Biologia Molecular. Tema 1 (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biología Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 18
Fecha de subida 25/08/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Biologia molecular i tècniques de DNA recombinat Antoni Benito, Santiago Ruiz i Maria Vilanova TEMA 1: ÀCIDS NUCLEICS I : ADN 1.1 Estructura primària dels àcids nucleics. La dobl hèlix de Watson i Crick. Altres conformacions del DNA. Autocomplementarietat. Topologia. Nivells superiors d’estructuració del DNA procariota i eucariota Estructura d’un nucleòtid El DNA és el material genètic tant en organismes eucariotes, com procariotes i alguns virus. El DNA està format per una sèrie d’unitats estructurals, anomenats nucleòtids. El DNA es tracta d’un polinucleòtid, ja que conté un alt nombre de nucleòtids. Quan conté poques quantitats de nucleòtids rep el nom de oligonucleòtids. Quan només tenim la base nitrogenada i la pentosa, el compost resultant rep el nom de nucleòsid.
Un nucleòtid esta format per tres components: L’element central, que és un sucre (furanosa), concretament 2’- desoxiribosa en DNA i ribosa en RNA. En aquest sucre se li afegeix una base nitrogenada, que pot ser una purina (adenina o guanina), o bé una pirimidina (citosina, timina i uracil en el cas del RNA).
A part d’aquests dos components, n’hi ha un tercer, que és un àcid fosfòric t que s’uneix amb el grup hidroxil que tenim unit a l’enllaç 5’ de l’anell de ribosa mitjançant un enllaç fosfoèster i provoca l’alliberació d’una molècula d’aigua. A pH neutre aquest grup fosfat es troba totalment ionitzat i presentarà càrrega negativa.
Conformacions de l’anell de ribosa La ribosa i la 2’- desoxiribosa no presenten els enllaços de l’anell en el mateix pla, sinó que poden tenir diferents conformacions. Hi ha un àtom que sobresurt i que correspon al carboni 2 o 3. Aquest, pot estar per damunt del pla que formen els altres àtoms i rep en nom de c-2’-endo. Si és per sota del pla rep en nom de c-2’-exo i en aquest cas, l’àtom està al mateix pla que el carboni 5’. El c-2’-endo és el que trobarem en la doble hèlix de Watson i Crick.
Esquelet de les bases nitrogenades Les bases nitrogenades són compostos heterocíclics, i en aquest cas el enllaços sempre es troben en un mateix pla. No posem ‘ en l’enllaç de les bases nitrogenades, per així distingirlos dels enllaços del sucre.
Existeixen dos grups, segons si tenen com a esquelet bàsic un anell de pirimidina o bé un esquelet de purina. La unió entre la base nitrogenada i el sucre es realitza mitjançant enllaç n-glucosídic entre l’enllaç N1 en el cas de les pirimidines i en el N9 en el cas de les purines, al carboni 1’ de l’anell de ribosa o 2’-desoxiribosa. La base nitrogenada te caràcter hidrofòbic, és a dir, apolar i també una mica bàsic.
En el cas de la anell bàsic de les purines, tenim que pel cas de l’adenina té un grup amino en la posició 6 i en canvi la guanina té un grup ceto en la posició 6 i un grup amina en la posició 2.
En el cas de l’anell bàsic de les pirimidines, tenim que pel cas de la citosina té un grup carbonil a la posició 2 i grup amina a la posició 4. En canvi per la timina tenim un grup carbonil a la posició 2 i 4 i a la posició 5 hi penja un grup metil. En l’uracil l’estructura és igual que la timina però en aquest cas no presenta el grup metil.
Formes tautomèriques de les bases nitrogenades Cada base pot tenir dos estats tautomèrics, segons la localització dels dobles enllaços. En pirimidines trobem la forma amino i forma imino. Per passar d’una forma a una altra és necessari canviar els dobles enllaços de lloc i perdre algun hidrogen. En canvi en les purines les dues formes tautomèriques reben el nom de ceto i enol. En la natura dominen les formes ceto i amino.
L’habilitat de les bases per formar el tautòmer alternatiu és una font significativa d’error de replicació. Com que les bases nitrogenades són les que porten la informació genètica, aquestes són capaces de reconèixer determinades proteïnes, per tant en el cas de formar el tautòmer alternatiu pot variar el reconeixement àcid nucleic-proteïna, induint així a errors en la replicació.
