PROCARIOTES - 3 - La transcripció (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 23
Fecha de subida 01/11/2014
Descargas 17
Subido por

Vista previa del texto

TRANSCRIPCIÓ EN PROCARIOTES LA TRANSCRIPCIÓ EN BACTERIS 29/09/14 Recordem que en procariotes la transcripció i la traducció estan acoblades. Recordem que tenim el polisoma, que és el punt en el qual té lloc tant la transcripció com la traducció, tot allò que agrupa aquests dos conceptes. En el complex tindrem DNA, mRNA, ribosomes i polipèptids.
ESTRUCTURA DELS GENS BACTERIANS Tenim dues coses diferents, mRNA i DNA, que actuen de forma independent .
Si comparem el mRNA amb la regió que codifica pel nostre gen, veiem que mRNA té zones posteriors i anteriors al polipèptid pel qual el gen codifica (el mRNA és més llarg que el polipèptid obtingut posteriorment). Observant el mRNA trobem: - El primer codó de traducció rep el nom d’inici de traducció i correspon als nucleòtids AUG.
Tenim tres codons no codificants o codons stop: ambar (UAG), ocre (IAA) i sèpia (UGA). Els 3 fan la mateixa cosa, són redundants.
Tindrem la regió líder (davant el mRNA) i la regió tràiler (darrere el mRNA). Sobre la regió líder: s’anomena Ribosome Binding Side (regió d’unió del ribosoma) o seqüència Shine-Dalgarno (SD) =RBS.
El primer ribonucleòtid que generarà el mRNA correspondrà a l’inici de la transcripció. Aquest primer serà o una A o serà un G.
A dins del DNA, per cada gen, tindrem dues cadenes. La groga (5’3’) és la cadena codificant i té una seqüència igual al mRNA, però la RNA polimerasa no la usa. La taronja és la complementària al mRNA i és la cadena motlle (3’5’).
Molts gens són gens ORF – Open Reading Frame. Tots els ORFs són gens, però no tots els gens són ORFs.
ORF és una seqüència de triplets que codifica per un polipèptid. En un fragment de DNA existeixen 6 frames/marcs de lectura – en un fragment de DNA podem trobar 6 possibles marcs de lectura (un marc de lectura són els triplets que codifiquen per una proteïna). Per tant, tenim 6 maneres de llegir ho, però un ORF és aquell marc de lectura que té una longitud determinada sense tenir stops. És a dir, dels 6 marcs només hi ha un que valgui.
Com considerem què és un ORF? En reconeixem un quan tenim uns codons encadenats que codifiquen per AA i que en una determinada longitud no hi ha cap stop. Si llegeixes i al cap de 2 AA hi ha un stop, no codifica per cap polipèptid. Necessites una longitud determinada per codificar per una proteïna.
Si la lectura és a l’atzar, trobaràs stops de forma reiterada. Si no és a l’atzar, pots trobar-te 400 triplets sense cap stop. No pue ser. * Els marcs estan en el RNA però la cadena codificant és equivalent al mRNA. Per tant, saps quins són els 6 possibles marcs de lectura. Un únic mRNA té 3 possibles marcs.
En alguns virus, en un mateix fragment de DNA, s’usen els 6 frames o marcs de lectura. Llavors trobem múltiples gens codificats – el mateix serveix per 3 o 4 proteïnes diferents – compacta la informació tant que en funció dels marcs que usi produirà un producte gènic o un altre. Un mateix mRNA, en funció de l’inici de traducció que s’usi, pot donar lloc a diferents productes gènics.
:D 1/10/14 Dins els gens bacterians també trobem unes regions anomenades regions promotores. La regió promotora serà aquella regió coneguda per la RNA polimerasa, i es troba davant la regió codificant (però no estarà inclosa en el mRNA, almenys en la seva totalitat). En la regió promotora, trobem la regió -10 o TATAA box i la regió -35. Una estarà a 10 pb del 1r nucleòtid que es transcriu i l’altre estarà a 35 pb del 1r nucleòtid que es transcriu (el primer codó codificant). La regió -35 és la de reconeixement de la RNA polimerasa, mentre que la -10 és la regió d’unió de la polimerasa.
En la regió tràiler, trobem la regió terminadora i és la que permet aturar la RNA polimerasa :D UNITATS TRANSCRIPCIONALS En bacteris existeixen unitats transcripcionals. Les regions transcripcionals poden ser monocistròniques o policistròniques. En les mono només hi haurà codificada la informació d’un gen (el transcrit conté un únic ORF) i en les policistròniques hi haurà codificada la informació de més d’un gen (el transcrit conté més d’un ORF).
