Repro- Biotecnología reproductiva (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad de Zaragoza
Grado Veterinaria - 3º curso
Asignatura Obstetricia y reproducción
Año del apunte 2014
Páginas 18
Fecha de subida 22/09/2017
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Apuntes completos del temario sobre Biotecnologías reproductivas de la asignatura Reproducción y obstetricia de Veterinaria de Zaragoza.

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Biotecnologías Reproductivas BLOQUE II: BIOTECNOLOGÍAS REPRODUCTIVAS 10.
12.
13.
14.
Inseminación Artificial ....................................................................................................................................... 69 Fecundación In Vitro.......................................................................................................................................... 73 Transferencia de Embriones .............................................................................................................................. 77 Micromanipulación de Embriones ..................................................................................................................... 81 67 68 Reproducción y Obstetricia Biotecnologías Reproductivas Bloque II- Biotecnologías Reproductivas Tema 10- Inseminación Artificial T. 10 INSEMINACIÓN ARTIFICIAL La Inseminación Artificial (IA) o la Aplicación Seminal, consiste en una serie de técnicas que permiten conseguir una gestación tras el depósito de la menor cantidad posible de semen en el aparato genital femenino.
TIPOS DE APLICACIÓN SEMINAL O IA Hay diferentes tipos de IA dependiendo de donde depositamos el semen en el tracto genital femenino: - Vaginal: Se deposita en el fondo de la vagina.
- Cervical: Se deposita en el cérvix, siendo:  Superficial: Entrada del cérvix.
 Media: Mitad del cérvix.
 Profunda: Final del cérvix, aunque es prácticamente uterina.
- Uterina: Se deposita en el cuerpo o en los cuernos.
- Cloacal o tubárica: En aves.
- Externa: En peces.
- Otros: Laboratorial, mediante fecundación in vitro o ICSI.
FACTORES QUE REGULAN EL ÉXITO DE LA IA DEPENDIENTES DEL SEMEN - Dosis seminales de calidad. Para comprobarlo se realizar las pruebas de control.
- Tipos de semen. Escala de éxito: Fresco > Refrigerado > Congelado.
- Ascenso espermático. Es el tiempo que tardan los espermatozoides en llegar desde el lugar de depósito hasta el lugar de fecundación. Depende de:  Hipercinesis de los espermatozoides: Se pueden añadir activadores de la motilidad, como teofilina, cafeína, oxitocina…, y tener heteroespermia, aunque solo es de interés para la F1.
 Lugar de depósito: Depende de la anatomía de la hembra y de los factores técnicos.
- Supervivencia en el tracto genital femenino. Depende de la calidad del semen y de la fisiología del aparato genital de la hembra, pudiendo haber incompatibilidad.
DEPENDIENTES DE LA HEMBRA - Estado del genital femenino. Se hace una exploración del moco vaginal. Si sale sucio no se insemina y hay que dejar pasar el celo. También hay que practicar lavados con antisépticos.
- Duración del ciclo, celo y ovulación.
ESPECIE Yegua Vaca Oveja Cerda Perra Gata Coneja CELO 4 -7 d 16 – 18 h 1’5 – 2 d 55 – 60 h 5–9d - - OVULACIÓN 2ª mitad 12 – 16 h post celo Final del celo 36 – 48 h post celo 2 post LH Provocada Provocada - Calidad del ovocito. También puede considerarse como un factor técnico. Su calidad depende de la edad de ovocito, que se mide con una detección adecuada del momento del celo. Hay que coordinar la inducción de la ovulación con el momento de IA.
69 FACTORES TÉCNICOS - Detección del celo y ovulación. Depende de la coincidencia de la vida media del ovocito y del espermatozoide.
- - Se puede hacer una inducción programa de la ovulación.
Número de inseminaciones. Está condicionado por la precisión en la detección del celo, el tiempo de ovulación, la supervivencia de los gametos, la facilidad de repetición… Un mayor número de inseminaciones disminuye el fracaso en la fecundación, pero hay que valorar el gasto económico, desplazamiento del veterinario… Lugar de depósito. Cuanto más cerca se deposite del lugar de fecundación mayor será el porcentaje de éxito.
Pericia del operador. Es un factor que se hace más importante cuanto más difícil sea atravesar el cérvix.
Descongelación de dosis. Una descongelación inadecuada puede afectar a la fertilidad prevista de la dosis seminal. No podemos saber si se congelaron las dosis de forma adecuada, solo si conocemos los datos de Pruebas de viabilidad espermática precongelación, así que debemos descongelar adecuadamente para no incrementar los daños.
 Tasa de Recuperación = (motilidad post-descongelación / motilidad pre-congelación) x 100.
 Daños producidos por la descongelación: Deshielo de los cristales, rehidratación celular, concentración osmótica intra-extracelular, alteración lipídica de membranas.
 Precauciones:  Evitar cambios bruscos de Tª (> 3º C): Extracción rápida de las dosis dentro del contenedor (sin sobrepasar el cuello), limpieza de restos de N2 y uso de rampas rápidas y progresivas para no alargar el tiempo de descongelación.