Enllaços N-glucosídics dels nucleòtids en conformacions sin i anti Un altre aspecte que uneix la ribosa amb la base nitrogenada és que l’enllaç N-glucosídic que uneix el N1 en el cas de les pirimidines i en el N9 en el cas de les purines, amb el carboni 1’ de l’anell de ribosa o 2’-desoxiribosa té la capacitat de rotar amb moviment lliure (de 360º) d’un anell respecte de l’altre. El pla que conté els àtoms de ribosa és perpendicular al pla que conté els àtoms de l’anell de la base nitrogenada.
Existeix la conformació sin i anti segons la posició de la base nitrogenada. Aquest fet té conseqüències en l’estructura de la doble hèlix del DNA. Quan la conformació de l’enllaç glicosídic és anti el posicionament de l’anell de ribosa respecte el pla de les bases nitrogenades canvia significativament respecte quan la conformació de l’enllaç glicosídic és sin (hi ha un gir de 180º).
Estructura primària del DNA El DNA presenta una estructura primària (cadena senzilla, ssDNA o bé cadena doble, dsDNA). Aquesta estructura primària es tracta d’un esquelet format per diverses unitats de ribosa units a l’altre nucleòtid mitjançant un enllaç fosfodièster. El grup fosfodièster es forma entre el grup hidroxil de la posició 3’ d’una pentosa amb el grup fosfat en 5’ de l’anell de la 2’-desoxiribosa del nucleòtid adjacent.
A l’inici de la cadena tenim un grup fosfat en la posició 5’ lliure i quan acabem la cadena sempre tindrem un grup hidroxil en la posició 3’ lliure. Per tant podem dir que la cadena té polaritat.
Escriurem les cadenes d’àcids nucleics sempre de sentit 5’  3’.
Quan escrivim una cadena d’àcid nucleic podem fer-ho de diverses maneres, com per exemple de la manera com s’il·lustra a sota, però com tota la cadena de sucres-fosfat és idèntica al llarg de tota la seqüència i l’únic diferent són les bases nitrogenades, hi ha la possibilitat d’escriure només les bases. Per tant per conveni sempre s’escriurà per exemple ACGTA de 5’ a 3’.
Estructura secundària del DNA Posteriorment a l’estructura primària del DNA, es forma una estructura secundària amb la unió de les dues cadenes de nucleòtids a partir d’enllaços no covalents. Els grups de l’anell de ribosa presenten grups hidroxil i per tant es consideren que tenen un caràcter polar, hidrofílic igual que el grup fosfat.
En canvi les bases nitrogenades tenen cert caràcter hidrofòbic o apolar.
L’estructura secundària descrita per Watson i Crick està formada per dues cadenes helicoïdals de polinucleòtids enrotllades una sobre l’altre en sentit dextrogir (seguint les agulles del rellotge). Aquestes cadenes helicoïdals corren en orientacions o sentits antiparal·leles, la unió de les bases les col·loca amb polaritats oposades. Una de la cadena va de dalt cap a baix de 3’ a 5’ i l’altre va de baix cap a dalt de 5’ a 3’. Els enllaços fosfats i els sucres queden a la part externa de la cadena i les bases nitrogenades queden amagades dins l’esquelet format pels sucres i els fosfats.
Ponts d’hidrogen entre els parells de bases En l’estructura secundària l’adenina s’uneix a la timina i la citosina a la guanina. Entre els parells de bases es formen ponts d’hidrogen (A i T 2 enllaços per pont d’hidrogen i entre C i G 3 enllaços per ponts d’hidrogen). Van descobrir que entre les dues cadenes només hi podien cabre una purina i una pirimidina, ja que si es col·locaven dues purines, aquestes eren massa grans i per tant la estructura secundària quedava deformada, perdent estabilitat. En canvi si es situaven dues pirimidines, eren dues bases nitrogenades massa petites i no arribaven a connectar-se per ponts d’hidrogen, perdent també estabilitat. A més a més de que hi ha d’haver una purina i una pirimidina, els aparellaments només poden ser A-T i C-G, perquè en el cas de substituir una purina per una altre, la disposició dels àtoms no permet la formació dels enllaços per pont d’hidrogen i per tant perdríem estabilitat.
Les dues cadenes corren en sentit antiparal·lel. Una cadena no és idèntica a l’altra, sinó que és complementària. Les dues cadenes són complementàries, coneixent la seqüència d’una cadena coneixem la de l’altra.
