Determinació de la activitat enzimatica en detergents (2017)

Pràctica Español
Universidad Universidad Rovira y Virgili (URV)
Grado Bioquímica y Biología Molecular - 2º curso
Asignatura metodología
Año del apunte 2017
Páginas 13
Fecha de subida 02/10/2017
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¿Cuál de los dos detergentes es más efectivo? ¿A qué temperatura óptima actúan las proteasas? ¿Cómo se comportan las serín-proteasas en presencia de inhibidor? Realizado por el grupo A6: Angelina Bachevskaya Marta Caballero Cavallè Diego Antón Viana Tutor: Raúl Beltrán Facultad de Química URV 2017 Índice 1. Resumen ............................................................. 2 2. Objetivos ............................................................. 3 3. Materiales y Métodos ......................................... 3 3.1. Caracterización cualitativa .............................. 3 3.1.1. Preparación de los geles ....................... 3-4 3.1.2 Preparación de las muestras ................. 4-5 3.1.3. Electroforesis ........................................ 5-6 3.1.4 Tinción con azul de Coomassie ................ 6 3.2 Caracterización cuantitativa ............................. 6 3.2.1 Actividad proteasa a diferente Tº .............. 6-7 3.2.2 Actividad proteasa con o sin inhibidor .......... 7 4. Resultados .......................................................... 7 4.1. Resultados método cualitativo ........................ 7 4.2. Resultados método cuantitativo ................. 8-10 5. Conclusión ........................................................ 11 6. Anexo................................................................. 12 6. Bibliografía ........................................................ 12 1 Resumen  Introducción Las proteasas o peptidasas son enzimas que aceleran la degradación de proteínas rompiendo los enlaces peptídicos. Los fabricantes de detergentes las agregan para remover manchas derivadas de proteínas como huevo, sangre, etc. Pero aparte del uso en detergentes, estas enzimas están implicadas en reacciones que van desde una simple digestión de los alimentos hasta cascadas altamente reguladas [1].
 Objetivos Se calificó la actividad proteasa de dos detergentes para ropa mediante una caracterización cualitativa a partir de la degradación de albúmina en un gel de acrilamida y otra caracterización cuantitativa de la actividad proteasa de los detergentes. Además se determinó la temperatura óptima de los detergentes y estudió el comportamiento de las proteasas al añadir un inhibidor.
 Materiales y métodos Para la realización de este experimento se utilizaron dos detergentes de marcas diferentes, denominados A (detergente común) y B (detergente para prendas delicadas) con el fin de que contuvieran proteasas inespecíficas para reaccionar con alta cantidad de proteínas. Para la caracterización cualitativa se necesitaron geles de poliacrilamida y los reactivos correspondientes para realizar la electroforesis. Sin embargo para la caracterización cuantitativa se utilizó un espectrofotómetro y baños a temperaturas correspondientes.
 Resultados y discusión Como resultado de la electroforesis se pretendía obtener varias bandas pero por errores técnicos se obtuvieron bandas similares tanto en el detergente A como en el B. Como resultado de la parte cuantitativa se obtuvieron varias gráficas a partir de las cuales se determinó el detergente con la actividad proteasa y su comportamiento a temperatura óptima y a distintas concentraciones de inhibidor.
 Conclusión Se pudo concluir que el detergente con más actividad proteasa es el A, cuya temperatura óptima es 40ºC, además se vio que a altas concentraciones de inhibidor el detergente disminuye su actividad.
2 Objetivos Caracterizar la actividad proteasa de dos detergentes comerciales de ropa; un detergente estándar el cual llamaremos A y otro para ropa delicada B, mediante dos caracterizaciones: - Cualitativa: a partir de la visualización de degradación de albúmina en un gel de poliacrilamida y en condiciones desnaturalizantes - Cuantitativa: caracterización de la actividad proteasa en detergentes Determinar la Tª óptima de trabajo de ambos detergentes y estudiar el comportamiento de las proteasas al añadir un inhibidor de proteasas Materiales y Métodos Caracterización cualitativa de la actividad proteasa Preparación de los geles: Los geles de poliacrilamida constituyen un buen medio de soporte para separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de compuestos químicos [3].
La poliacrilamida se forma por polimerización de dos compuestos, la acrilamida y la bis-acrilamida (N, N’-metilén-bis-acrilamida), en una reacción iniciada por la tetrametiletiléndiamina (TEMED) y el persulfato de amonio (APS). El radical persulfato activa al TEMED, el cual a su vez activa la acrilamida para que polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la bisacrilamida, formándose así una red de porosidad uniforme, que puede ser regulada variando las condiciones de la reacción y las concentraciones.