En policistrònics, els ORFs acostumen a tenir una relació funcional. Això vol dir que els gens que estan codificats en una mateixa unitat transcripcional solen estar relacionats entre ells, formant un operó (com l’operó lactosa) – tots els gens estan codificats en la mateixa unitat transcripcional, i tots ells estan relacionats entre ells a nivell funcional. També ens trobem gens que formen part d’una mateixa unitat transcripcional i que aparentment no estan relacionats entre ells.
Llavors quina és la diferència? La presència de diferents RBS dins d’una unitat policistrònica.
A nivell de DNA, en una unitat policistrònica, veiem un únic promotor i més d’un gen codificant al seu costat (cadascun dels gens o cistrons tindrà el seu codó ATG d’inici a més del seu codó STOP). Al final de l’operó trobarem la regió terminadora. Des del mateix promotor s’obtindran del tirón tota una unitat transcripcional (3 cistrons, 3 gens codificats en el mateix mRNA).
Al loro! Que tinguem 3 gens junts no vol dir que tinguem una proteïna de fusió – això donarà lloc a 3 productes gènics separats. Tindrem el DNA, el mRNA, el gen1, el gen2 i el gen3 i el promotor, i obtindrem 3 proteïnes diferents. * Tenim 3 productes gènics (i per tant 3 senyals d’stop i 3 senyals d’inici de traducció), i també tindrem 3 RBS per poder obtenir els diferents productes gènics que codifica tot l’operó – el ribosoma ha de saber com llegir aquell mRNA, i qui posa el ribosoma al seu lloc són els RBS.
Recordem que un mateix mRNA pot tenir 3 marcs de lectura diferents. Quin és el frame que ha de llegir el ribosoma? El que li indica el RBS – és qui ancora el ribosoma i li marca la pauta de lectura per entendre el que s’està dient en aquell gen.
Davant de cada codó d’inici tindrem un RBS que permetrà l’ancoratge del ribosoma, seguit de l’inici de traducció, final de traducció i separació del ribosoma que es tornarà a ancorar al següent RBS – això permetrà tenir la discontinuïtat entre les senyals de cada un d’aquells gens.
Possible reinici de la traducció d’un mRNA policistrònic.
EFECTE POLAR Recordem que la traducció i la transcripció estan acoblades en procariotes. Això vol dir que: * Explicació dibuix: Tenim un DNA. Tenim una regió promotora. La RNA polimerasa s’ancora.
Comença a transcriure. El primer que passa és que la RNA pol avança cap a la dreta. Aquesta RNA polimerasa genera un mRNA. Avança una mica més i tenim més mRNA. Al final, el que tenim és el mRNA suelto, el DNA i la RNA pol que se’n va. Però aquest acoblament significa que en el moment en que surt el mRNA i ens queda un RBS accessible, aquest és reconegut per un ribosoma i aquest avança per la cadena traduint el producte gènic (això és el que anomenem polisoma). Això vol dir que des del moment en que surt a la llum el RBS ja comença la traducció. És per això que la posició dels gens d’un operó importa, ja que el primer dels gens es traduirà més cops que els altres. Per què? Quan ja estem traduint el primer del gens, encara no tenim accessible ni el RBS del 2n gen ni del 3r gen.
Llavors al final tenim la mateixa quantitat de tot? NO. Quan el ribosoma arriba al stop es desacobla, però els altres continuen anant cap al RBS d’aquest primer gen – està més estona exposat a ribosomes el 1r RBS que els demés. El ribosoma s’enganxa al RBS del primer gen i el tradueix fins a l’stop, mentre que en els altres encara no tenen fet el mRNA; per això el primer gen es tradueix més cops que els altres. Llavors s’aniran enganxant més ribosomes i aniran avançant per la cadena de mRNA.
La quantitat relativa de producte gènic que tindrem al final de tot quan el mRNA sigui degradat no serà igual per cada gen. Això s’anomena efecte polar.
A més, el ribosoma que està traduint el 1r gen, mentre no arriba a l’stop pot tapar els RBSs de més endavant degut a la seva gran envergadura, de manera que només els deixa accessibles quan es desenganxa (és un moment de no res que els tapa però ja és algo). És a dir, que els altres RBS surten a la llum més tard i a més estan ocults pels ribosomes durant uns moments.