Els plans de les bases nitrogenades no estan totalment un sobre l’altre, sinó que veuríem que un pla esta desviat sobre l’altre amb un angle de 36º. Per tant cada 10 parells de bases tindrem la base repetitiva, és a dir no tindrem el mateix pla fins al cap de 10 parells de bases. La distància entre un parell de bases i l’altre és de 3,4 Àngstroms, després de 34 Àngstroms tornarem a tenir el mateix pla que l’inicial. Això serà la volta d’hèlix de la doble hèlix de Watson i Crick. El diàmetre de la hèlix és de 20 Å.
Importància dels solcs gran i petit Les bases nitrogenades son pràcticament perpendiculars a l’eix de la doble hèlix. La doble hèlix presenta dos solcs (solc gran i solc petit). Aquests, tenen importància en l’exposició de les bases nitrogenades cap a l’exterior perquè així les bases nitrogenades puguin ser reconegudes per proteïnes. Els extrems dels parells de bases estan exposats en els dos solcs permetent interaccions per pont d’hidrogen o Van der Waals.
El solc més informatiu és el solc gran i que té major capacitat de reconeixement de proteïnes, ja que per exemple en la unió de G-C tenim acceptor (A), acceptor (A), donador (D) i hidrogen (H) i en el solc petit tenim A, D i A. si girem el parell de bases nitrogenades tindrem C-G i tenim H, D, A i A en el solc gran i en canvi en el solc petit A, D i A.
El solc petit no és tan informatiu perquè tenim acceptor, donador acceptor, encara que hàgim girat la parella de bases. El mateix passa per la parella de bases T-A.
Motius estructurals de reconeixement de la seqüencia de DNA Els motius o estructures supersecundàries són la combinació de vàries unitats simples d’estructura secundària (proteïnes) que estan organitzades amb una geometria específica.
Són una part molt petita que no arriba a domini (estructures globulars compactes, formades a partir de la combinació de motius) i que té unes característiques particulars. La seva característica en aquest cas és el reconeixement de proteïnes de DNA.
Hi ha proteïnes que interaccionen amb el DNA i tenen dominis concrets que permeten el reconeixement de seqüències del DNA. A procariotes hi ha un domini hèlix-turn-helix que reconeix seqüències del solc gran.
A eucariotes hi ha un domini similar que està format per tres hèlix que reconeixen nucleòtids del solc gran (homeodomini). Cada homeodomini consta de 3 hèlix α: dos d’elles en conformació HTH (interaccionant amb el solc petit) i una tercera hèlix que contacta addicionalment amb les bases del DNA a través dels solcs grans.
Els dits de zinc està formada per diferents unitats, una hèlix que interacciona amb residus del DNA a través del solc gran. Cremalleres de leucina (presents tant a eucariotes com procariotes) estan formades per un domini de dimerització (residus de leucines, representat en color verd) que interaccionen amb solc gran del DNA. En alguns d’aquets motius es coneix la correspondència entre els aminoàcids dels solc gran, i en funció de la seqüència es pot saber quins nucleòtids reconeixen. Hi han determinades seqüències d’aminoàcids que es corresponen a seqüències de nucleòtids i permeten fer canvis en el genoma  addicions genòmiques.
Forces que estabilitzen la doble hèlix Les forces que estabilitzen la doble hèlix són forces febles. El primer tipus de forces que estabilitzen la doble hèlix són les forces per pont d’hidrogen entre les bases nitrogenades. La parella G-C estabilitza la doble hèlix en 3 Kcal/mol i la parella A-T en 2 kcal/mol.
L’estabilització de la doble hèlix per forces ve donat sobretot per un component entròpic, degut a la pèrdua d’ordre de les molècules d’aigua en la formació de la doble hèlix. Quan l’energia lliure és baixa, la molècula és més estable i sempre tenim un component entropic (la variació d’energia lliure és mes baixa ja que hi ha un increment d’entropia). Quan tenim una cadena senzilla, les bases nitrogenades estan exposades al solvent, i si tenim una sola cadena aquests formaran ponts d’H amb molècules d’aigua. Si ajuntem les dos cadenes, les bases nitrogenades queden a l’interior i es trenquen els ponts d’H amb les molècules d’aigua (es perd l’ordre de les molècules d’aigua quan es forma la doble hèlix).
