Tema 6 - Bacteriòfags (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 24
Fecha de subida 26/12/2014
Descargas 22
Subido por

Vista previa del texto

BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TEMA 6 – El sistema cel·lula bacteriana – Bacteriòfags INTRODUCCIÓ Parlarem sobre la interacció entre bacteris i bacteriòfags, la transducció (forma dels procariotes d’adquirir DNA per herència horitzontal).
Salmonel·la infectada, amb els flagels i puntets, que són bacteriòfags. És un tall transversal – veiem com una bossa de bacteriòfags (observem les càpsides) que estan a punt de lisar i sortir.
Total que els bacteriòfags no són algo guai per la cèl·lula. A nosaltres però ens va bé – teràpia fàgica (per ajudar als antibiòtics a funcionar).
De bacteriòfags n’hi ha de molts tipus. Cap d’ells té envolta ja que la paret bacteriana no se la poden emportar – a nivell de virus d’eucariotes sí que poden sortir emportant-se la membrana de la cèl·lula i en fusionar les cèl·lules tornen a entrar a la cèl·lula. Però en procariotes no passa perquè la paret és més gruixuda. Per tant solen ser icosaèdrics amb cuetes.
PROCÉS INFECTIU Adsorció – detecció de la diana.
Adhesió covalent i injecció – s’ancora part de la càpside a la paret injectant el DNA – els que tenen cua injecten el DNA claven part de la càpside i els que tenen les potetes més curtes ho fan una mica diferent. Es contrau la cua i es clava el fibló a lo xeringa.
45 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Tenim els bacteriòfags lítics (fan cicles lítics) i els lítics o atenuats (poden fer els dos).
Recordem que no existeixen els bacteriòfags lisogènics – els bacteriòfags són atemperats o atenuats, i aquests poden fer cicles lítics o cicles lisogènics, però lo que és lisogènic és el cicle.
Cicle lític Cicle lisogènic 46 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Els fags atenuats no sempre integren el DNA en el cromosoma bacterià! Alguns d’ells poden mantenir el seu DNA de forma extracromosòmica; no és una condició sinequanon el fet d’integrar el DNA al cromosoma bacterià per poder ser un fag temperat. Serà estable sempre que es pugi mantenir viu dins un bacteri, però poden estar integrats al cromosoma o poden estar por ahi com un plasmidi.
Si la cèl·lula no està sota estrès (no s’ha induït el sistema SOS), tots els bacteriòfags estan produint cicles lisogènics (cèl·lules amb pròfags lisogeneitzats), però en una de cada 10.000 parts de la seva població entra en cicle lític (sempre hi ha una molt petita part que produeix nous virions entrant en cicle lític). En canvi quan sí hi ha estrès, pràcticament el 90% dels fags entren en cicle lític.
Parlem ara de transducció i mecanismes moleculars dels virus, i ho farem amb dos models: el bacteriòfag lambda i el bacteriòfag P22. Aquests dos ens donen idea de la majoria de fags.
BACTERIÒFAG LAMBDA El bacteriòfag lambda és un dels més coneguts de fags que infecten E. coli – els bacteriòfags són molt específics. El bacteriòfag lambda no pot infectar una Salmonella. Poden arribar a ser específics a nivell d’espècie i fins i tot a nivell de soca d’una mateixa espècie.
És un bacteriòfag atemperat. Tenim la càpside icosaèdrica, una cua llarga que s’injecta en la paret de la cèl·lula per produir la injecció del DNA. Com s’organitza a nivell molecular? Es diu que els fags són DNAs modulars – són com si fossin un lego. Tindràs unes peces que les vas acoblant fins a formar un genoma. Però si mires molts genomes, veus que tots són variacions i barreges de les mateixes peces de lego. Per exemple lambda té uns gens que produiran les proteïnes de la càpside, uns que produiran la cua, uns que permetran la lisogènia, uns que permetran la replicació del DNA i poco más. I un altre fag tindrà els gens de la càpside idèntics als de lambda però els de regulació de tal equivalents als del T4...
47 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Seguint aquesta idea, es diu que la informació genètica està compartimentaritzada – estan molt organitzats a nivell funcional, i tots els gens que fan una mateixa funció estan units i situats en el mateix lloc del genoma (tots els gens involucrats en la síntesi de la cua estan junts, etc.) i estan també molt finament organitzats per tal que amb la mínima expressió s’aconsegueixi la màxima expressió – regulen molt bé les mutacions polars i tot això per una màxima optimització.