 Evitar descensos de la Tª: Uso de descongeladores con control de Tª, instrumentos de inseminación atemperados o cargados con dosis para uso inmediato si el día es frío.
 Evitar alargar tiempos de uso: Descongelar justo antes de su uso (exploración previa) y las dosis necesarias (no muchas a la vez).
METODOLOGÍA POR ESPECIES VACUNO Protocolo de Inseminación Se hace una inseminación intrauterina profunda, lo antes posibles tras pasadas 12 horas post-celo. Si sale en celo por la mañana, se insemina por la tarde; Si sale por la tarde, se insemina a la mañana siguiente.
Dosis Seminal Pajuelas de semen congelado de 0’25 cc, con una concentración de 12 o 20 x 106 Esp. Se puede de con menor número si tienen buena vitalidad, motilidad… Material Catéter rígido, pajuela, vaina desechable, arandela y fiador.
Método de Inseminación Primero se realiza una limpieza de la vulva y se hace por método vaginal o rectal.
OVINO Protocolo de Inseminación Se hace una inseminación cervical superficial hacia el final del ciclo, aunque también se puede hacer con inseminación laparoscópica.
Dosis Seminal Pajuelas de semen refrigerado de 0’25 cc, con una concentración de 100 o 400 x 106 Esp. Si es inseminación por laparoscopia, la concentración es de 5 o 10 x 106 Esp.
Material Catéter rígido, pajuela, vaina desechable, arandela, fiador, espéculo con luz. O laparoscopio-trocar.
Método de Inseminación Por método vaginal con plica, o método laparoscópico en el cuerno.
70 Reproducción y Obstetricia Biotecnologías Reproductivas Bloque II- Biotecnologías Reproductivas Tema 10- Inseminación Artificial EQUINO Protocolo de Inseminación Se hacen dos inseminaciones intrauterinas profundas. La primera es tras la ovulación, a las 24 horas, y la segunda al día alterno.
Dosis Seminal Si se usan pajuelas de semen congelado de 0’5 cc, llevan una concentración de 2 o 4 hasta 400 x 106 Esp. Y si se elige semen fresco o refrigerado, en envases de 20 – 40 cc, con una concentración de 400 x 106 Esp.
Material Catéter flexible, pajuela o envase, conector, funda desechable, tope y espéculo.
Método de Inseminación Primero se hace una limpieza perivulvar y vulvar, y se usa el método italiano o ruso.
PORCINO Protocolo de Inseminación Se hacen dos inseminaciones, que pueden ser cervical, postcervical o intrauterina, a las 12 y 24 horas del final del celo, cuando se detecta la inmovilidad de la hembra.
Dosis Seminal La dosis cambia según la inseminación elegida: CERVICAL Volumen ml.
6 Concentración x 10 Esp POSTCERVICAL INTRAUTERINA 80 – 100 30 30 3.000 1.000 150 Material Catéter en espiral y de punta redonda, sonda, envase seminal, autoinseminación.
Método de Inseminación Primero se hace una limpieza vulvar, y se usa el método cervical, post e intrauterino.
CANINO Fisiología de la Hembra - Proestro: 9 d. (7 – 10 d) o (3 – 25 d). Incremento de estrógenos, emisión de flujo serosanguinolento, no acepta al macho salvo en casos excepcionales.
- Estro: 5 d. (5 – 10 / 3 – 20 d). Pico de LH, incremento de progesterona y descenso de estrógenos. Ovulación durante 3 días, desaparición del flujo y aceptación del macho durante 1 – 4 días.
- Metaestro: Unos 100 días. La fase luteal es más larga que el periodo de gestación.
- Anestro: 4 meses. Es monoéstrica no estacionaria, con 1 – 3 ciclos al año, y un interestro de 5 – 13 meses.
- Celo: 5 días.
- Ovulación: Se inicia a los 2 días tras el pico de LH.
Protocolo de Inseminación Se hacen dos inseminaciones, que pueden ser vaginal profunda o intrauterina. Se pueden hacer a 2º - 4º día, a 1º - 3º día postovulación, o incluso tres inseminaciones, siendo en los días 1º - 3º y 5º.
Dosis Seminal Si es semen fresco o refrigerado, en envases de 2 cc, con concentración de 100 – 200 x 106 Esp, y si es semen congelado, en pajuelas de 0’5 cc, con concentración de 50 – 150 x 106 Esp.
Material Catéter flexible, Mavic o rígido, laparoscopio vaginal o abdominal, y material quirúrgico.
Método de Inseminación Se hace inseminación vaginal profunda o inseminación intrauterina, realizando palpación abdominal, visualización, inyección laparoscópica y quirúrgica.
71 CONEJO Fisiología de la Hembra - Inducción a la ovulación: Se inyectan 30 UI vía IM de hCG o 20 picogr. de GnRH. La ovulación será a las 12 h.
- Exploración: Se valora el estado de la vulva (edematizada, rojo intenso) y se hace la inducción de receptividad, mediante bioestimulación (retirar lactancia 48 h antes, cambiar a jaula con otras hembras, control del fotoperiodo…) y PMSG (20 – 25 UI / 48 h preinseminación y ecografía).