Una altra força que permet estabilitzar la doble hèlix són les forces d’apilament entre les bases nitrogenades (stacking). Cada stacking estabilitza l’estructura de la doble hèlix en 7 kcal/mol. L’stacking és quan un pla de les bases nitrogenades es situa sobre l’altre pla de l’altra base nitrogenada. Els anells són molt hidrofòbics (interacció d’anells hidrofòbics), per tant les bases queden amagades a l’interior de la doble hèlix, produint interaccions de Van der Waals, que tot i ser forces febles, aquí produeixen una força forta (entre els àtoms de carboni dels anells de les bases nitrogenades).
En la base nitrogenada, com els electrons estan deslocalitzats, es produirà un acumulació d’electrons a un costat, per exemple al costat dret, fent que hi hagi càrrega negativa al costat dret i per tant càrrega positiva a l’esquerra. Aquests electrons poden estar localitzats en un punt concret, creant un dipol en l’estructura. Si afegim l’altre base nitrogenada amb les càrregues al revés (negatiu a l’esquerra i positiu a la dreta), les dues bases s’atrauran, estabilitzant així tota l’estructura de la doble hèlix  formació de dipols.
El tercer element no és una força sinó que és una manera d’evitar la repulsió i es tracta de l’apantallament dels grups fosfat carregats negativament amb ions divalents (Mg 2+).
L’apantallament de les càrregues negatives, fa que no hi hagi repulsió dels grups fosfat carregats negativament i que hi hagi desestabilització en la cadena. Els fosfats es troben carregats negativament a la part de fora, així quan s’intenta formar la doble hèlix s’acosten dues molècules que es repelen i per evitar la repulsió dels grups fosfat de les cadenes aquets interaccionen amb ions divalents (ions de magnesi) que es troben carregats positivament “contraresten” les carregues negatives.
Gir del propulsor o del gir de l’hèlix i Base Flipping La forma de Watson i Crick, forma B-DNA, no és una estructura perfectament regular. Un dels motius que fa que no sigui perfectament regular és el gir del propulsor o del gir de l’hèlix, que és que hi ha un gir entre les dues bases nitrogenades, hi ha un gir entre el pla de les dues bases. El gir del propulsor no és constant, i provoca variacions en la fondària del solc gran, canviant una determinada seqüència del DNA per determinar una seqüència de proteïnes.
Hi ha un altre factor que fa que l’estructura no sigui perfectament regular.
Momentàniament es poden trencar els ponts d’hidrogen entre una base nitrogenada i la seva parella fent que la base surti cap a l’exterior tot i ser hidrofòbica. Energèticament, el cost no és massa elevat i això permet que aquesta base pugui ser modificada per la introducció de metilacions, tornant a l’interior i refent l’estructura que tenia anteriorment. Aquest fenomen s’anomena Base Flipping.
Diferents formes de la doble hèlix del DNA Majoritàriament el DNA adopta la forma de B-DNA, que és la postulada per Watson i Crick, però pot adoptar altres formes, que són el A-DNA i el Z-DNA. En totes elles l’ADN està format per dues cadenes helicoïdals, enrotllades una sobre l’altre i que són cadenes complementàries. La de A-DNA igual que la primera que va ser descrita (B-DNA) estan cargolades en sentit dextrogir, en canvi la forma Z-DNA està enrotllada en sentit levogir. El A-DNA es forma en condicions de menys humitat i és el DNA present a les espores.
El Z-DNA va intercalant bases nitrogenades d’un tipus i d’un altre o un nucleòtid d’un tipus i d’un altre (purina – pirimidina – purina – pirimidina). El nombre de parells de bases per volta d’hèlix és de 11 en el A-DNA, 10,5 en B-DNA i 12 en Z-DNA. Una altre característica és l’aspecte que presenta l’enllaç glicosídic. En el cas del A-DNA i el B-DNA l’enllaç glicosídic que presenten és anti tant per bases purines com pirimidines. En canvi en el Z-DNA l’enllaç glicosídic en les bases puríniques són sin i en les pirimidines l’enllaç és anti. La més xata és la A (diàmetre més gran, però més curta) i el que té un diàmetre més petit és el Z-DNA, que serà més llarga i estreta.
En el A-DNA la conformació de la ribosa és la C-3’-endo i en el B-DNA és de C-2’-endo. En canvi en el Z-DNA, en les bases puríniques la conformació de la ribosa és C-3’-endo i per les bases pirimidíniques C-2’-endo. La inclinació del pla de les bases respecte l’eix de l’hèlix és només d’1º grau en el B-DNA, però en els altres dos és més alt (19º en el A-DNA i 9º en el Z-DNA).
