Tema 8 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 11
Fecha de subida 27/05/2016
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Biología Molecular 2º NyN Tema 8: Clonaje Clonaje Creación de una nueva molécula de DNA, conocida como DNA recombinante.
Por otro lado, la clonación consiste en crear individuos nuevos.
Para clonar el DNA (clonaje) partimos de:   DNA vector: Molécula que facilitará el clonaje (ej. plásmido).
Fragmento de interés: DNA que queremos clonar. Se obtiene por PCR. Es importante que no sea cortado por el polylinker. Para el DNA genómico o mRNA, se amplifica el fragmento de interés y después se recombina.
Combinando ambos se consigue el DNA recombinante. Cada proceso de clonaje es específico para cada pareja de DNA vector y fragmento de interés.
El proceso de clonaje se facilita con sitios únicos de reconocimiento y corte para enzimas de restricción tipo II presentes en el DNA vector. Se agrupan en el sitio múltiple de clonaje o polylinker.
Pasos del clonaje Obtención de DNA Se obtiene DNA puro del vector y del fragmento de interés, mediante purificación, PCR y digestión.
Digestión del DNA Se digieren el vector y el fragmento con enzimas de restricción. Esto permite distinguir entre clonaje:   Direccional (preferible): Se emplean dos enzimas de restricción cuyos sitios de corte no son compatibles garantizando la direccionalidad. Pueden ser dos extremos cohesivos o uno cohesivo y otro romo. Los sitios de restricción de extremos cohesivos facilitan funcionamiento de la ligasa (aparean por complementariedad de bases).
Adireccional: Una sola enzima de restricción, el fragmento se inserta en cualquiera de las dos direcciones. De extremos romos o acabados en adenina 3’, A3’.
Generación de extremos romos Pueden generarse rellenando extremos 5’ protruyentes: Biología Molecular 2º NyN O degradando extremos 3’ protruyentes: Unión de fragmentos de DNA Se emplea la DNA ligasa, más eficiente en extremos cohesivos. Cataliza formación de enlaces fosfodiéster y requiere extremos con fosfato 5’ y ATP.
Introducción de DNA en célula hospedero formar clones Importante que tengan origen de replicación adecuado para la célula destino y un marcador de selección.
Crecimiento de células transformadas para formar clones Selección de clones recombinantes Es importante distinguirlas de, por ejemplo, aquellas que hayan formado vector religado.
Vectores Todos los vectores deben tener tres partes:    Origen de replicación.
Marcador de selección, da propiedad distintiva a las células que lo incorporan, para seleccionarlas (como resistencia a antibióticos).
Sitios de restricción (únicos).
Aparte, otras características deseadas:     Elevado número de copias, aumenta el rendimiento en la purificación.
Origen de replicación viral para preparar ssDNA (M13). Útil en mutagénesis dirigida.
Polylinker complejo. Mayor número de enzimas, más sencillo encontrar la pareja apropiada.
Promotor para síntesis proteica o de mRNA. Imprescindible si se desea expresar proteínas.
Biología Molecular 2º NyN   Posiciones definidas para primers de PCR y/o secuenciación. Útil para saber si clonaje es correcto y para subclonaje (paso de un vector a otro).
Marcador para la selección de recombinantes y otras aplicaciones (TAG). TAG sirven para facilitar la purificación y purificación de proteínas expresadas de forma recombinante.
Tipos de vectores Su elección depende de la medida del producto a clonar.
Plásmidos Son los más comunes, versátiles y fáciles de utilizar. Aceptan hasta 15kb de DNA exógeno.
Moléculas circulares de dsDNA. Entre 2 y 500 copias.
Se trata de moléculas pequeñas de DNA (2-10kb). Regulan la replicación de manera independiente al cromosoma bacteriano. Los que poseen el factor F pueden realizar conjugación bacteriana.
La replicación del plásmido está regulada por su propio origen de replicación. De este dependen las copias que habrá por célula y el grupo de incompatibilidad plasmídica. Éste depende del sistema de replicación del plásmido.