EXPRESIÓ TEMPORAL DELS GENS Tot això permet veure que tenim una sèrie de gens que es van agrupant en funció del moment en el qual s’expressen. Els gens dels bacteriòfags els cataloguem en: - Very ealry – són els primers en expressar-se quan el bacteri entra en la cèl·lula. Són proteïnes necessàries en l’inici de la infecció.
Early – s’expressen després dels very ealry però relativament aviat. Són proteïnes necessàries en la replicació del genoma víric.
Late – són els que s’expressen al final de tot del procés infectiu o al final de tot, quan ja s’hagi decidit entre cicle lític o lisògenic (que indesision). Són proteïnes necessàries en l’acoblament i sortida de virions o en la integració en el cromosoma de l’hoste.
L’expressió dels gens està molt temporalitzada – quan hi ha expressió dels very early no hi ha expressió dels early; els sistemes de promotors d’aquest fags estan molt organitzats, i s’expressen només quan és estricament necessari per optimitzar al màxim la producció.
48 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Molts bacteriòfags tenen amplificades en el seu genoma algunes de les regions que més necessiten però moltes vegades usen proteïnes pròpies de l’hoste per fer-les servir ells. Aquest bacteriòfag pot per tant modular l’acció de les proteïnes de l’hoste (utilitza la maquinària pròpia de l’hoste però també té proteïnes pròpies).
17/11/14 El bacteriòfag ʎ, com molts altres, quan està dins la càpside vírica, el DNA es troba en forma de DNA lineal i quan està dintre la cèl·lula aquest DNA recircularitza. Com reciruclaritza? Aquest DNA té unes regions COS, que són unes regions cohesives, complementàries entre elles.
Aquestes regions són 5’ protunding (tenen un tros de ssDNA complementari entre les dues bases – és com un lego). Finalment, la lligasa de l’hoste dóna tancament al cercle (fa l’enllaç fosfodièster).
REPLICACIÓ DEL FAG ʎ Quan el DNA del bacteriòfag és injectat, de les primeres coses que s’expressen són les proteïnes implicades en la replicació del bacteriòfag – el primer que fa és replicar per superar els sistemes de restricció. El bacteriòfag ʎ té dos tipus de replicacions: en Theta i en cercles rondants.
Presenta dos tipus de replicació. Pot replicar en Theta o mitjançant el cercle rodant.
49 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 THETA (θ) Semblant a la replicació del cromosoma bacterià – tenim unes seqüències de reconeixement de proteïnes d’inici de la replicació, la proteïna d’inici serà la proteïna O i serà una proteïna pròpia (com la DnaA). Aquestes seqüències estan a prop de regions riques en A/T. La proteïna O reconeixerà les caixes, nucleofilamentarà al voltant, obrirà una forqueta de replicació i un cop oberta en els bacteris incorporaríem una helicasa que reconeix seqüències específiques.
Ara tenim una proteïna que rep el nom de proteïna P que interacciona amb la DnaB (helicasa) de la cèl·lula hoste i la vehicula a on es troba la proteïna O. O i P es troben en el mòdul de replicació.
Tot el muntatge del replisoma és de l’hoste (segrest) a excepció de proteïnes O i P.
En funció del bacteriòfag trobem replicacions bidireccionals i unidireccionals. En ʎ és unidireccional.
Sempre la primera replicació és per theta. Però ʎ pot decidir fer cicles lítics o lisogènics. Si vol fer un cicle lític per amb poc temps obtenir el màxim possible de partícules víriques, no pot fer cicle Theta, i triarà un tipus de replicació més eficient: per cercle rodant o en σ.
50 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 MITJANÇANT EL CERCLE RODANT (σ) Ens queda una cadena de DNA que va rodant i un conjunt de genomes que aniran un al costat de l’altre que rebran el nom de concatèmers.
La idea és – hi ha enzim endonucleasa codificat pel bacteriòfag que produeix un tall en una seqüència concreta del DNA. A partir d’aquest tall, s’estira de l’extrem 5’ quedant un 3’ lliure que s’usa com a primer i és on la polimerasa comença a polimeritzar (no deixa de ser una regió de forqueta de replicació) però no deixem d’estirar de 5’; al cap d’una estona la part polimeritzada de 3’ va corrent (el cercle va rodant). Per altra banda es munten les fragments d’Okazaki i la lligasa ajuda per completar l’altra seqüència.