Para la preparación de los geles se utilizaron los siguientes reactivos principales: - Separador al 12 % de acrilamida1 usando acrilamida al 30%, SDS al 10%, el iniciador de reacción APS y el TEMED que es el catalizador.
3 - Concentrador al 4% de acrilamida con las mismas concentraciones.
Se estudió la actividad de las proteasas a diferente Ta en los detergentes A y B con la técnica de electroforesis para averiguar cuál de los dos es más eficiente.
Es importante tener en cuenta que el APS y el TEMED2, se depositaron justo antes de montar los geles en el sistema para que la reacción no se produzca antes del tiempo necesario.
El sistema se montó para que el cristal más pequeño quedara hacia fuera, lo cual favoreció la deposición de los geles. Se marcó el vidrio a aproximadamente 2 cm de la parte superior para visualizar el límite de depósito y también se marcaron los pozos del peine (el cual se quitó en el momento de depositar los geles).
Se ha de tener en cuenta que no puede haber escapes en el sistema, por lo que previamente se echa agua para visualizar si hay fugas o no. Hecho esto, se depositó cuidadosamente el gel separador hasta la marca y después se cubrió con agua para evitar el contacto con O2 y facilitar la polimerización.
Una vez polimerizado el gel, se eliminó el agua con papel de filtro y se depositó el gel concentrador hasta llenar los vidrios. Se colocó el peine y se dejó polimerizar.
Para la correcta conservación de los geles, antes de su uso se deben guardar en la nevera.
Preparación de la solución desteñidora: Se preparó 0,5 L de la solución que contenía 10% de ácido acético y 10% de metanol. Se ajustó el pH de la solución a 8,8.
Preparación de las muestras: Para cada detergente se prepararon las muestras por triplicado debido a su estudio a diferentes temperaturas. Por tanto se obtuvieron 3 tubos control, 6 tubos con el detergente A y otros 6 con el B conteniendo todos ellos 2mg/mL de BSA (Albúmina de Serum Bovino) cuya función fue ser degradada por el detergente. Además en cada 3 tubos de cada detergente se depositaron 5µL de PMSF 0,1M3.
4 Una vez preparadas las muestras, se incubaron a diferente Tª (4ºC en hielo, baños de 40ºC y 60ºC). Una vez pasado el tiempo se añadieron 10µL de tampón de carga a cada eppendorf. Se dejaron los tubos durante 5 minutos en un baño a 100ºC 6.
Después de dejar los tubos en hielo durante 5’ se centrifugaron para tener todo el contenido del tubo al fondo y se procedió a cargar las muestras en los geles.
Electroforesis: Mediante la electroforesis es posible separar moléculas biológicas según su tamaño bajo la influencia de un campo eléctrico. Se dio una visión general de la electroforesis en geles de poliacrilamida para proteínas en condiciones desnaturalizadas, que sirvió para posteriormente visualizar la actividad proteasa [3].
Para realizar la electroforesis, previamente se tuvo que montar el sistema de manera que los geles polimerizados quedaran dentro de la cubeta de electroforesis (Fig.
1). Se depositó el tampón 1x (diluido a partir del 10x con agua oxigenada) en el pozo con los geles, después de lo cual se depositó el tampón en el resto del sistema4.
Figura 1: Esquema del montaje de los geles en la cubeta de electroforesis Se cargaron 4 µL de marcador de peso molecular en el primer pozo de cada gel, y en el resto 20µL de cada muestra, con cuidado de no tocar el pozo para no romperlo (Fig. 2)5.
MPM C M 0ºC I C M I C 40ºC M I 60ºC Figura 2: Esquema de deposición de las muestras en el gel de electroforesis Una vez montado el sistema, se tapó la cubeta de electroforesis y se colocaron los cables, (rojo con el rojo y negro con el negro) (Fig. 3). Después de conectar la corriente, se observó la liberación de burbujas, que fue debido a la hidrólisis del agua.
5 Se esperó 90’ y posteriormente se depositaron los geles en la nevera con agua destilada para favorecer su separación del cristal.
Tinción con Azul de Coomassie: El Coomassie Brilliant Blue es un pigmento que se Figura 3: Cubeta de electroforesis conectada a la corriente une de forma no covalente a los residuos de lisina de las proteínas. La atracción iónica es a través de las fuerzas de Van Der Walls, que une a las proteínas y al colorante formando un complejo. Esta unión es totalmente reversible en condiciones apropiadas [3].
Se cubrieron los geles en un depósito con la solución y se dejaron en agitación suave durante mínimo de 30’. Una vez finalizada la tinción se eliminó la solución de azul de Coomassie y se cubrieron los geles con solución desteñidora, dejándola en agitación suave. Se hicieron varios lavados para eliminar todo el exceso de azul.
