Tema 6 - Anàlisi productes PCR (I) - Variació en la grandària del producte de PCR (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 13
Fecha de subida 12/04/2016
Descargas 20
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Tema 6 – Anàlisi dels productes PCR ANÀLISI DELS PRODUCTES DE LA PCR En la PCR aconseguim generar milions de còpies d’una seqüencia. Com s’analitza el producte de la PCR? Podem analitzar els productes d’una PCR de diverses maneres:      Electroforesi en gel d’agarosa convencional. Quan tenim un producte amplificat, quan volem determinar la grandària, quan hi ha inespecificitats.
Electroforesi en gel de poliacrilamida. És més precisa per determinar la grandària.
Electroforesi capil·lar. Més precisa que la d’agarosa per determinar la grandària.
Blotting. Si no ens interessa determinar la grandària.
Altres. Cromatografies, espectrometries...
ELECTROFORESI EN GEL D’AGAROSA CONVENCIONAL En l’electroforesi en gel d’agarosa convencional es determina la presència d’una seqüència específica en la mostra analitzada.
Per poder detectar-ho necessitem un control, de manera que puguem diferenciar si no s’ha amplificat perquè no s’ha dut a terme bé la PCR o perquè la seqüència no està present.
Ens permet la determinació de: - Sexe: es detecta, per exemple, una seqüencia específica del cromosoma Y (que determina el sexe masculí).
Infeccions / paràsits: per exemple, el virus de l’hepatitis C, un virus de RNA. En aquest cas es faria una RT-PCR i observaríem l’amplificació d’una seqüència de 450bp del 5 ́UTR d’un gen propi del VHC.
139 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Multiplex PCR Les Multiplex PCR ens permeten detectar vàries seqüències a la vegada, però requereixen d’un disseny molt precís. Hem de: - Dissenyar molts encebadors i evitar que hibridin entre ells.
La llargada de l’amplicó obtingut de cada seqüencia analitzada (per exemple, cadascuna d’un organisme) ha de ser diferent, per així poder diferenciar els productes per grandària i associar-los a un organisme diferent.
En veterinària, hi ha patògens intestinals de diferents espècies (nematodes). Es dissenya una amplificació específica d’un gen de cada una de les espècies de nematodes, tot triant un amplicó de diferent grandària per cada espècie per distingir si està present una o altra en funció de la grandària de l’amplicó. En la imatge tenim 5 espècies de nematodes que es troben en espècies domèstiques d’animals. Com veiem hi ha combinacions; en el carril 16 hi hauria la presència de 3 dels 5 nematodes, per exemple.
També podem detectar reordenacions cromosòmiques.
L’oncogen ret es troba mutat en diferents tumors del sistema endocrí. Pot patir inversions, reordenacions, translocacions... que el que fan és generar gens quimèrics que donen lloc a la malaltia. Únicament s’han descrit reordenacions cromosòmiques que afecten a ret en els tumors del càncer de tiroides papil·lar (PTC).
140 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Totes les reordenacions tenen lloc al domini quinasa.
La reordenació més freqüent és una inversió del cromosoma 10 que genera un gen quimèric, l’H4, d’expressió constitutiva. Aquesta reordenació RET/PTC1 que dóna lloc al H4 es troba en un 40-50% dels tumors analitzats.
La inversió fusiona la regió reguladora d’H4 amb l’estructural de ret. La conclusió és que ret s’expressa de manera constitutiva.
En aquesta reordenació sempre trobem que el punt de trencament està en el primer intró del H4 i l’intró 11 de ret. El primer exó de H4 es fusiona amb l’exó 12 del ret.
141 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 S’ha estudiat el punt de trencament i és variable però sempre dins d’aquests dos introns en els dos gens.
Hem de dissenyar un encebador en l’exó 1 del H4 i un en l’exó 12 del ret de manera que, si hi ha gen quimèric, doncs amplificarà aquesta seqüència 1-12 que es troba fusionada.
Quant a l’orientació de ret i H4, veiem que estan oposats en el gen fusionat. Per tant si no hi ha inversió quedaran molt lluny i no amplificaran res, i a més estaran en la mateixa orientació.
En canvi si estan fusionats sí que amplificaran, perquè les fletxetes estan canviades.
Però ens trobem amb un problema: l’intró 1 de H4 és molt gran. Té varies kb de grandària. En la majoria de casos, no podem amplificar sobre el DNA gnòmic perquè els dos encebadors estan massa lluny igualment, encara que estiguin fusionats.
142 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Per tant no podem amplificar per PCR convencional una seqüència de DNA definida per un encebador de l’exó 1 de H4 i un encebador de l’exó 12 de ret usant el DNA genòmic de les cèl·lules tumorals com a motlle, ja que els exons 1 i 12 també queden massa separats en el quimèric.