Dos plásmidos tienen la misma incompatibilidad plasmídica si tienen el mismo origen de replicación o se regulan igual. Si posee 2 plásmidos, A y B, la suma de ambos tendrá que igualar al número de copias inicial, sin importar la proporción entre ambos. La célula tenderá a contener sólo 1 tipo de plásmido.
Si son de diferentes grupos de incompatibilidad (son compatibles), se regularán por separando, perpetuando el mismo número de cada uno en la colonia.
Existen diferentes tipos de plásmidos: Vectores de clonaje Biología Molecular 2º NyN El más general, todos aquellos vectores con sitios de restricción únicos disponibles para clonar.
Un ejemplo es el del pGEM-T, vectores T (estrictamente de clonaje). Un par de T’s como ss, para así clonar directamente productos de PCR con una A sin aparear, manipulando sin acción enzimática. Finalmente, se extrae y subclona en otro vector.
Vectores de expresión Diseñados para síntesis proteica. Tienen un cassete de expresión con:     Promotor.
Sitio de unión a ribosoma (RBS).
Sitio múltiple de clonaje.
Terminador 3’UTR.
El sitio de unión al ribosoma es el encargado de unir el mRNA a la subunidad pequeña del ribosoma (16S). Se ha de clonar tras RBS o no se expresará la proteína.
Vectores lanzadera (shuttle) Diseñado para replicarse y expresar genes en 2 organismos diferentes, evitando el subclonaje.
Las manipulaciones de DNA se hacen en bacteria, pero se acaba trabajando en otros organismos.
Para ello, tienen 2 orígenes de replicación. Para poder trabajar en las dos especies necesitamos marcadores de selección que trabajen en ambas o más de un marcador.
Bacteriófagos Complejos de ácido nucleico y proteína (virus específicos de bacteria). Existen muchas familias diferentes. Tienen dos ciclos de vida diferentes (el λ lleva a cabo ambos): lítico, lleva a la lisis de la bacteria (copia masiva de material genómico para crear nuevos virus); lisogénico, que lleva a la integración del genoma en la bacteria.
Los más usados son: Bacteriófago λ Cadena doble y lineal de aproximadamente 49 kb. Útil en clonaje, expresión y genotecas.
El tamaño limita lo que queremos clonar. En su ciclo de vida lítico puede observarse un halo de lisis, del que se pueden recuperar los virus para infectar a otras células.
El genoma incluye información para: Biología Molecular 2º NyN    Cápside.
Zona no esencial. Esta se elimina para construir los vectores de clonaje Genes asociados al ciclo de la vida, que regulan también la replicación.
En los extremos de la zona no esencial están los sitios cos. Éstos son procesados por enzimas específicas. Dejan bases en sus extremos de forma que se podrá recircularizar el genoma del virus.
De este bacteriófago pueden derivar:   Vectores de inserción: Tienen eliminada la zona no esencial y tienen sitios de restricción donde se insertará el fragmento de DNA deseado. El tamaño final ha de ser entre un 75% y un 110% del original, se usa más en fragmentos pequeños.
Vectores de reemplazamiento: tienen la zona no esencial flanqueada por sitios de restricción a cada lado, que contienen al stuffer. Este se elimina y es reemplazado por el DNA nuevo, quedando de longitud similar.
M13 ssDNA circular, alrededor de 6,4 kb. Se emplea en secuenciación, mutagénesis dirigida y phage display.
Cósmidos Plásmidos híbridos (entre plásmido y bacteriófago) que tienen los sitios Cos del bacteriófago λ permitiendo el empaquetamiento in vitro. Tienen problemas de estabilidad y permiten pocas copias por célula debido a su gran tamaño.
El vector puede ponerse en extracto de proteínas del bacteriófago λ. Se replica y corta, introduciéndolo entre sitios Cos, y después se empaqueta en cápsides como el bacteriófago, pero se manipula in vitro como los plásmidos.
Biología Molecular 2º NyN 1.
2.
3.
Fagémidos Vector híbrido entre fago M13 y plásmido. Tiene un origen de replicación plasmídico y otro viral, de fago.
Cromosomas artificiales bacterianos (BACs) Permite hacer insertos de muy elevado tamaño (100-300kb). Se utiliza para hacer los clones de secuenciación del genoma humano. Es circular y de doble cadena.
Tienen:    Un origen de replicación bacteriano.