Aquest fet provoca que el solc gran i solc petit canviïn, canviant així també el reconeixement d’algunes proteïnes.
Estructures que poden adoptar les seqüències palindròmiques El DNA té diferents tipus de seqüències i segons aquestes seqüències es poden formar diferents tipus d’estructures. Es poden formar estructures que poden adoptar les seqüències palindròmiques, és a dir, que llegim en el sentit que ho llegim, tindrem el mateix. Si es desfà per un moment la doble hèlix, com són dues seqüències palindròmiques, es formarà un aparellament de bases, anomenat Hairpin. No s’ha de confondre amb repeticions directes (ATCGAT / ATCGAT) o repeticions especulars (ATCGAT / TAGCTA), ja que aquestes no podran formar aparellament de bases.
Triple H-DNA Les bases es poden aparellar amb altres bases a partir de ponts d’hidrogen, però a més a més es poden aparellar amb altres bases a partir de ponts d’hidrogen que no són els habituals. Això és el que s’anomena aparellaments de Hoogsteen. Permeten que determinades regions del DNA puguin formar hèlices triples o tríplex. Això es important perquè poden ser punts de reconeixement per a determinades proteïnes, o bé aquesta hèlix triple pot ser induïda per a tal de controlar l’expressió d’un gen.
Quàdruples A més a més també pot formar quàdruples. Els nucleòtids que poden formar quàdruples són les bases de guanina. Aquests quàdruples s’han vist en els extrems dels telòmers dels cromosomes. Els telòmers acaben en cadenes senzilles. Aquestes cadenes senzilles contenen molts nucleòtids de guanina.
Desnaturalització del DNA L’estructura del DNA es pot perdre, és a dir, les dues cadenes es poden separar. Aquesta separació s’anomena desnaturalització del DNA. Si apliquem calor, els ponts d’hidrogen entre les dues bases es trenquen, separant les cadenes. Aquest procés és reversible i les dues cadenes es poden tornar a ajuntar, recuperant l’estructura inicial. Aquest procés rep el nom d’hibridació (anellament o renaturalització). Quan el DNA es desnaturalitza canvien les propietats físiques (es torna menys viscós), i es produeix l’exposició a l’exterior de les bases nitrogenades. Les bases poden absorbir més llum en el UV, seguint així el procés de desnaturalització.
Si mesurem l’espectre del DNA abans de la desnaturalització, observarem un pic a 260 nm, i si ho calculem després de la desnaturalització observarem també un pic a 260 nm però l’absorbància haurà augmentat (fins un 40%). L’augment d’aquesta absorbància rep el nom d’efecte hipercròmic. Aquest fet permet dir que el ds DNA és hipocròmic en relació al ssDNA o bé que el ssDNA és hipercròmic en relació al dsDNA. Això permet calcular la concentració de DNA en una solució.
Si anem mesurant l’absorbància a 260 nm al llarg d’anar pujant la temperatura i ho representem, obtindrem una corba de fusió del DNA. El que m’indica la pujada dràstica, és que es desnaturalitza la doble hèlix i que és un procés cooperatiu, és a dir, a la que una proteïna es desnaturalitza, indueix a les altres proteïnes a desnaturalitzar-se. Quan més alta és la Tm, més estable serà el DNA i això serà perquè aquest DNA tindrà més ponts d’hidrogen, és a dir, més G+C, respecte T+A (entre d’altres coses).
A partir de la corba de fusió podem obtenir la temperatura de fusió (Tm) que és la temperatura mitja en la que el 50% dels aparellaments s’han desfet. La temperatura de fusió (melting point) depèn de: - Tipus de bases (tipus d’enllaços). Com més ponts d’hidrogen (G – C), més elevada serà la temperatura.
La llargada de la cadena, ja que com més llarga més estable és.
La presència de cations, ja que a un major apantallament, la temperatura de fusió és més elevada.
Del pH, ja que com més elevat sigui aquest, més desnaturalització hi haurà.
Hi ha una correlació entre la temperatura de fusió, Tm i el % de G + C per diferents DNAs.
El procés de renaturalització s’ha de fer refredant lentament, sinó no obtindrem la seqüència inicial. Si refredem de cop, es formaran mals aparellaments. S’ha de fer a una Tº d’hibridació que és -25º menys que la temperatura de fusió. Per què si refredo de cop no recupero l’estructura nativa? En el DNA hi haurà regions que tenen una seqüència de bases que s’aparellaran amb les seves complementàries. Però podria ser que tingués un tros de la cadena amb una regió força similar i es podria aparellar malament.
