud, la cadena (+) tenia una migració més lenta que la cadena (-) que corria una miqueta menys. Aquest fet és curiós ja que es tracta de DNA de la mateixa longitud i tenen migracions diferents.
La tècnica del single – strand conformation polymorphism serveix per fer estudis d’una manera semblant a com es fan els estudis de polimorfisme dels fragments de restricció que hem vist anteriorment. Volem determinar si tenim l’al·lel 1 o el 2 (mutant) però en aquest cas, quan elaborem l’electroforesi obtenim bandes a la mateixa alçada; hi ha una possibilitat de veure diferències en l’estructura primària dels dos al·lels si separem la cadena (+) de la (-). Per tant, si hi ha diferències en les seqüències dels dos al·lels, aquest mètode basat en el polimorfisme ho podrà detectar per una diferència de mobilitat.
Després de fer els gels amb les cadenes separades i de fer la detecció amb la sonda corresponent, trobarem bandes a alçades diferents, és a dir, les monocadenes tenen diferents migracions. Per justificar aquesta diferència de mobilitat hem d’anar a la seqüència primària: si hi ha diferències en la seqüència i el gel que es fa servir és no desnaturalitzant, els aparellaments intramoleculars que pot fer l’al·lel 1 poden ser diferents als aparellaments que pot fer el 2. Així doncs, aquesta diferència en l’estructura primària fa que l’estructura intramolecular que genera un i l’altre sigui diferent tenint conseqüències directes en la mobilitat electroforètica.
Això explica perquè rep el nom de single – strand conformation polymorphism on petites modificacions en la seqüència poden provocar una conformació diferent i que tingui una mobilitat diferent.
31 ...