Per tant la teoria semiconservativa del DNA se’n va com una miqueta a la merda ja que en el moment que estirem i la cadena blava (recent polimeritzada) passa cap a la dreta, tenim que surten dues cadenes blaves tota l’estona. Acabem tenint un concatàmer darrere d’un altre, en sèrie.
No produïm circulitos, sinó genomes de dues cadenes blaves en sèrie. L’antiga queda donant voltes i les noves es van copiant.
Llavors tenim una endonucleasa (enzim de restricció) que reconeix i talla per la regió COS fent un tall cohesiu – acabem tenint un fragment lineal de DNA amb els extrems 5’ overhanging.
“Al final la cèl·lula es mor”.
51 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 ENCAPSIDACIÓ DEL DNA Ara hem de posar el DNA dins la càpside vírica perquè no es torni a relligar. Mentre el DNA s’està replicant (mentre es formen concatèmers), la cèl·lula també està produint els gens implicats en la producció de proteïnes del cap i la cua. El primer que es forma és la pre-càpside – és un andami en el qual hi ha l’estructura i tal però encara està buida. En el moment que el DNA és reconegut i tallat per l’enzim de restricció, aquell extrem lliure de ssDNA que s’ha generat en l’extrem COS comença a entrar en la càpside i és empaquetat fins la següent regió COS. En aquell moment en que la càpside ja està plena, s’uneix a la cua i es munta el bacteriòfag definitiu.
Aquest enzim de restricció situat a la pre-càpside és la terminasa, que és qui talla el DNA per la regió COS i l’introdueix en la càpside vírica fins que el torna a tallar per la següent regió COS (entre dues regions COS tenim un concatàmer).
Un cop tinguem això, la cèl·lula muntarà uns canals de sortida del bacteriòfag – un bacteriòfag NO explota una cèl·lula (); codifiquen per les proteïnes holines que generen canals en l’estructura de la cèl·lula suficientment grans com perquè el bacteriòfag pugui sortir de la cèl·lula. També codifiquen per lisozims que fan que la paret bacteriana sigui més feble. Si associes el fet que la paret és més feble i tens forats, la cèl·lula no explota ben bé però està feta pols.
52 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 DECISIÓ DE CICLE LÍTIC O LISOGÈNIC El bacteriòfag ʎ és un bacteriòfag atemperat, per tant podrà decidir a nivell molecular quin cicle fer en cada moment.
Què fa que triï un o altre? Hi ha factors ambientals que afecten la decisió – no tenen ni punyetera idea de com són les senyals a nivell molecular. L’únic que se sap és que si canvies coses en el cultiu afectes la decisió de la cèl·lula.
El bacteriòfag ʎ voldrà fer cicles lítics quan els medis són rics, la temperatura s’apropa a la òptima i quan la MOI és baixa (multiplicitat d’infecció – ratio entre quants bacteriòfags tinc i quantes cèl·lules tinc (en aquestes condicions són metabòlicament actius i és un bon moment per dividir-se i produir molts i molts virions; en cas de MOI, quan el ratio és baix voldran replicar perquè estan sols al món i així incrementen la població; si és alt, hi ha molts bacteriòfags acabaran matant la cèl·lula).
Com es transmet aquesta senyal a nivell molecular? Funciona amb un munt de proteïnes i promotors coordinats entre ells. Els principals són: - CI – repressor del cicle lític (protagonista principal).
Cro – inhibidor de la síntesi de CI = activador del cicle lític (antagonista principal – inhibidor del repressor).
C II – activador transcripcional de CI (actor secundari).
C III – estabilitzador de CII (actor secundari).
Trobem el mòdul de decisió que és el lloc del genoma bacterià on es concentren tots els promotors que intervindran en el sistema.
Les proteïnes cI i cro estan codificades en gens que estan un al costat de l’altre (molt a prop dins el mòdul de decisió).
L’activador transcripcional de CI (CII) i CIII es troben més allunyats d’aquesta regió.
53 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Trobarem diferents promotors: - PE – promotor d’establiment – produeix la proteïna CI, i CI inhibeix dos promotors o PR – promotor right o PL – promotor left Aquests dos per tant seran bloquejats quan CI estigui present – si el repressor del cicle lític els bloqueja, és lògic pensar que PR i PL tindran a veure amb la generació d’un cicle lític.