També podem desnaturalitzar les cadenes de DNA a partir d’un canvi de pH. Si posem la dissolució de DNA a pH àcid es pot produir una despurinització (trencament dels enllaços entre les purines) i pot ser difícil de recuperar l’estructura inicial. En canvi si posem la dissolució de DNA a pH bàsic, això no passarà.
B-DNA no és compatible amb una estructura de doble hèlix amb dues cadenes de 2 RNA o una de DNA i una RNA; A-DNA sí que es compatible amb la formació de dues cadenes de 2 RNA o una de ADN i una de RNA.
Topologia del DNA circular La doble hèlix del DNA necessita que es pugui desfer, ja que en processos com la replicació, transcripció i altres, necessitem que la doble hèlix s’obri durant un temps necessari, per un cert punt. L’estructura de DNA està tan cargolada que si s’obre per un punt, es recargola. És el mateix que ens passa si nosaltres agafem dues gomes i les cargolem una sobre l’altre, tensem i aguantem pels dos extrems i algú intenta separar aquestes gomes: es recargolen. En el DNA passa el mateix, estem creant una tensió en aquesta estructura.
Si no tinc els extrems lliures, això implica que aquest DNA s’ha de recargolar per compensar aquesta desestabilització que li estic posant. Això passa també al DNA lineal, on les proteïnes que tenen, no permeten que a l’obrir les dues cadenes allò pugui eliminar la tensió descargolant els extrems. El DNA respon intentat resoldre aquest desequilibri, retorçant-se sobre si mateix.
Si ens centrem en un DNA circular tancat covalentment, aquestes molècules de DNA venen caracteritzades per un número d’enllaç (L), que simplement és el nombre de vegades que una cadena creua l’altra en sentit dextrogir. És una propietat invariable, a menys que es trenquin les cadenes. Depèn de 2 paràmetres: - Número de gir (T), és el nombre de voltes d’hèlix de Watson i Crick. Si la molècula està relaxada (no he desfet cap tros de la doble hèlix), el valor de L es fa igual a T, sempre i quan aquesta molècula tingui un nombre de parells de bases que permeti un nombre de voltes d’hèlix de Watson i Crick.
- Número de superenrotllament (W), nombre de vegades que una cadena s’enrotlla en sentit dextrogir sobre l’altra.
Suposem que tenim una molècula de DNA de 120 parells de base. Suposem que és de tipus B-DNA (cada volta d’hèlix conté 10 pb), per tant el valor de T serà el nombre de voltes d’hèlix, que equivaldrà al (nº total pb) / 10 (nº pb / volta) = T = 12 = L. Si desfem una volta d’hèlix estem canviant el valor de L i passem a tenir una L = 11, T = 11 i W = 0, però en aquest cas, la molècula no és estable i s’enrotlla sobre si mateixa fent que la T torni al seu valor inicial, T =12 i W = -1. Això pot girar tant en sentit dextrogir com levogir, gir en sentit negatiu.
Suposem que abans de tancar o unir els extrems 3’ i 5’ de cadascuna de les cadenes hem desfet una volta d’hèlix de Watson i Crick.
És a dir: L = T = 11 (molècula relaxada) però seguim tenint 120 pb, per tant si jo ara calculo el nº de pb per volta d’hèlix = nº total de pb / nº de voltes d’hèlix de Watson i Crick = 120 / 11 = 10,91. Per tant tindríem els mateixos 120 pb, però ara tindrem 11 voltes d’hèlix i per tant tindrem que per cada volta d’hèlix hi haurà 10,91 pb.
Perquè l’estabilitat de la molècula no es vegi afectada, cal mantenir els 10 pb / volta d’hèlix de Watson i Crick, i el DNA relaxat es pot retorçar sobre sí mateix per recuperar l’estructura amb els 10 pb / volta. Aquest fenomen és el que s’anomena superenrotllament.
Aquesta torsió de la molècula sobre si mateixa es representa pel paràmetre W = número de superenrotllament (writhing number), que és el número de vegades que una cadena s’enrotlla en sentit dextrogir sobre l’altra.