Gen de resistencia.
Genes par (de partición) que aseguran la distribución estable de los plásmidos en la célula y las células hijas, así al menos una copia quedará en la célula. Vienen del factor F. Habrá pocas copias.
Por su tamaño elevado, la transformación se realiza por electroporación. La selección se hace introduciendo genes de resistencia a antibiótico, y mediante blancos positivos (recombinantes) y azules negativos (no recombinantes).
Cromosomas artificiales de levaduras (YACs) Tienen una estabilidad similar a los cromosomas celulares, siempre que tengan insertos mayores a 150kb. Tienen forma circular.
Biología Molecular 2º NyN Incorpora:     1 centrómero.
1 origen de replicación de levaduras que se propaga mientras es plásmido.
2 marcadores de selección X e Y. No son genes de resistencia a antibióticos sino de ausotrofía (síntesis de aminoácidos o bases nitrogenadas). El gen mutado se incorpora, la célula no sintetiza las moléculas y muere.
2 telómeros Se parte de un plásmido que se digiere con BamHI, dándole la forma cromosomal, quedando telómeros en los extremos. La EcoRI digiere la molécula y crea dos brazos, cada uno con un telómero y un marcador de selección, y se liga el fragmento deseado, uniendo ambos. Finalmente, se seleccionan clones con las 2 regiones del vector (marcadores y telómeros adecuados), degradando el resto de organismos.
Organismos hospedero Hay bastantes organismos que se utilizan como hospederos:      Escherichia coli: El hospedero estándar. Fácil y rápido de crecer, es barato y fácil de transformar. Las cepas son prácticamente inocuas (poco peligrosas). Además, poseen sistemas de regulación génica, existen muchas cepas disponibles con mutaciones y pueden usarse como plásmidos y como bacteriófagos.
Otras bacterias (Bacillus subtilis, Streptomyces sp…) Levadura (Saccharomyces cereviside): Eucariota unicelular.
Células de insectos, animales y de plantas en cultivo.
Animales y plantas.
El procedimiento se vuelve más difícil al bajar en la lista.
Introducción del DNA en la célula hospedero Transformación, conjugación y transducción pueden darse de forma natural y artificial.
Electroporación y transfección sólo de forma artificial.
Transformación DNA exógeno entra a través de la membrana a una célula competente.
Para obtener células competentes, las células se lavan con tampones con cationes divalentes (CaCl2). Se logra así permeabilidad en la membrana, y entra el DNA bacteriano. El proceso se Biología Molecular 2º NyN realiza en la fase exponencial de crecimiento, o las células mueren. Las células transformadas pueden preservarse en glicerol.
Pueden conseguirse 106-107 células/μg DNA.
Tras incubar con DNA, se realiza un choque térmico, pasando de hielo a 42 ºC, lo que provoca la entrada de DNA a la célula. Posteriormente se vuelve a poner en hielo y se añade el medio de cultivo.
Conjugación Depende de la presencia del factor F (de fertilidad). Tiene proteínas que inducen la formación un puente de conjugación entre bacterias donde pasará una copia del plásmido. Posee además genes par. Finalmente, tendremos dos bacterias con el plásmido F.
El factor F podrá integrarse en el cromosoma de la célula de destino.
Transducción Proceso mediante el cual se transfiere el DNA de una bacteria a otra mediante un virus.
Una vez infectada, la célula liberará más virus, algunos de los cuales habrán incorporado parte del DNA de la célula huésped. Entonces, cuando infecten otra célula, transferirán parte del DNA de la anterior. Si los 2 DNA’s son parecidos, podrá darse recombinación, incorporándose en el DNA de la segunda célula.
Biología Molecular 2º NyN Electroporación Inducción de poros en la membrana por pulso eléctrico para introducir DNA. Se puede aplicar a todo tipo de células. La célula se lava en un tampón de agua estéril y glicerol para limpiarla de los medios de cultivo y de la sales, que podrían provocar un arco eléctrico.
La frecuencia de transformación es muy (108-1010 células/ɥg DNA). Podemos introducir moléculas de DNA muy grandes (ej: BACs). El electroporador es caro, y las cubetas empleadas son de un solo uso y precio elevado.