A més la presència de CI en PR més que en PL permet l’activació d’un quart promotor: - PRM – promotor de manteniment – permet la síntesi de CI. Aquest està més lluny, i un mateix gen està controlat per més d’un promotor – el promotor és PE però és PRM qui permet l’expressió basal de CI. Si no bloquegéssim PR i PL (si CI deixés de bloquejarlos), s’induiria el cicle lític. Si una cèl·lula ha de mantenir-se en estat de lisogènia per sempre, ha de tenir sempre una quantitat mínima de CI per tal que no s’indueixi fàcil un cicle lític. La cosa és que quan CI està present, no pot fer servir PE per aquesta producció basal ja que CI esta bloquejant l’accés de la RNA polimerasa.
Cro fa el contrari de CI – quan cro està present, bloqueja PRM i per tant activa PR i PL, de manera que s’activa el cicle lític (codifiquen per proteïnes de lisi).
MÒDUL DE DECISIÓ 54 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 VISIÓ GLOBAL DEL PROCÉS El primer que fa un bacteriòfag en entrar en una cèl·lula és circularitzar, però abans de replicar el seu DNA, el que fa és expressar els seus gens per produir les proteïnes O i P que intervindran en la replicació.
Els promotors R i L són els més forts, per tant totes les polimerases aniran cap allà un cop el bacteriòfag hagi infectat la cèl·lula. El primer que fa doncs és, a partir del promotor dret que té un terminador transcripcional, sintetitzar un mRNA que codifica per la proteïna Cro, que activa els promotors R i L; i a partir del promotor esquerra, que té un altre terminador transcripcional, sintetitzar un mRNA que codifica per la proteïna N, que és un antiterminador dels terminador TR i TL. El bacteriòfag no té gaires més promotors que aquests, però té tot el genoma per codificar! Per tant, N bloqueja els terminador transcripcional i la RNA polimerasa no es pararà a la primera TR ni a la primera TL i generarà un transcrit més llarg que arribarà a TR2 i a TL2.
En aquesta unitat transcripcional que hem allargat ara contindrà els gens cro, cII, O, P i Q . Cro seguirà bloquejant PRM. O i P són les proteïnes que intervenen en la replicació. Q és un antiterminador del terminador L, per tant també allarguem el transcrit que abans només produïa N – ara es produirà N (per mantenir aquest allargament del transcrit en R) i CIII.
La presència de Q és un altre antiterminador i permet superar els segons terminadors transcripcionals darrere el qual hi ha tots els gens vinculats a la producció de càpsides víriques (si vols fer un cicle lisogènic no t’interessa produir tot això).
CII farà tres coses. Una és activar el promotor antiQ – és un promotor que generarà un RNA antisentit de Q (és un RNA d’interferència que bloquejarà l’expressió de Q), evitant que Q es produeixi donant una mica de temps abans de produir el cicle lític. L’altra és activar el promotor de la integrasa (està més avall de N) ja que en ʎ el procés de cicle lisogènic comprèn la integració del seu DNA víric en el DNA de la cèl·lula i qui ho fa és la integrasa. L’altra és activar el promotor d’establiment, el qual produeix CI que bloquejarà tot això. Si hi ha suficient CII, produirà CI.
CIII estabilitza CII – aconseguirà que la vida mitjana de CII sigui més llarga, i contra més llarga sigui, més podrà actuar i més fàcil serà donar lloc a un cicle lisogènic.
55 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 En el moment en què es produeix CI, s’inhibeixen els promotors pR i pL (desplaça a Cro) i s’activa el promotor de manteniment PRM – estem davant d’un cicle lisogènic.
Qui guanya, el cicle lític o el cicle lisogènic? Tot depèn de la concentració de Cro i CI, i d’entrada tenim Cro, per tant normalment qui guanya és el cicle lític, perquè Cro el tenim des del minut 1 i la seva presència activa el cicle lític. Però la concentració de cI final acaba superant a Cro. En un 80-85% dels bacteriòfags atemperats trien un cicle lític.
A tot això, encara no hem vist com decideixen.