Protocolo de Inseminación Se hace una inseminación vaginal profunda, con mejora previa de receptividad e inducción de la ovulación.
Dosis Seminal Se usa semen fresco o refrigerado, en envases de 0’5 cc, con concentraciones de 6 – 12, 15 – 20, 30 – 60 x 106 Esp.
Material Catéter rígido de punta doblada, fundas desechables y pistola de inseminación.
AVES Protocolo de Inseminación Se hace una inseminación tubárica o cloacal tras la puesta, y una por semana.
Dosis Seminal Se usa semen fresco o refrigerado, en envases de 0’1 cc, con concentración de 150 – 200 x 106 Esp.
PECES Protocolo de Inseminación Se hace una inseminación externa en la época reproductiva.
Dosis Seminal Se ponen concentraciones de 10 x 106 Esp/hueva en húmedo, o 100.000 Esp/hueva en seco.
Método de Inseminación En el método húmedo se pone el semen con las huevas en medio acuoso, y en el método seco se pone el semen con las huevas, y cuando hay fecundación se pone agua.
72 Reproducción y Obstetricia Biotecnologías Reproductivas Bloque II- Biotecnologías Reproductivas Tema 12- Fecundación In Vitro T. 12 FECUNDACIÓN IN VITRO La fecundación in vitro es la técnica de reproducción asistida consistente en poner en contacto ovocitos y espermatozoides fuera del cuerpo de la hembra para que tenga lugar la fecundación. La mayor limitación de esta técnica es la maduración de los ovocitos.
La fecundación tiene lugar con ovocitos maduros y espermatozoides capacitados. A los ovocitos se les hace madurar en la placa de cultivo, ya que en el ovario aún estaban inmaduros, y a los espermatozoides los capacitamos en el laboratorio.
Las diferentes aplicaciones que tiene la fecundación in vitro son: - Aumenta el rendimiento de los programas de producción de embriones (mayor número de crías).
- Hay embriones a bajo coste, con respecto a los ingresos.
- Obtener descendientes de madre de alta genética sacrificadas.
- Aprovechar animales infértiles, tanto machos como hembras.
- Permite los procedimientos de selección.
- Facilita el uso de semen sexado.
- Reproducción de machos y hembras incompatibles.
DIFERENCIAS ENTRE EMBRIONES PRODUCIDOS IN VIVO E IN VITRO Los embriones producidos in vitro son diferentes con respecto a los producidos in vivo en cuanto a: - Morfológicas: Son más oscuros por mayor presencia de lípidos.
- Cromosómicas: Hay más problemas.
- Metabólicas: Es diferente.
- Alteraciones en la expresión génica.
- Mayor incidencia de apoptosis.
De todos los embriones producidos in vitro, solo son transferibles a una hembra un 40%, un porcentaje bajo pero bueno teniendo en cuenta todos los embriones que se pueden producir.
OBTENCIÓN DE ESPERMATOZOIDES Los que más se usa es el semen congelado, aunque también serviría el semen fresco o refrigerado. Primero hay que procesar los espermatozoides para hacerlos fértiles o capacitarlos.
Antes que nada, hay que seleccionar los espermatozoides buenos, y para ello hay diversas técnicas de métodos de selección: - Swim-up: Los que sean motiles ascenderán por el medio y se quedan en la parte de arriba.
- Incubaciones o soluciones salinas.
- Gradiente de Percoll: Los motiles bajarán pasando por diluciones de diferente densidad.
Después de quedarnos con los mejores, se introducen en un medio de cultivo que simule el tracto genital femenino, con suplementos para quitar los factores de descapacitación y que se produzca la reacción acrosómica. Los medios de capacitación son soluciones salinas (TALB, BO) con suplementos, como la cafeína, glucosa o heparina (está en los cuernos del útero y el oviducto).
Por último, se realizan pruebas para comprobar la capacitación: - Motilidad: Los capacitados tienen movimiento circular, y los que no lo estén (los desechamos) tendrán movimiento progresivo.
- Vitalidad, acrosomas, endósmosis… 73 OBTENCIÓN DE OVOCITOS Los ovocitos que más se usan son los obtenidos de hembras sacrificadas, de ovarios de matadero. Una vez extraídos los ovarios, se introducen en un termo con solución salina y Tª controlada según la duración del transporte (si es largo Tª 4º C, si es 1 – 2 h Tª de 37º C).
En hembras vivas, los ovocitos se obtienen mediante: - Ovariectomía: Se extraen los ovarios y la hembra dejará de ser donante.
- Laparotomía (más agresiva) y laparoscopia (más repetible).
- Punción Transvaginal Ecoguiada (OPU): Se usa un ecógrafo y una sonda que se mete por vagina. Con la mano desde el recto, se sujeta el ovario. Gracias al ecógrafo, vemos la aguja, con la que se pincha el folículo y se aspira, por lo que el folículo desaparece. No hay repercusión para la hembra y es la técnica menos invasiva.