De esa manera se quedaron teñidas las bandas de las proteínas y el gel quedó transparente. Finalmente se eliminó la solución desteñidora y se cambió por agua destilada para su correcta conservación.
Caracterización cuantitativa de la actividad enzimática de proteasas Se determinó cuantitativamente la actividad proteasa mediante el método PNA, que se basa en la degradación de substrato y la aparición de producto colorimétrico.
En nuestro caso el substrato ha sido el Suc-AAPF-PNA y el producto colorimétrico la p-nitroanilida a partir de la cual se determinó la actividad enzimática de los detergentes estudiados.
Actividad proteasa en función de la temperatura Se cuantificó la actividad proteasa en los detergentes A y B a 4ºC, 40ºC y 60ºC.
Para ello se trabajó con ambos detergentes diluidos en fracción 1/10 para facilitar la recogida de valores de las absorbancias posteriormente.
Una vez preparados los eppendorf, se colocaron tres de cada detergente en hielo (4ºC), otros tres junto al blanco en un baño a 40ºC y los últimos tres en un baño a 60ºC.
6 Pasados 5 minutos, se añadieron 10 µL del sustrato Suc-AAPF-PNA 0,02M en DMSO a cada eppendorf.
Después de 6 minutos se detuvo la reacción añadiendo 10 µL de PMSF 0,1M y midió la absorbancia a 410nm.
Efecto del inhibidor PMSF en las proteasas del detergente Para cuantificar la actividad de las proteasas en función de la inhibición de las proteasas solo se trabajó a la temperatura y con el detergente óptimo, que se ha determinado en función de la temperatura.
En primer lugar se determinó el 100% de la actividad proteasa.
Una vez preparadas las muestras con el detergente 1/10, se colocaron junto al blanco al baño de 40ºC. Tras 5’ se añadieron 10 µL de Suc-AAPF-PNA a cada muestra y a los 6’ se detuvo la reacción con 10 µL de PMSF 0,1M y se midió la absorbancia a 410nm.
En segundo lugar se determinó el % de inhibición del PMSF a dos concentraciones.
Para el estudio del efecto del inhibidor de PMSF se prepararon dos tipos de muestras distintos, uno de baja concentración PMSF (0,1M) y otra de alta concentración de PMSF (1mM). Una vez hecho esto se siguió el procedimiento anterior excluyendo la adición de inhibidor al pasar 6 minutos.
Resultados Método cualitativo Como resultado de la electroforesis se observaron varias bandas en A los geles de poliacrilamida. En el caso de nuestro experimento hubo un error durante el procedimiento, ya que se suponía observar una degradación en el detergente A de las muestras sin inhibidor a 40ºC, en las muestras a Tª 0ºC y 60ºC no se esperaba degradación. Se B supuso que este fallo pudo a la preparación de muestras con el detergente B por duplicado, o la falta de la muestra en los tubos del detergente A.
Figura 4: Se observan bandas similares en los geles de poliacrilamida 7 Método cuantitativo: Actividad proteasa en función de la temperatura Se observó el efecto de diferentes temperaturas sobre dos tipos de detergente.
Tabla 1: Absorbancias de ambos detergentes a diferente Tª 4ºC 40ºC 60ºC A B 0,033 0,024 0,029 0,073 0,024 0,070 0,296 0,056 0,248 0,055 0,024 0,055 0,08 0,049 0,014 0,055 0,001 0,053 A partir de las absorbancias (Tabla 1) se calculó la actividad enzimática de los detergentes a partir de la ley de Lambert-Beer: Ejemplo: 0ºC: Tabla 2: Actividades enzimáticas de ambos detergentes a diferente Tª 4ºC 40ºC 60ºC A B 0,00064 0,00049 0,00057 0,00143 0,00047 0,00137 0,0058 0,0011 0,00487 0,00107 0,00566 0,00107 0,00015 0,00096 0,000275 0,00107 0,00001 0,00104 8 A partir de las medias de los valores de las actividades enzimáticas (Tabla 2) se realizó una gráfica.
Actividad enzimática (U/mL) 0,007 0,006 0,005 0,004 A 0,003 B 0,002 0,001 0 4ºC 40ºC Temperatura 60ºC Figura 5: Representación de la actividad proteasa de ambos detergentes a diferente Tª A partir de la representación (Fig. 5) se pudo deducir que el detergente con mayor actividad proteasa es el A, y su temperatura óptima es 40ºC. La desviación que se ha observado no es muy significante, pero la variancia entre los valores puedo ser debida a fallos en condiciones térmicas de las muestras7. Estos resultados han permitido realizar la segunda parte del experimento, trabajando con el detergente A a Tª de 40ºC.