19/11/14 Per què competeixen cro i cI? Perquè els seus llocs d’interacció són molt semblants. Dins els PR i PL hi ha la regió operadora R i L respectivament (els llocs on interaccionen els repressors transcripcionals). Cada una de les regions operadores està composta de tres regions, R1,R2 i R3 i L1, L2 i L3. Aquestes són reconegudes tant per Cro com per cI – comparteixen la regió de però no la seqüència de reconeixement. L’afinitat per cada una de les regions operadores és diferent, de manera que cI s’enganxa molt fort a R1 i quan cI està molt enganxat a R1 té una activitat cooperativa i ancora una segona proteïna de cI.
Per tant, quan una cI o una cro s’uneixen al DNA, la unió de les següents Ci/cro és més fàcil (unió cooperativa).
CI reconeix primer R1, i la següent s’uneix a R2. En canvi, Cro té més afinitat per R3 i la següent s’introduirà en R2.
La gràcia és que quan cI s’uneix al DNA i ràpidament la següent cI s’uneix a R2, s’evita l’entrada de Cro, i viceversa – competeixen per la mateixa regió.
Ci I cro són excloents.
56 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Quan CI s’ubica a R1 i R2, bloqueja el PR però deixa lliure el PRM i per tant la conseqüència és la inhibició del PR i l’activació de PRM. En canvi, quan Cro s’uneix a R3 i R2, s’inhibeix l’activitat de pRM i per tant inhibim l’expressió de CI i deixa via lliure a l’expressió de PR.
La mateixa història per PL – Cro no bloqueja el promotor pL i cI sí (tot i que aquí no hi ha cap promotor en sentit contrari). Per això a Cro se l’anomena inhibidor de cI, evita que hi hagi una repressió (l’efecte final és una activació però NO hi ha un increment d’expressió).
Acaba guanyant una o altra en funció de qui s’uneix primer (qui guanya la posició R2) més que qui està en major quantitat relativa (Cro s’està sintetitzant des del minut 1, ho tindria bastant guanyat), però els dos factors afecten (serà més probable que s’uneixi primer el que estigui en major concentració).
cI i Cro interaccionen en forma de dímer. Però un dímer sol no s’estabilitza sobre el DNA – s’estabilitzen quan hi ha dos dímers interaccionant entre ells (cooperativitat d’unió). És per això que l’entrada del segon dímer a R2 tant de cI com de Cro és molt més fàcil (s’enganxen entre ells per Cter).
Només quan les concentracions de Cro o CI siguin extremadament altes s’unirà la tercera posició que ocupen (bé sigui la 3 o la 1 en funció de la proteïna). A més, l’entrada d’un sol dímer de cI, no bloqueges PRM – només bloquejaràs PRM quan hi hagi tant Ci que s’uneixi a R3 i bloquegi la seva pròpia síntesi de pRM. Per altra banda, si tenim moltíssim cro, acabem ocupant una regió amb cro que transcriu per la pròpia proteïna cro (autoregulació de cro i cI quan les seves concentracions són extremadament estables).
57 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 La decisió entre cicle lític i cicle lisogènic ve determinada pels factors ambientals sobre els personatges secundaris cII i cIII.
Contra més cII tens (cII produeix cI), més cI acabes tenint, i per tant més probable és que tinguis un cicle lisogènic. Qui controla cII? Està controlat per les proteases de la cèl·lula – cII és una proteïna que té moltes senyals reconegudes per les proteases de la cèl·lula i la cèl·lula degrada aquesta proteïna cII.
D’alguna manera, qui controla les proteases de la cèl·lula són els factors ambientals. Si el medi nutricional de la cèl·lula és mínim, les proteases estan molt actives perquè el que vols són molts recanvis de proteïnes per poder sintetitzar allò que t’interessa. Quan les MOI són molt altes i tens molts bacteriòfags pul·lulant, la cèl·lula està en estrès i no produeix moltes proteases de manera que la cèl·lula apaga el cicle lític.
La idea és que el bacteriòfag acobla la seva decisió a l’estat en el qual es troba la cèl·lula hoste. Si la cèl·lula es troba en un medi ric o si la cèl·lula està estressada, s’induirà cicle lític, el bacteriòfag no es voldrà quedar, en un cas perquè la cèl·lula se muere, en l’altre perquè si hi ha molts nutrients, hi ha moltes cèl·lules que podem infectar, aprofitem. Però sestà a punt de morir. En canvi si tenim pocs nutrients, el fag s’espera a que la cèl·lula el porti a unes condicions millors, i s’indueix el cicle lisogènic.