SELECCIÓN DE FOLÍCULOS Para seleccionar los folículos que aspiramos, nos fijamos en: - Diámetro: De 2 – 6 mm.
- Estado funcional: Si en el ovario hay muchos cuerpos lúteos o quistes, serán peor.
- Edad de la hembra: Es mejor que esté en edad reproductiva, ni muy joven ni muy vieja.
OBTENCIÓN DE OVOCITOS Los ovocitos se extraen del folículo mediante el aspirado o, en la yegua, el picado, donde se disecciona el ovario para obtener los folículos.
SELECCIÓN DE OVOCITOS Una vez extraídos los ovocitos, se ponen en una placa y se seleccionan los mejores, fijándonos en: - Diámetro: 110 µm.
- Cúmulus: Es mejor que tengan mucho, ya que el cúmulus ayuda en todo el proceso de maduración. Si está muy expandido significa que el ovocito está muerto.
- Citoplasma.
MADURACIÓN DE OVOCITOS Se introducen en medios de cultivo especiales y se controla la osmolaridad y el pH. Estos medios deben simular lo que ocurriría en el folículo.
Los medios base son TCM 199, SOF, TALP, B2 Menezos. Se añaden suplementos como gonadotropinas (FSH y LH), 17-β-estradiol, suero fetal bovino, fluido folicular, factores de crecimiento… El co-cultivo celular no se usa mucho.
Primero se prepara el medio y se equilibra en la incubadora, y después se introducen los ovocitos.
Para confirmar que los ovocitos han madurado, se pueden usar dos técnicas: - Valoración vital: Por la expansión del cúmulus (si se ha expandido han madurado) o tinciones vitales.
- Valoración no vital: Por tinción no vital para ver si han expulsado el corpúsculo polar. Es la más fiable.
74 Reproducción y Obstetricia Biotecnologías Reproductivas Bloque II- Biotecnologías Reproductivas Tema 12- Fecundación In Vitro FECUNDACIÓN Los medios de fecundación son TALP, SOF (fluido Oviductal), TCM 199, BO, a los que se añaden suplementos, como células oviductales, del cúmulus, heparina/cafeína, PVA/BSA, bicarbonato, fluido folicular… Los espermatozoides terminan de capacitarse en la placa de fecundación y la concentración de espermatozoides que hay que poner está entre 1 – 4 x 106 Esp/ml, siendo una concentración específica para cada macho.
CO-CULTIVO DE GAMETOS Antes de introducir los ovocitos en el cultivo, se deben retirar las células del cúmulus. Según la concentración espermática añadida, se dejan incubando juntos un tiempo determinado: - 24 horas con 1 – 2 x 106 Esp/ml.
- 6 horas con 3 – 4 x 106 Esp/ml.
CONDICIONES AMBIENTALES Hay que controlar muy bien las condiciones ambientales para simular los que ocurriría en el oviducto.
- 5% CO2.
- Humedad relativa de 95 – 100%.
- Osmolaridad de 270 – 300 mOsm.
- pH 7’2 – 7’4.
- Volumen del medio: Unos 2 – 10 µL por cada ovocito añadido. Es mejor que estén en grupo en la placa (mejor 50 ovocitos en una placa, que uno en cada placa).
- Tiempo estándar: 24 horas.
INYECCIÓN ESPERMÁTICA INTRACITOPLASMÁTICA – ICSI Con esta técnica introducimos los espermatozoides directamente en el citoplasma del ovocito. En la placa se ponen gotitas de ovocitos (unos 10 µL de medio con HEPES) y gotitas de espermatozoides (unos 10 µL de PVP y 5 µL de semen) (PVP: sustancia gelatinosa).
Mirando al microscopio, con una aguja cogemos un espermatozoide, que tendrá un movimiento ralentizado por el PVP. Después, con ayuda de una pinza para sujetar el ovocito, inyectamos el espermatozoide en su citoplasma.
75 CULTIVO DE EMBRIONES Hay diferentes medios de cultivo para los embriones, que tratan de tener las condiciones del oviducto: - Indefinidos: Constan de la base, suero y cocultivo.
- Semidefinidos: Con base y albúmina sérica.
- Definidos: Son la base (SOF o KSOM), macromoléculas (PVA) y aminoácidos.
- Secuenciales: Son diferentes medios según las condiciones del oviducto en cada momento del descenso del embrión. Hay más manipulación y cambios no controlados (sacar de la estufa). La ganancia no compensa el trabajo realizado, es más complicado.
CONDICIONES AMBIENTALES Se ponen en una estufa incubadora con 5% de CO2 y 5% de O2.
También hay sistemas de incubación submarinos, con estanterías para cada placa, que van en bolsas con los gases necesarios, y se meten en agua atemperada.
Para el transporte, hay estufas portátiles.
RESULTADOS Para evaluar que los embriones se van desarrollando correctamente, hay varias técnicas: - No vital: Fijación en alcohol-acético o tinción con orceína, para contar las células de división.
- Vital: Progresión del desarrollo o tinciones de fluorescencia, para contar las células.