Efecto del inhibidor PMSF en las proteasas del detergente Se estudió el efecto del inhibidor PMSF sobre las proteasas del detergente A, en condiciones de Tª a 40ºC.
Tabla 3: Absorbancias a distintas concentraciones de inhibidor [↑] inhibidor [↓]inhibidor 0,185 0,004 0,086 0,165 0,012 0,355 0,178 0,005 0,234 100% act.
(sin inhibidor) 9 A partir de los valores de las absorbancias (Tabla 3) se ha podido determinar la actividad enzimática correspondiente al detergente A en presencia de diferentes concentraciones de inhibidor.
Ejemplo: Sin Inhibidor: Tabla 4: Actividad proteasa a distintas concentraciones de inhibidor 100% actividad [↑] inhibidor [↓]inhibidor (sin inhibidor) 0,00364 0,00007 0,00169 0,00324 0,000253 0,00697 0,00335 0,0001 0,0046 Se realizó un gráfico a partir de las medias de los valores obtenidos (Fig. 8).
Actividad enzimática (U/mL) Inhibición en las proteasas del detergente 0,007 0,006 0,005 0,004 0,003 0,002 0,001 0 S.I.
[I]↑ Concentración de inhibidor [I]↓ Figura 6: Actividad proteasa a distintas concentraciones de inhibidor 10 A partir de la representación (Fig. 6) se ha podido apreciar que a elevadas concentraciones de inhibidor la actividad proteasa ha sido prácticamente nula, lo que significa que el inhibidor se ha unido covalentemente al centro activo de la serín-proteasa.
En cambio a bajas concentraciones de inhibidor la actividad proteasa ha sido mayor que la de la muestra sin inhibidor, lo que se considera bastante ilógico. Esa variación puede ser explicada por la dispersión de valores (en el caso de la concentración de inhibidor baja) que se obtienen a partir de la desviación, por lo que se atribuyó a un error experimental, como la incorrecta adición de inhibidor a las muestras.
Conclusión En esta práctica se alcanzaron los objetivos propuestos parcialmente. A partir del método cualitativo no se pudo llegar a una conclusión con certeza debido al error producido durante la preparación de las muestras ya que se podría afirmar que no hay actividad proteasa en ambos detergentes aunque no sea así.
Por ello nuestras conclusiones se tuvieron que basar en el método cuantitativo con el estudio de las temperaturas. En este se obtuvo que el detergente con más actividad proteasa es el A y su temperatura óptima es 40ºC.
Al conocer el detergente con actividad proteasa se realizó el estudio de su actividad a diferentes concentraciones de inhibidor. A bajas concentraciones se obtuvo un valor mayor de actividad que a concentración de 0, lo que no es muy lógico ya que sin inhibidor los enzimas deberían presentar más actividad, esto puede ser atribuido a fallos durante el procedimiento. A altas concentraciones de inhibidor se observó una baja o casi nula actividad proteasa lo que quiere decir que la inhibición ha tenido éxito.
11 Anexo 1 Nota experimental: Durante la preparación de Tris 0,25M para el gel separador se observó que la glicina tardaba mucho tiempo en disolverse, por lo que se depositó el vaso de precipitados con glicina y agitador en un recipiente con agua caliente para favorecer su disolución.
2 En nuestro caso se midieron 15 µL de TEMED ya que a mayores cantidades polimerizaba muy rápido.
3 La dilución del PMSF para las muestras era 1/10, pero en nuestro caso no se realizó, por lo que posteriormente se observó un color amarillento de las muestras.
4 Se depositó el tampón antes que las muestras ya que al subir la corriente provoca el arrastre de proteínas, y si lo hiciéramos al revés, el buffer removería las muestras y los resultados no serían tan precisos.
5 Incidencia: No se realizó la carga en algunos geles por error, por lo que se volvió a cargar en algunos pozos. Esto no debería influir de manera significativa en el resultado dado que el experimento es cualitativo, y lo que queremos ver es si la BSA se presenta con una banda o con varias.
6 Se ha de hacer un agujero en cada eppendorf para favorecer la salida del vapor.
7 Un posible fallo pudo haber sido el mantenimiento de las muestras durante un largo periodo a Tª que no les correspondía, como la Tª ambiente en vez del hielo que hizo cambiar la actividad.
Bibliografía 1. Peptidasa [Eswikipedia.org]. 20 jul 2016. [Consulta 19 de febrero 2017] Disponible en: https://es.wikipedia.org/wiki/Peptidasa 2. Bank R. RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB. [Rcsb.org. 2017]. [Consulta 19 de febrero 2017] Disponible en: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do 3. García Pérez H. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos, actualidad e importancia. 2001.
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