Per altra banda, tenim cIII (també la produïm a través de l’allargament de les cadenes de mRNA perquè N havia tapat els terminadors) que activa dues proteïnes (HflD i HflB/FtsH) que estabilitzen cII i inhibeix les proteases de la cèl·lula.
És a dir, un fag sempre està una mica decantat cap a un cicle lític, ja que per poques proteases que hi hagi a la cèl·lula aniran a per cII.
58 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 MANTENIMENT DEL CICLE LISOGÈNIC Llavors, si la concentració de les proteases no és molt alta, el que aconsegueix aquest bloqueig per part de cIII és que s’allargui una mica més la vida mitjana de cII per donar-li la oportunitat a que actuï i que hi hagi una mica més de cI. Però si la concentració de proteases és molt alta, serà por algo, i tampoc podran lluitar contra una concentració molt alta, així que millor deixem que actuïn i es desencadeni el cicle lític.
En un medi pobre, s’hauria d’induir un cicle lític, però no és del tot cert perquè les proteases no estan entretingudes en cII que és una proteïna petita, sinó que en busquen de més grans per poder obtenir més AA ràpid, i s’indueix una lisogènia perquè el fag pensa, millor m’espero que les condicions siguin millors per sortir, perquè sinó faré virions pa que se mueran.
59 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 INDUCCIÓ DEL CICLE LÍTIC Durant el cicle lisogènic del bacteriòfag ʎ, PR i PL estan bloquejats perquè tens cI. Per cert, que quan un bacteriòfag està inserit dins un cromosoma bacterià, es diu pròfag.
Molts bacteriòfags acoblen els sensors d’estrès dins una cèl·lula per saber quan han de marxar.
Si es donen lesions en el DNA i es produeix RecA*, aquest RecA* reconeix cI com si fos LexA i cI s’autohidrolitza a tot arreu i així es torna a produir Cro des de PR i Pl i s’indueix el cicle lític.
ESCISIÓ – Sortida del cromosoma bacterià La sortida del cromosoma bacterià involucra la integrasa i l’escisionasa que permet la sortida del fag de la cèl·lula.
Per incorpora el DNA víric dins el cromosoma bacterià s’usen proteïnes de l’hoste i la integrasa del virus, i per sortir del cromosoma bacterià necessites proteïnes de l’hoste, la integrasa i l’escisionasa. Quan s’activa un cicle lític, el genoma víric replicarà per cercle rodant.
60 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 INTEGRACIÓ DEL FAG ʎ EN EL CROMOSOMA BACTERIÀ La integració del cromosoma víric no es dóna a qualsevol lloc a l’atzar, sinó que es dóna en un lloc molt específic – en att (regió d’attachment). Tenim una regió attP (regió en el cromosoma del phag) i una attB (regió en el cromosoma del bacteri).
Aquestes dues regions són petites (20-30 pb) i exactament iguals. La seva presència és reconeguda específicament per la integrasa per propiciar la recombinació en aquesta regió.
Quan es dóna aquest intercanvi entre attP i attP es genera una duplicació del att – tenim un trosset del att del bacteri i un att del fag – ho anomenem attL i attR (són iguals a nivell de seqüència). Per tant a banda i banda del fag tindrem una regió duplicada que després permetrà la escissió – gràcies a la integrasa i la escisionasa, es tornen a reconèixer i es torna a produir un procés de recombinació, separant aquests dos components i deixant un d’extracromosòmic (el del virus) i l’altre que serà el del bacteri.
Cada virus té una regió específica d’att reconeguda per la seva pròpia integrasa.
La integrasa reconeix la zona i fa la recombinació i la escisionasa talla i separa les dues cadenes.
El lloc d’integració del fag ʎ en E. coli es troba en la regió compresa entre l’operó gal i el gen bio (de biotina).
61 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Pregunta – si tenim un mutant d’E.
coli en que eliminem la regió attB (regió entre gal i bio), es podrà integrar el fag en el cromosoma bacterià? A priori no es podria donar la integració, però la resposta és sí, ja que la integrasa reconeix una regió petita (pocs nucleòtids), i per combinatòria alguna regió s’assemblarà al llarg del cromosoma i la integrasa també la reconeixerà.
Això sempre passa en les seqüències importants – els bacteris no són idiotes i sempre van a buscar seqüències conservades por si pasan coses de estas (atts secundaris).