En el nostre exemple ens interessa mantenir 10 pb/ volta d’hèlix de W-C es a dir T =12. Si tenim que L =11, perquè T =12, s’ha de complir que W = -1, ja que la relació entre els paràmetres és: L = T + W (11 = 12 – 1). El fet de W = -1 implica la introducció d’un superenrotllament negatiu.
Si en el nostre exemple enlloc de desfer una volta d’hèlix en formem una de nova, tindríem que L = 13. Si T s‘ha de mantenir a 12, W ha de ser igual a + 1. Per tant L = T + W  13 = 12 + 1 i això suposa introduir un superenrotllament positiu.
cccDNA = covalent closed circular DNA. En aquest cas la molècula té 360 pb, per tant T = 36.
Si la molècula la tenim relaxada T = L = 36. Si jo desfaig 4 voltes d’hèlix L baixa a 32, T = 36 i W = -4.
Topoisòmers Les formes que tenen diferent número d’enllaç s’anomenen topoisòmers, és a dir, són aquelles estructures que varien en el nombre de L (en el nombre d’enllaç). Els confòrmers, són aquelles formes que tenen el mateix topoisòmers són formes que tenen el mateix número d’enllaç.
Per definició, un DNA que té una de les dues cadenes tallades, no en podem conèixer quin és el nombre de L (que sempre té un valor sencer), no podem saber el nombre d’enllaços que té i per tant diem que té un número d’enllaç indefinit. La tensió obtinguda per la separació la podem perdre perquè tenim una cadena tallada, però no podem saber quantes vegades es desfà i quantes vegades creua la cadena en sentit dextrogir.
Com hem dit L sempre és un numero sencer, però T i W poden ser nombres fraccionaris (pot ser que tinguem mitja volta de W-C). En el B-DNA i A-DNA el valor de T és positiu, ja que giren en sentit dextrogir, per tant en el Z-DNA, T és negatiu, ja que gira en sentit levogir.
El fet d’enrotllar negativament i mantenir aquest superenrotllament negatiu, emmagatzema energia d’obertura de la doble hèlix, que servirà per desfer la doble hèlix quan faci falta.
Tenim dues maneres d’introduir superenrotllament:  Plectotènic: En el DNA plectotènic, el DNA tendeix a adoptar una forma estesa i estreta, en comptes de compactar-se. Sol presentar ramificacions múltiples. Els dos extrems del DNA giren en sentit contrari i aleshores el DNA es cargola sobre ell mateix.
Aquest sistema és típic de procariotes.
 Solenoïdal: És el que normalment trobarem a l’estructura dels cromosomes eucariotes. Fan que la molècula estigui superenrotllada negativament per tal d’emmagatzemar energia per desfer la doble hèlix quan faci falta.
Per comparar el grau de superenrotllament amb DNA de diferent llargada, s’utilitza un paràmetre anomenat diferència d’enllaç específica ( λ) o densitat de superhèlix (σ), que és 𝐿− 𝐿0 𝐿0 , on L és el número d’enllaç real i L0 és el número d’enllaç del cercle relaxat (és a dir nº pb total / 10, per tant és T).
Aquest grau de superenrotllament es pot moure entre dos valors. Teòricament només es pot moure pels valors (λ) ± 0.09, però a la pràctica es mou entre els valors de -0.03 a -0.09. De forma normal, a les cèl·lules es troba superenrotllat negativament.
Per passar d’un topoisòmer a un altre, només ho podem fer creant un tall en la cadena del ADN. A dins les cèl·lules ho duen a terme uns enzims que s’anomenen topoisomerases, que alteren el nombre d’enllaç i catalitzen una reacció química en 3 etapes: - Provoquen el tall d’una o de les dues cadenes del DNA Un cop s’ha produït el tall, fan passar la doble hèlix a través d’aquest tall Tornen a tancar el tall pel mateix punt Hi ha 2 tipus principals de topoisomerases: - - Tipus 1: El tipus més abundant. Eliminen superenrotllaments negatius, a menys que es tractés d’un organisme termòfil. Relaxen el DNA, tallen una sola cadena de la doble hèlix.
Tipus II: (DNA-girasa, la més coneguda és la de E. coli), talla les dues cadenes de la doble hèlix. Introdueix superenrotllaments negatius.
L’activitat d’aquests dos tipus de topoisomerases fan que el DNA tingui el grau de superenrotllament idoni perquè aquest pugui separar les dues cadenes quan sigui necessari.