CLASIFICACIÓN DE EMBRIONES DIMENSIÓN DE LAS CÉLULAS Normal. Las células se dividen de manera normal.
Anormal. Células resultantes con diferentes tamaños que afectan a la división % FRAGMENTOS - Excelentes Buenos Regulares Pobres Degenerados MULTINUCLEACIÓN Un núcleo o varios por cada célula.
EJEMPLO ¿Cuántos embriones podemos conseguir de una vaca? Hay gran variación entre las razas: - Índicas o cruces: 10 a 100.
- Lecheras: 10 a 30.
- Carne, bos taurus: 5 a 15.
También depende del origen de los ovocitos: - Vacas de matadero o castradas: 2 a 100, según la raza.
- Punción ovárica de vacas vivas: 2 a 30 por cada sesión. Se puede repetir 2 veces por semana, varias semanas.
DESVENTAJAS A pesar de estas desventajas, sigue considerándose una buena técnica.
- Bajos porcentajes de gestación. 30 – 40%.
- Alta mortalidad embrionaria, abortos, problemas gestacionales.
- Terneros voluminosos, con anomalías estructurales y funcionales.
- Más partos distócicos.
76 Reproducción y Obstetricia Biotecnologías Reproductivas Bloque II- Biotecnologías Reproductivas Tema 13- Transferencia de Embriones T. 13 TRANSFERENCIA DE EMBRIONES La transferencia de embriones es una técnica que, mediante la administración de tratamientos hormonales a una hembra donante, permite aumentar el número de ovulaciones (tratamiento superovulatorio), para conseguir un mayor número de embriones, recuperarlos y transferirlos posteriormente a otras hembras receptoras sincronizadas adecuadamente para que los gesten.
Esta técnica es interesante por muchos aspectos: - Mejora genética.
- Adelanto de la edad reproductiva.
- Bioseguridad.
- Comercio internacional.
- Conservación de una determinada genética.
- Almacenaje de material genético.
SINCRONIZACIÓN DONANTE - RECEPTORA Para sincronizar las hembras, tanto la donante de embriones como las receptoras, se usa progestágenos prostaglandinas y gonadotropinas.
BOVINO Hembras en ciclo IA a tiempo fijo - Día 0: Progestágeno.
- Día 10: Retirada del progestágeno y poner PMSG (500 – 600 UI).
- Día 0: Progestágeno.
- Día 8: PGF2α.
- Día 10: Retirada del progestágeno.
OVINO Hembras en ciclo Progestágenos hasta el día 12 – 14, y después la retirada y añadir eCG.
EQUINO - Progestágenos hasta el día 9 – 13.
- PGF2 α y hCG.
Hembras en anestro Progestágenos hasta el día 10 – 12 – 14, y después retirada y añadir PMSG (400 – 500 UI).
SUIDOS - Progestágenos hasta el día 14 – 18.
77 HEMBRA DONANTE SELECCIÓN La hembra donante será aquella hembra elegida para ser inseminada y retirarle después los embriones para ser implantados en otras hembras. Las características que deben tener las hembras donantes son: - Genética de élite en la población.
- Alimentación adecuada, con buenos niveles de I, Zn, Co, Mg y Se.
- Buen estado de carnes. No tienen que estar obesas ni muy delgadas.
- Vacunaciones adecuadas.
- Buen historial reproductivo. Ha tenido que tener, como mínimo, un buen ciclo estral previo.
- Buena salud o buena respuesta al tratamiento.
- Manejo adecuado.
SUPEROVULACIÓN Una vez seleccionada la hembra donante, se le produce una superovulación, que es la producción de un número de óvulo superior a lo habitual, mediante la administración de: - Gonadotropinas: PMSG / FSH.
- Inmunización frente a hormonas ováricas.
- Sistemas naturales, como el efecto macho o el flushing.
Según la especie, se hace: - Bovino: eCG (PMSG), HMG y FSH.
- Ovino: FSH 3 días antes de la retirada de la esponja, 6 dosis cada 12 horas.
- Caprino: FSH 60 horas antes de la retirada de la esponja, 8 dosis cada 12 horas.
- Equino: FSH.
PRODUCCIÓN DE EMBRIONES Para conseguir los embriones hay que cubrir a la hembra, bien con inseminación artificial, monta natural o reproducción asistida.
RECOGIDA DE EMBRIONES Para recoger los embriones de la hembra, primero tenemos que confirmar la existencia del cuerpo lúteo en el ovario, que se forma a las 5 – 7 días después de la fecundación, y eliminarlo.
La extracción de los embriones se realiza según la especie: - Quirúrgica: Oveja, cabra, cerda, coneja, perra y gata.
Se realiza una anestesia total del animal y se hace una incisión de unos 3 cm a nivel del último par de mamas o anterior a la ubre. Llegamos hasta el ovario y se comprueba la existencia del cuerpo lúteo. Se introduce un catéter por el oviducto en dirección hacia el útero. El extremo del catéter que queda fuera los metemos en una placa para que vaya soltando el líquido, que servirá como medio de cultivo para los embriones. A la vez, se irán depositando en la placa los embriones (de ambos cuernos uterinos). Con esta técnica se obtiene una éxito del 75%.