Però sí que podem amplificar sobre el cDNA, perquè en aquest, s’elimina l’intró quimèric, i només queden els dos encebadors amplificant una seqüència de 204 pb. Per tant estaríem fent una RT-PCR sobre el cDNA del missatger quimèric.
Hem de tenir en compte que: - En cap cas s’ha de dissenyar un encebador dins d’un intró, perquè el cDNA no tindrà aquesta seqüència, s’escindeix.
Si dissenyem dos encebadors sobre el mateix exó, no distingirem el DNA del RNA.
Normalment el que es fa és dissenyar un encebador amb exons diferents, ja que podrem distingir si l’amplificació prové de cDNA o de DNA contaminat. Si el fragment amplificat és petit serà cDNA, si és gran (amb l’intró pel mig) serà DNA.
Detecció en gel d’agarosa Quan s’analitza el producte en gel d’agarosa, s’acostumen a utilitzar colorants amb afinitat pel DNA que emetin fluorescència. En el càncer de tiroides, per exemple, es fa un seguiment del tumor amb pastilletes radioactives. Entre els més usats trobem: - Bromur d’etidi, que és un conegut carcinogen i agent intercalant del DNA. El seu límit de detecció va de 1-5 ng de dsDNA (és molt sensible).
143 Diagnòstic Genètic Molecular - Parcial 1 SYBR Green I. És menys mutagènic que el bromur d’etidi. Pot detectar fisn a 20pg de ds DNA.
Hi ha diferents formes d’unir-se al DNA, i cada substància ho fa d’una manera. Com hem dit, el bromur d’etidi (EtBr) és un agent intercalant.
BLOTTING – Transferència membrana + hibridació amb sonda específica També podem analitzar els productes de la PCR transferint-los directament a una membrana on hibridin amb una sonda específica. Fent-ho així augmenta la sensibilitat.
De fet, mitjançant radioactivitat podem arribar a detectar fins a 10 ng.
Quan no hi ha necessitat de separar els productes electroforèticament, es pot transferir el material desnaturalitzat directament al filtre per la posterior anàlisi per hibridació.
En la fotografia tenim un gen en el que intentaven amplificar unes seqüències. En algun carril pots detectar alguna cosa quan uses bromur d’etidi, però si el transfereixes a un filtre i el transfereixes amb una sonda específica, ho detectes sense cap problema.
144 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Aquest tipus d’anàlisi és ideal quan tenim múltiples mostres. En la imatge, tenim l’expressió del gen GATA-6 en teixit adrenal neoplàsic humà avaluat a través d’una RT-PCR i una posterior hibridació amb Dot – blot.
El blotting ens permet treballar amb poca mostra, amb molta més sensibilitat i en múltiples mostres: cada gota correspon a una mostra analitzada. El sistema de transferència conté el filtre i uns pouets es posa cada mostra.
Dot blot i Slot blot - Si utilitzem plaques que tenen múltiples pouets, parlem de Dot blot (esquerra).
Si utilitzem plaques que tenen ranures allargades, parlem de Slot blot (dreta).
145 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 VARIACIÓ EN LA GRANDÀRIA DEL PRODUCTE DE PCR ELECTROFORESI EN GEL DE POLIACRILAMIDA Amplificació de microsatèl·lits Per detectar presència o absència d’una seqüència sense importarne la grandària, el millor és un Dot blot. Ara bé, si t’interessa detectar variacions en la grandària de l’amplicó en el gel d’agarosa, només les detectarem si són variacions grans. Si treballem amb microsatèl·lits, la variació pot ser d’1 o 2 nucleòtids, i en un gel d’agarosa això és impossible de veure-ho.
Per tant per l’anàlisi de microsatèl·lits, el que fem és amplificar per PCR. També es poden dur a terme Southerns, on digerim el DNA a partir de dianes de restricció. El que variarà serà la llargada del fragment de restricció.
En la PCR, en funció de les repeticions del microsatèl·lit tindrem un producte final més o menys gran. La llargada del fragment de restricció no varia, sinó que varia la llargada del fragment amplificat. En aquests casos, s’utilitzen gels de poliacrilamida o seqüenciació. El gel és molt resolutiu; fins i tot podem detectar diferències d’un sol nucleòtid.
146 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Però el fet que sigui tant sensible també farà que ens apareguin múltiples bandes degudes al tartamudeig. Aquest fenomen es dóna quan s’amplifiquen seqüències repetitives, ja que la polimerasa té més probabilitat d’error.
La PCR, quan amplifica el microsatèl·lit, comet petits errors degut a les repeticions. Això dóna un conjunt de fragments de petita variació. Aquestes bandes es coneixen com tartamudeig. El patró és repetitiu.
Així doncs, en gels de poliacrilamida o de seqüenciació observem la presència de més d’una banda, cosa que no observem en gels d’agarosa.
ELECTROFORESI CAPIL·LAR Característiques: - Elevada resolució (a nivell de nucleòtid).
Petits volums de mostra (1 – 10 nL).