Funcionament de la topoisomerasa tipus I Les topoisomerases de tipus I són enzims que tenen al centre actiu un residu de tirosina. En el dibuix la P és l’enllaç fosfodièster que la topoisomerasa tallarà.
L’extrem 5’ queda unit al centre actiu de l’enzim i l’extrem 3’ queda lliure. Es produeix el tall en una sola cadena i per aquest tall fem passar l’altre cadena, així canviem el valor de L. Un cop ha passat la cadena per aquest tall, la topoisomerasa torna a tancar per aquest tall.
El nombre d’enllaç varia amb una unitat (L varia amb una unitat) per cada cicle catalític. No es necessita un aportació d’energia (no cost energètic). Per tant relaxar un DNA que està superenrotllat no suposo una despesa energètica.
Funcionament de la topoisomerasa tipus II Les de tipus 2 no relaxen DNA, sinó que a partir d’un DNA amb superenrotllament positiu, introdueixen superenrotllaments negatius, i per tant requereixen energia. La DNA girasa està formada per dos tipus de subunitats que estan duplicades. La topoisomerasa queda embolcallada pel DNA i talla les dues cadenes (extrems 3’ i 5’ lliures en el tall), l’extrem 5’ queda unit al centre actiu de la DNA girasa i l’extrem 3’ queda lliure.
Un cop la topoisomerasa ha fet el tall, pel tall hi passa la doble hèlix i després tanca el tall pels enllaços fosfodièster que havia tallat. El resultat de tot, quan s’allibera l’enzim, és que hem passat d’un DNA amb superenrotllament positiu a un superenrotllament negatiu. Variem el nombre d’enllaç amb 2 unitats (passem pel relaxat i després a superenrotllament negatiu, de + 1 a -1). En aquest cas sí que es necessita energia (ATP) i es pot aconseguir adoptant estructures que tenen nivells d’energia superior, o bé a partir de la hidròlisi i consum d’ATP.
Gairebé sempre es donen els superenrotllament negatius, ja que com hem dit anteriorment, el fet de tenir un superenrotllament negatiu fa que s’emmagatzemi ATP per quan es vulgui separar les dues cadenes.
Anàlisi electroforètica de DNA relaxat i superenrotllat La molècula de DNA relaxada o superenrotllada es poden separar amb un gel d’agarosa (electroforesi). La molècula superenrotllada és molt més compacta i petita i per tant, avançarà de manera molt més ràpida en el gel d’agarosa. En canvi la molècula relaxada és més ample i li costa més d’avançar (avançarà menys). Si el ADN circular el passem a DNA lineal veurem que la forma lineal es troba entre mig de la relaxada i la superenrotllada.
Representació esquemàtica de l’estructura d’un nucleosoma El DNA procariota és circular i de doble cadena, no té extrem 5’ i 3’ lliure, pot estar enganxat a la membrana de la cèl·lula, pels punts que es diuen mesosomes. També trobem altres molècules de DNA, diferents al DNA principal, que també són de doble cadena i circulars, i reben el nom de plasmidis. Aquestes molècules de DNA (plasmidis) són de mida més petita que el cromosoma bacterià i porten gens de resistència contra antibiòtics. Els eucariotes en canvi, tenen un DNA lineal que està unit amb un conjunt d’ enzims formant l’estructura de la cromatina.
El superenrotllament es dóna no només per emmagatzemar energia, sinó per la compactació del DNA en el cas dels procariotes, perquè hi pugui cabre a les cèl·lules. En els eucariotes la compactació del DNA també es dóna, però el superenrotllament es dóna gràcies a un conjunt de proteïnes que es diuen histones.
Tipus: o o o o o H1 (1 sol tipus) H2A (2 tipus) H2B (2 tipus) H3 (2 tipus) H4 (2 tipus) Les 4 últimes formen l’octàmer d’histones que queda embolcallat per 146 parells de bases.
Aquest embolcallament és el que es coneix amb el nom de nucleosoma, que és el primer nivell de compactació del DNA.
Les histones són proteïnes bàsiques i tenen unes cues, extrems N terminals que marquen el pas de rosca que farà que el DNA s’embolcalli al voltant de l’octàmer d’histones formant el nucleosoma. Els nucleosomes estan units uns amb altres amb el DNA de connexió (linker), que pot tenir diferents longituds. El tipus d’histona restant, que no forma part de l’octàmer d’histones (Histona H1, color groc), estarà per fora de l’octàmer d’histones i estarà unit al DNA.
...

Comprar Previsualizar