- No quirúrgica: Vaca y yegua. Tener en cuenta la PGF2α en la yegua.
Se pone a la hembra en un cajón para sujetarla y se le aplica anestesia local (epidural). Se realiza una palpación rectal para detectar el cuerpo lúteo y el ovario, y se introduce un catéter con dos vías. Por una de las vías se introduce una solución de lavado (Equino; 2 L PBS a 35º C; Bovino: 250 + 250 ml a 35ºC) y por la otra vía se recupera el líquido con los embriones. Con esta técnica, se recuperar el 80% de los embriones.
78 Reproducción y Obstetricia Biotecnologías Reproductivas Bloque II- Biotecnologías Reproductivas Tema 13- Transferencia de Embriones CLASIFICACIÓN EMBRIONARIA Después de obtener los embriones de la hembra, hay que observar la placa al microscopio para detectar y evaluar a los embriones obtenidos.
Se observa que hay correlación entre la edad del embrión y el día de recogida tras la ovulación – inseminación: - Regularidad de la forma.
- Compactación y tamaño de los blastómeros.
- Color y textura.
- Presencia de células extruidas (alargadas).
- Regularidad de la zona pelúcida.
- Presencia de vesículas y picnosis (contracción del núcleo y condensación de cromatina).
De todos los embriones extraídos, alrededor de un 80% son de buena calidad.
CALIDAD DEL EMBRIÓN CLAVE MORFOLOGÍA Excelente 1 Esférico, simétrico, células uniformes, buen color. Edad acorde.
Bueno 2 Imperfecciones ligeras, blastómeros extruídos, vesículas. Retraso inferior a 24 h.
Pobre o regular 3 Alteraciones más severas, vesículas, células degeneradas. Retraso superior a 24 h.
No transferible 4 Alteraciones graves, signos de degeneración, vesículas.
Ovocito no fecundado.
HEMBRAS RECEPTORAS SELECCIÓN Como hembras receptoras de esos embriones obtenidos hay que elegir: - Hembras fértiles, buenas madres y con partos fáciles.
- No elevado valor genético.
- Buena salud. Que esté libre de enfermedades de declaración obligatoria.
- Buena condición corporal.
- Buena edad.
- Animal manejable.
- Número: Depende de los embriones obtenidos.
- Máximo de 24 horas de asincronía entre las donantes y las receptoras.
APLICACIÓN DE EMBRIONES Para implantar los embriones en las hembras receptoras, hay dos formas que dependen de la especie: - Quirúrgica: Oveja, cabra, cerda, coneja, perra y gata.
Se puede realizar una anestesia general (no muy usada) o local. Primero se realiza una palpación rectal para detectar el cuerpo lúteo. Se hace una incisión paralela a la última costilla, de unos 10 cm, en el lado donde está el ovario con el cuerpo lúteo. Se exterioriza el cuerno adyacente al ovario con el CL y se punciona. El embrión se introduce en la luz del cuerno con una cánula o pipeta.
- No quirúrgica: Vaca y yegua.
Se realiza anestesia local epidural, siendo la más usada. Se lava la zona y se hace una palpación rectal del cuerpo lúteo. Se introduce una pistola de inseminación con la pajuela con los embriones a través del cérvix, que sujetamos a través del recto, y se depositan en el cuerno uterino. Es un método muy rápido.
79 DIAGNÓSTICO DE GESTACIÓN Para comprobar que la hembra receptora queda gestante, se hace una ecografía y se vigila la gestación.
FACTORES DEL ÉXITO El éxito dependerá de: - Raza - Edad - Estación - Estrés - Condición corporal - Dieta - Salud - Programa de producción - Manejo hormonal - Número de embriones transferidos - Elección y cuidado de las receptoras 80 Reproducción y Obstetricia Biotecnologías Reproductivas Bloque II- Biotecnologías Reproductivas Tema 14- Micromanipulación de Embriones T. 14 MICROMANIPULACIÓN DE EMBRIONES Las técnicas de micromanipulación de embriones son una mezcla de reproducción asistida y biomolecular. Las diferentes tecnologías reproductivas, se pueden clasificar como: - 1ª Generación: Inseminación artificial y congelación de semen.
- 2ª Generación: Transferencia y congelación de embriones.
- 3ª Generación: Fecundación in vitro.
- 4ª Generación: Clonación.
- 5ª Generación: Transgénesis.
Los diferentes instrumentos para trabajar con embriones son: - Mantenimiento: Estufas con gases (CO2 y O2) y Tª.
- Manipulación: Material de sujeción y acción. Hay manipuladores o materiales específicos.
- Medios de cultivo: Con azúcares, sales, tampones, aminoácidos, ATB… Deben tener una osmolaridad de 280 mOsm y un pH 6’9 – 7.
- Soporte: Existen muchos tipos de placas válidos para los embriones.
CLONACIÓN Sirve para preservar animales de interés, y conseguir individuos genéticamente iguales mediante diferentes técnicas. Hay clones de casi todas las especies de interés, aunque de forma comercial solo hay en vacuno. De todas las técnicas que hay para la clonación, hay que tener en cuenta que ninguna conlleva el progreso genético, solo la preservación de los genes.