Diferents att secundaris: Pregunta – tenim una soca d’E. coli lisogènica pel bacteriòfag ʎ que es troba amb un altre bacteriòfag ʎ – el segon bacteriòfag ʎ pot infectar (injectar el DNA) en la primera? Sí, però ara el fag donarà lloc a cicle lisogènic – hi ha molt cI en la cèl·lula lisogènica per ʎ. Per tant no deixaràs al DNA que està entrant del segon ʎ no el deixes expressar-se perquè ràpidament cI reconeix les regions operadores i pim pam – infecció abortiva.
Si la concentració de cI permet que des de PR i PL es doni cII i integrasa, el que passarà és que el bacteriòfag ʎ que ha entrat i ha recircularitzat es podrà recombinar en els attR i attL que hi havia perquè són primaris i tindrem tàndems de ʎ – podem trobar E. colis amb més d’un ʎ.
62 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 En un bacteriòfag que sempre realitzi el cicle lític (no tingui capacitat per realitzar el lisogènic) si que podria infectar, però sempre i quan realitzes el cicle lític.
24/11/14 Dos bacteriòfags són homoimmunes quan els seus repressors del cicle lític (cI) es poden intercanviar entre ells, es poden complementar en trans (realitzaran el cicle lisogènic inserintse en el DNA bacterià quan infectin la cèl·lula per segon cop).
Dos bacteriòfags són heteroimmunes quan els seus repressors del cicle lític (cI) no són intercanviables, no es poden complementar en trans. Tot i compartir el mecanisme de decisió, cada un dels repressors reconeix seqüències diferents en el DNA. Per això el fet que hi hagi un cI en la cèl·lula no interfereix amb el de l’altre bacteriòfag.
PROCÉS DE TRANSDUCCIÓ – Especialitzada (bacteriòfag ʎ) La transducció és un mecanisme de transferència horitzontal de DNA enter diferents microorganismes. En el cas del bacteriòfag ʎ, consisteix en un procés en el qual el bacteriòfag, en el moment de generar un cicle lític, s’equivoca a l’hora d’escindir el DNA i s’emporta un tros de DNA que flanqueja el lloc d’integració. Per això en les càpsides víriques trobem tant DNA víric com DNA del bacteri. Això ho anomenem transducció especialitzada perquè únicament es transdueixen els fragments de DNA que flanquegen el DNA víric.
És important doncs conèixer el punt d’inserció del bacteriòfag perquè seran els susceptibles d’escindir-se.
63 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Llavors tenim dues situacions: una en la que el bacteriòfag s’ha deixat un tros gran o important de genoma en la cèl·lula i no funcioni (perd capacitat infectiva), i una en la que el bacteriòfag s’ha deixat un tros petit o no important de genoma en la cèl·lula i pugui ser perfectament viable. En aquest segon cas, quan s’insereixi en el genoma d’un altre bacteri (de la mateixa espècie que el primer ja que els bacteriòfags són molt específics) hi haurà homologia entre el cromosoma bacterià i el fragment del DNA víric que provenia del DNA genòmic. Aquest procés es pot donar tant a través de la integrasa com a través de recombinació homòloga (RecA). si es dóna per integrasa, s’inserirà tot el genoma. Si es dóna per RecA, es podran formar un o dos quiasmes. Amb un quiasma s’incorporarà tot el genoma del virus al bacteri. Si es donen dos quiasmes, se substituirà el fragment del DNA receptor (del segon bacteri infectat) pel fragment de DNA donador (del primer bacteri infectat), per la qual cosa no hi haurà inserció de gens sinó que es donarà un intercanvi d’aquests. En aquest cas, es perdria material víric.
Un esdeveniment de recombinació.
Intercanvi de marcadors.
64 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 PROCÉS DE TRANSDUCCIÓ – Generalitzada (bacteriòfag p22) BACTERIÒFAG P22 És un bacteriòfag que infecta Salmonella entèrica (proper a E. coli filogenèticament). Té una estructura compartimentaritzada i un mòdul d’immunitat i decisió semblant al ʎ en E. coli. el P22 s’integra en una seqüència de tRNA, per la qual cosa la seva seqüència estarà molt conservada i serà molt fàcil que es trobi en la cèl·lula. En aquest cas la proteïna CI és equivalent a C2, la proteïna cII és equivalent a C1 i CIII equival a C3.