Separació ràpida (1 a 45 min).
Automatització.
Quantificació.
Reproductibilitat.
En l’electroforesi capil·lar tenim un buffer en el qual hem posat la mostra que analitzem i el desplaçament va en funció de les càrregues. Quan més gran és la molècula, més càrregues té i més ràpid es desplaça.
Utilitzem encebadors marcats amb fluorocrom ja que tenim un detector de fluorescència, el qual detecta el pas de pics de fluorescència per unitat de temps. Enlloc de bandes, detectem pics; quan el producte passa pel detector apareix un pic en funció de la intensitat de fluorescència. El que es mesura és l’alçada del pic.
147 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En aquests casos també apareix el tartamudeig (pics tartamuts), els quals són secundaris.
Costa diferenciar una repetició d’un tartamudeig si el número de còpies és baix.
Malaltia de Huntington (expansió d’un microsatèl·lit) Si l’extensió del microsatèl·lit és molt gran, és molt difícil de detectar-lo per PCR, i l’absència d’amplificació ens pot donar un resultat erroni. Si el resultat ens diu que un individu és homozigot per l’al·lel normal, complementem amb un Southern per comprovar que el resultat és fiable i no hi ha hagut un problema d’extensió (pot donar-se que aparegui una banda i no puguis diferenciar si és homozigot o és heterozigot però l’altra banda s’ha expandit molt).
Normalment, en fer una PCR múltiple on amplifiquen diferents amplicons de microsatèl·lit, els pics que corresponen als microsatèl·lits més grans són els pics més baixos, perquè costa més amplificar-los (ja que són els més grans). Es poden introduir encebadors interns que detectin fragments més petits. Això fa que apareguin pics mes petits. L’eficàcia amb que s’amplifica depèn de la grandària; els petits s’amplifiquen de manera més eficaç.
En el cas de la malaltia de Huntington: ens fixem en el pic de les 21 repeticions. Usant pics més petits, veus que tens un fragment més gran, però tu l’has aconseguit amplificant fragments interns entre un extrem i l’altre. Si a partir del 21 observes més pics vol dir que hi ha un al·lel més gran més enllà Això és un sistema que usa la PCR com a eina de diagnòstic, però sense determinar-ne la grandària. Per exemple, saps que un individu no és homozigot per les 21 repeticions però no en saps la grandària, per tant acabes fent un Southern. La conclusió és que treballant amb microsatèl·lits acabes fent un Southern tot i que les PCR siguin més ràpides.
148 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Els encebadors per amplificar regions repetitives (microsatèl·lits) són encebadors on l’extrem 3’ reconeix les seqüències dels microsatèl·lits. Aquests, com poden caure en qualsevol punt, ens donaran un conjunt de seqüències amplificades i llavors ens apareixeran diferents pics.
Utilitzant aquests encebadors, en el cas del pic de les 21 repeticions, havíem diagnosticat que l’individu era homozigot, però darrere d’aquest pic, com hem dit, es veien més pics, per tant es dedueix que més endavant hi ha un al·lel més gran, cosa que podria indicar que no és homozigot. Per això s’ha de complementar amb un Southern blot.
149 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 LOH – Pèrdua d’heterozigosi Igual que amb el Southern, per PCR també podem detectar pèrdua d’heterozigositat. De fet és millor analitzar-la per PCR.
Els productes es podran analitzar per electroforesi convencional (agarosa o acrilamida) o per electroforesi capil·lar (avaluarem pics enlloc de bandes; amb 2 pics no hi ha pèrdua d’heterozigosi, però si en veiem només 1, sí). Ara bé, ens tornem a trobar amb el problema de les bandes contaminades que fan que apareguin dues bandes. En la imatge següent tenim senyalades les bandes no específiques.
També podem fer córrer el teixit tumoral i normal i els superposem. Els encebadors que usem per amplificar el microsatèl·lit del teixit normal els marquem amb un fluorocrom i els del teixit tumoral amb un altre.
150 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Si el que caracteritza el tumor és la inestabilitat genòmica (que afecta a la mida dels microsatèl·lits) observarem que en la mostra tumoral (T), el pic no desapareix (no hi ha LOH) sinó que varia el número de repeticions, de manera que el pic canvia de posició.
Sigui com sigui, és fàcil detectar tant si hi ha inestabilitat genòmica (canvi de posició del pic) de microsatèl·lits o bé LOH (pèrdua d’un pic).
Com hem dit, hi ha variants de la PCR que ens permeten analitzar dues mostres de DNA (una de teixit normal i una de teixit tumoral) i analitzar un gen amb encebadors verds per la mostra normal vermells per la mostra tumoral.
Els productes s’analitzaran per electroforesi capil·lar. Si els pics (verds i vermells) coincideixen entre les dues mostres, es que no hi ha inestabilitat genòmica (esquerra) però si n’hi ha, ens apareixen múltiples pics nous en vermell (dreta).
151 ...