- Genética de élite en la población.
- Alimentación adecuada, con buenos niveles de I, Zn, Co, Mg y Se.
TÉCNICAS PARTICIÓN DEL EMBRIÓN Es la técnica más utilizada y la más rudimentaria. Se trabaja en medios sin proteínas, solo con solución salina, para conseguir que los embriones se peguen a la placa de cultivo y sea más fácil trabajar con ellos. También se usan medio hiperosmóticos con sacarosa que colapsan el embrión y también facilita el trabajo.
La técnica consiste en cortar, con ayuda de una pipeta, la mórula (blastocisto) en dos mitades, que se llamarán hemiembrión. Como los blastos en el hembra estarían en el cuerno uterino, ya no necesitan la pelúcida.
Si transferimos un hemiembrión, se consigue un 45 – 50% de preñez, mientras que si se transfieren las dos mitades, se suman, obteniendo un 90% de gestación. Recordar que al transferir un embrión entero se conseguía un 60% de gestación. También hay que tener en cuenta, que si el embrión ha sido congelado, el porcentaje desciende mucho. Hay otros factores que influyen en la tasa de gestación con esta técnica: - Calidad morfológica. Mejor los excelentes y buenos.
- Fase de segmentación. Mejor como blastocisto que como mórulas.
- Número de secciones. Es mejor dividir en 2. Ej.: Si hay 4 células, es mejor dividir el embrión en 2 (con 2 células cada mitad) que en 4 (con 1 célula cada mitad).
- Zona pelúcida. Da igual, aunque no la necesita.
- Sistema de cultivo. Es mejor colocarlo en una sección del oviducto cortado que en una placa.
- Hemiembriones transferidos. Cuantos más mejor.
- Preservación. La congelación disminuye en un 20% la tasa de gestación.
- Sexo. Se pierden más los embriones hembra, por estadística.
SEPARACIÓN DE BLASTÓMEROS Se usan embriones en estadios tempranos, con 2 – 4 – 8 células, antes de la activación del genoma. Primero hay que eliminar la zona pelúcida y separar las células en medios sin Ca, Mg ni proteínas para que no se activen. Es mejor dividir cada dos células (si es de 4, hacer 2 divisiones; si es de 8, hacer 2 o 4 divisiones; no dejar una célula sola).
Una vez separadas las células, se introducen en una zona pelúcida, obtenida del oviducto de una donante.
Durante su estancia real en el oviducto, si no tienen pelúcida se activarían y se implantaría en el oviducto, teniendo complicaciones en el desarrollo o muerte embrionaria. Hasta que no los ponemos en la zona pelúcida no deben activarse.
81 TRANSFERENCIA NUCLEAR Es la técnica más reciente y se puede utilizar cualquier tipo celular como donante para obtener todos los clones que queramos. Las fases son: 1. Núcleo donante: Se extrae el núcleo de la célula, que puede ser de cualquier tipo: Blastómeras, células MCI (masa celular interna), células somáticas fetales, células adultas… Es más fácil con adultas.
2. Citoplasma receptor: Le quitamos el núcleo a un ovocito II o maduro para poder implantar el núcleo donante.
3. Inyectar en espacio perivitelino: Implantamos el núcleo donante en el espacio que queda entre la membrana pelúcida y el citoplasma del ovocito II.
4. Fusión de membranas: Rompemos la membrana pelúcida con una aguja y, mediante descargas eléctricas, hacemos que se fusione, dejando el núcleo donante en el interior.
5. Activación: El núcleo comienza a trabajar.
FACTORES QUE INFLUYEN EN LOS RESULTADOS Con estas técnicas, se consigue un 40% de formación de blastos y, de todos estos blastos transferidos a las receptoras, un 40% llegarán a desarrollarse como embrión. De este último 40%, un 10% tendrán gestación y de los animales nacidos, un 50% mueren.
Los factores que influyen en estos resultados son: - Calidad del citoplasma receptor. Estado, cantidad, edad… - Tipo y estado de la célula donante.
Los clones generan placentas defectuosas, no normales, aunque los fetos sí que son normales.
ECLOSIÓN ASISTIDA Si los embriones tienen una zona pelúcida muy gruesa no podrán implantarse porque no podrán desprenderse de ella. Para romperla, se añade poco a poco medios ácidos para disolverla o se perfora con láser o una aguja.
SEXAJE Y GENOTIPADO Se realiza con embriones in vitro y se hace mediante una biopsia embrionaria, que puede ser por aspiración o división mecánica. Esto se utiliza ya que hay numerosas enfermedades ligadas al sexo, que se diagnostican con diversas técnicas, como citogenética, diferencias metabólicas, FISH o PCR.
Se pueden hacer dos tipos de sexado: - Sexado a posteriori: Identificar el sexo del embrión que ya tenemos para seleccionarlo.