Té un sistema d’exclusió de protecció de les cèl·lules lisògenes. Els bacteriòfags infecten les cèl·lules perquè reconeixen unes proteïnes de paret. Quan el P22 lisogenitza una soca de Salmonella no només s’expressa en aquella soca el c2, sinó que també s’expressa aquest sistema, que són proteïnes que modifiquen les proteïnes de paret de P22 – canvien les proteïnes de reconeixement per la infecció per avisar als demés P22 i així evitar sobreinfeccions.
65 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 El bacteriòfag P22 té tant replicació θ com replicació σ. Aquest bacteriòfag no té els extrems cos que permeten la recircularització com el bacteriòfag ʎ, sinó que el seu genoma comença i acaba amb la mateixa seqüència, la seqüència pac. RecA reconeix aquesta duplicitat i produeix una recombinació per que el genoma víric recircularitzi. Així es genera un cromosoma circular sense duplicitat. A partir d’aquí, en funció del cicle que decideix fer, es donarà replicació en θ o en cercle rodant (σ).
El procés d’encapsidació també és diferent. Es fa per headfull – per fer que les seves càpsides siguin madures, va fotent DNA fins que no hi cap més.
La primera encapsidació del 1r concatàmer que ve de la replicació en cercle rodant és reconeguda per un enzim que reconeix la seqüència PAC. El que cap és el genoma i una mica més que és el que dóna la duplicitat (redundància terminal, en els extrems). La seqüència PAC només és reconeguda un sol cop. Això el que fa és que el tros duplicat en cada càpside sigui diferent en cada virus – permutació cíclica. Totes les càpsides contenen el genoma víric sencer.
Tot i això, quan aquests virus infecten la cèl·lula tots seran iguals, ja que RecA produirà recombinació. Per tant les regions repetides s’eliminaran. El bacteriòfag únicament ha de reconèixer una seqüència PAC, i a partir d’aquesta és capaç d’encapsidar tot el genoma víric.
Si un bacteriòfag troba la seqüència PAC en el cromosoma de la cèl·lula, podrà encapsidar tot el genoma bacterià, encara que no s’hagi inserit el genoma víric ja que la seqüència de reconeixement de la terminasa pot trobar-se per atzar en el DNA del bacteri.
66 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Així es generen les partícules víriques i transductants, que podran realitzar una transducció generalitzada, una injecció de DNA que s’integrarà en el cromosoma bacterià gràcies a un procés de recombinació homòloga produït per RecA.
El P22 és un bacteriòfag atemperat, per lo qual podrà realitzar tant transducció generalitzada com especialitzada, ja que si s’integra en el cromosoma pot escindir-se de manera incorrecta.
En canvi el bacteriòfag P1 té encapsidació per headfull i tal però no s’integra, per tant només farà generalitzada.
Un bacteriòfag que no sigui lisogènic també podrà realitzar una transducció generalitzada, ja que aquest no requereix de la integració, però no podrà realitzar una transducció específica perquè per aquesta sí és necessària la integració. Qualsevol bacteriòfag que s’integri podrà realitzar transducció específica. Qualsevol bacteriòfag que tingui encapsidació per head-full, redundància terminal i per tant permutació cíclica podrà realitzar transducció generalitzada.
67 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 Els bacteriòfags fan transferència lateral. Però les cèl·lules amb pròfags en l’interior mueren. Què aporten perquè la fitness de les cèl·lules hostes no baixi dràsticament? Els pròfags realitzen conversió fàgica per mantenir-se dins la cèl·lula bacterià proporcionant avantatges.
CONVERSIÓ FÀGICA És l’adquisició per part d’un bacteri d’una propietat o característica deguda a la lisogenització d’un bacteriòfag atemperat. Els bacteriòfags contenen gens que són un plus per aquelles cèl·lules hostes com ara: El fet de tenir un pròfag en l’interior fa que altres virus també realitzin cicles lisogènics (per la qual cosa no maten la cèl·lula). A més la majoria de pròfags contenen gens propis beneficiosos.
Aquests es troben en el genoma víric però no aportaran res al bacteriòfag, sinó que tindran efectes en el bacteri. Aquests gens ajuden a la cèl·lula que contenen pròfags, permetent que aquesta cèl·lula pot colonitzar ambients nous. Aquest procés de canvi degut a gens que contenen el bacteriòfag és el que anomenem conversió fàgica.
COTRANSDUCCIÓ 68 ...