Transfección Introducción del DNA exógeno en una célula eucariota por método no viral. Hay bastantes métodos:       Liposomas: vesículas de fosfolípidos que contienen el DNA.
Dendrímeros.
Endocitosis de complejos DNA-DEADE dextrana.
Fosfato de calcio: produce el precipitado que se incorpora en la célula.
Gen gun: dispara nanopartículas de Au que portan DNA.
Microinyección: una aguja inserta el DNA en el citoplasma o en el núcleo.
Identificación de los recombinantes Primero se seleccionan las colonias que puedan ser recombinantes, luego se realiza la secuenciación, que identifica qué colonias poseen fragmentos idénticos al deseado.
Selección de colonias recombinantes Existen métodos:    Vector-específicos.
Fragmento-específicos.
Universales.
Indican qué colonia contiene molécula de DNA con vector y fragmento insertado pero no garantizan que el fragmento clonado sea 100% correcto a nivel de secuencia nucleotídica, por lo que es necesaria la secuenciación.
Inactivación insercional Es un método dependiente del vector. Se usa en vectores con más de un marcador de selección (2 genes de resistencia a antibióticos), pues ha de quedar 1 sin inactivar para diferenciar colonias sin vector de las demás.
Se clona en algunos de los sitios de restricción de los genes de resistencia al antibiótico. Parte de las colonias se ponen en medio con Biología Molecular 2º NyN ampicidina, y otras en medio con tetraciclina. El vector religado sobrevivirá en ambos. En cambio, las colonias de vector recombinante solo sobrevivirán en uno de ellos (según dónde se coloque el inserto).
α-complementación El vector permite identificación por blancas y azules. (Muchos vectores contienen fragmentos necesarios.) El vector tiene una zona de clonaje, en la que posee un fragmento α o n-ter de la βgalactosidasa. El fragmento α se complementa con un fragmento ω, haciendo que la βgalactosidasa se vuelva funcional.
La β-galactosidasa degrada entonces el sustrato (X-gal), produciendo un color azul.
Si en cambio, dentro del fragmento α se inserta un trozo, dejará de ser funcional, no se asociará con el fragmento ω y no se degradará la X-gal, quedando la colonia de color blanco. Así:   Blanco = colonias recombinantes.
Azul = colonias no recombinantes.
Análisis mediante restricción y electroforesis Es válido para todos los clonajes.
El vector religado puede ser digerido con 1 sola enzima. El clonaje no será direccional y existirán dos variantes, según colocación del fragmento. La enzima de restricción, S, cortará en un punto conocido del fragmento.
   M es marcador.
Vector: o U es sin digerir (uncut). Aparecen 2 bandas debido a las conformaciones posibles del plásmido.
o E es digerido con la enzima. Una banda que da la talla del vector.
Recombinantes: o U es algo más grande, posee el inserto.
o E, digerido con enzima. Aparecen una banda del vector y otra del inserto.
o H/S sirve para determinar la dirección del inserto.
Biología Molecular 2º NyN Otros métodos Técnicas de hibridación, PCR, Función proteica, anticuerpos específicos… Librerías genómicas Colección de clones que incluyen todo el DNA genómico de una especie.
Útil en identificación y clonaje de secuencias específicas y proyectos de high-throughput (proyectos genoma).
El número de clones necesarios para incluir todo el DNA genómica de una especie en una determinada librería depende del tamaño del genoma.
N =ln(1-P)/ln(1-i/g) Donde:  N = número clones necesarios para obtener un valor de probabilidad (P) de clonar una secuencia en particular.
 i = tamaño del inserto.
 g = tamaño del genoma Fragmentación Enzima de restricción que reconoce 4 bases corta el DNA en fragmentos de 256 bp de tamaño medio. Se hace una digestión parcial, con poca cantidad de enzima, de modo que no se digieren todos los sitios de reconocimiento.
Selección de los fragmentos de DNA por electroforesis Se purifica la zona del DNA de interés y se une al vector cortado para hacer un clon.
Se realiza la electroforesis, observando bandas a diferentes tallas porque el DNA genómico está parcialmente cortado. Se puede así sacar el DNA de peso molecular deseado.
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