Sexado a priori: Es el sexado de espermatozoides. Se separan los espermatozoides según tengan el cromosoma X o Y, ya que se diferencian en peso, tamaño…  Tinciones de fluorescencia: Es la herramienta más usada para sexar semen. Al observarlos, el espermatozoide con el cromosoma X se verá más grande y más intenso.
 Citometría de flujo: Se marcan los espermatozoides que tengan un gen o proteína concretos del sexo buscado.
 Gradiente de albúmina: Busca los Y.
 Gradiente de Percoll: Busca los X.
 Antígeno HY, de los Y.
82 Reproducción y Obstetricia Biotecnologías Reproductivas Bloque II- Biotecnologías Reproductivas Tema 14- Micromanipulación de Embriones TRANSGÉNESIS Un transgénico es aquel animal donde se ha modificado su material genético de manera intencionada por el hombre. Se puede hacer de dos maneras: - Knock out: Anular o eliminar parte de su propio material genético que no interese.
- Knock in: Introducir genes de nuestro interés.
Tiene una baja tasa de éxito, por lo que cuando se consigue un animal transgénico aceptable se clona.
TÉCNICAS - Inyección pronuclear. Se introduce el gen de interés en un pronúcleo antes de que se fusionen tras la fecundación. Esta técnica tiene baja eficiencia, siendo menor del 1% en animales de granja y entorno al 3% en ratones.
Transferencia nuclear.
- Células madre embrionarias. Se coge el gen de interés de una célula madre embrionaria y se introduce - como vector en otra para ser cultivadas.
- Virus como vectores de genes. Se introduce un virus con el gen de interés para que, al replicarse, lo inserte en el genoma del animal. Es la técnica más eficiente (3 – 35%) y se usan dos tipos de virus:  Adenovirus: Virus DNA que no se integra en el genoma del animal.
 Retrovirus: Virus RNA que se integra en el genoma del animal.
Las limitaciones de esta técnica son:  Embrión en desarrollo.
 Límite del tamaño del gen menor a 8 Kpb.
 Problemática de trabajar con virus, bioseguridad.
- Transgénesis mediada por espermatozoides. Es una técnica muy sencilla y permite la IA, aunque tiene baja repetibilidad y rendimiento.
APLICACIONES - Aplicaciones biomédicas para salud humana: Conseguir biofármacos, biomoléculas, xenotransplantes y estudio de enfermedades humanas, leche maternizada, gatos antialérgicos… - Mejora de la producción: Crecimiento, resistencia a enfermedades, producción lechera, conformación… PRESERVACIÓN - CONGELACIÓN La congelación de embriones se debe realizar a -196º C. Aun así, es muy fácil que sufran crioinjurias, ya que es un proceso muy agresivo para el embrión, como son: - Formación de hielo en su interior.
- Cambios de volumen.
- Toxicidad por los crioprotectores.
- Alteración de membranas.
- Desnaturalización de proteínas.
Las bases para que estas alteraciones no ocurran son: - Proteger del descenso de Tª.
- Proteger de la formación de cristales.
- Proteger de la deshidratación y toxicidad.
Para ello, se usan medios de congelación con solución tamponada que regule el pH, proteínas o macromoléculas y crioprotectores. Hay dos tipos de medios utilizados: - Permeables: DMSO, EG, PG… Reemplazan el agua intracelular y minimizan la cristalización.
- No permeables: Glucosa, sucrosa, galactosa… Promueven la deshidratación y disminuyen la formación de cristales.
83 SISTEMAS DE PRESERVACIÓN - Congelación lenta: Es el descenso paulatino de la Tª, lo que se llaman rampas de congelación, y son específicas para cada especie. Primero se hace una exposición a los crioprotectores en concentración máxima de 2M y luego se cargan los embriones en la pajuela de 0’25 ml. En el centro de la pajuela quedará el embrión con el crioprotector, rodeado de medio PBS. El enfriamiento tiene lugar en varias fases generales:  Enfriamiento inicial a -7º C.
 Seeding, contacto con el metal frío.
 Descenso térmico lento hasta -30º C, bajando la Tª a un ritmo de -0’3 – -0’5º C/min.
 Descenso térmico rápido con LN2 o nitrógeno líquido.
- Congelación rápida o Vitrificación: Es el descenso ultrarrápido de la Tª, con crioprotectores en altas concentraciones y un soporte para la muestra de bajo volumen. Los pasos son:  Exposición de la muestra a los crioprotectores.
 Envasado o carga de la muestra, que pueden ser en OPS, microgotas o Cryoloops.
 Descenso ultrarrápido de la muestra. Si los ponemos en microgotas, bajamos a un ritmo de 2.500º C/min, y si los ponemos en OPS, bajamos a 25.000º C/min.
DESCONGELACIÓN Se puede realizar de dos formas: - Aumento de Tª muy rápido: Hasta los 37º C en 21 segundos.
- Paso por soluciones con osmolaridad decreciente. 3M – 1’5M – 0’5M.
Mientras se descongela la muestra, hay que ir evaluando la evolución del embrión: - Reexpansión del blastocele.
- Posibles alteraciones celulares.
- Número de células.
- Morfología.
- Metabolismo.
84 ...

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