A més, els mRNAs es comencen a degradar per l’extrem 3’ per controlar l’expressió gènica; és a dir, comença la degradació per l’últim cistró, cosa que també contribueix a que els gens del principi es tradueixin més cops.
Per tant, és important el posicionament dels gens? SÍ.
Els ribosomes també ajuden a desfer les estructures secundàries que puguin haver en el mRNA. El RNA és una cadena única, per tant regions palindròmiques (complementàries entre sí) poden generar bucles entre sí (s’estableixen ponts d’hidrogen, es plega la cadena i trobem trossos de RNA de doble cadena). El ribosoma desfà en el seu avanç aquestes petites regions de doble cadena, van desplegant l’mRNA.
La presència de ribosomes també protegeix de ribonucleases – les mutacions que provoquin que s’acabi la traducció de forma temprana faciliten l’acció d’aquests enzims que degraden el mRNA.
Com contribueix això a l’efecte polar? En un moment determinat la RNA polimerasa podria deixar anar el mRNA abans que tots els ribosomes avancin – tindríem un tros lliure que es podria plegar. En aquestes zones s’evita que s’uneixin ribosomes (mecanismes de seguretat).
La única manera, doncs, de traduir cistrons, és que els ribosomes estirin el mRNA perquè els RBS estiguin a la vista. Així s’evita que aquests bucles de mRNA emmascarin els RBSs, i aíxi es contribueix a l’efecte polar sobre la traducció (el ribosoma només s’uneix a DNA de cadena senzilla).
Per tant, en una unitat policistrònica et pots trobar el ATG, el codó STOP (indica el fi de la traducció del primer cistró), la regió del RBS i l’ATG del següent cistró. La distància entre tots ells és relativa. El cas de la imatge següent és el normal. A la dreta tenim la seqüència de DNA corresponent a la regió gènica de l’esquerra.
Però a vegades el codó STOP i la regió RBS estan solapades.
Altres vegades, el RBS se situa abans del codó STOP.
Inclús ens podem trobar que el codó d’inici del segon gen es troba situat abans del codó stop del primer gen.
Això vol dir que el gen no és funcional? NO. Quan el ribosoma està unit i va avançant no es fixa en els RBSs, no llegeix regions d’unió, ell continua i només li importa l’STOP. Es desenganxarà en el triplet STOP, i tornarà enrere per enganxar-se al RBS que just ha passat. Si el marc de lectura és diferent, l’STOP no importa. El que passa és que quan les dues subunitats s’acoblen de nou, es carrega un tRNA que té una metionina, i això es va movent fins trobar l’ATG. Per tant, quan s’acaba d’ancorar al RBS, el que està buscant és on està l’ATG – no importa quina és la seqüència, només busca automàticament un triplet d’inici, IGNORANT els codons STOP (busca el verd, per tant li és igual que hi hagi un vermell por ahi, ell porta carregat un tRNA que codifica per la metionina, que és la manera d’acoblar-se, per tant fins que no arribi a la metionina no iniciarà la traducció. Per tant, com no inicia la traducció no està llegint res, simplement ubica el tRNA sobre la metionina.
També ens podem trobar gens que estan solapats l’un amb l’altre – el ATG del segon gen i el STOP del primer gen solapats, la codificació està solapada l’una amb l’altre. En aquests casos, sí que el marc de lectura és essencial – si en el mateix marc tenim un STOP, no funcionaria.
* Això té un ergo. El RBS marca el marc de lectura amb que es llegeix un mRNA, per tant els gens que estan codificats en una mateixa unitat policistrònica poden trobar-se en marcs de lectura diferents. És a dir, el RBS és qui col·loca el ribosoma, el que el fa llegir en una pauta concreta, i cada un els gens pot estar codificat dins un mateix mRNA en marcs de lectura diferents. Però recordem que llegim un mateix mRNA amb 3 marcs de lectura (mai en 6 – la direcció del RBS sempre és la mateixa).
MUTACIONS POLARS El RBS no és més que una seqüència d’ancoratge del ribosoma – és una seqüència que és reconeguda pel ribosoma i a la qual el ribosoma hi té afinitat. Com a tal, les seqüències del RBS poden ser millors o pitjors. És a dir; com és una regió i és una qüestió d’afinitat, contra més òptima sigui aquella regió, més potent és el RBS. I lo mismo al revés (menys òptima, pitjor s’uneix el ribosoma). Això fa que l’efecte polar d’una unitat transcripcional es pot modular jugant amb les afinitats del RBS.
Si tu tens un mRNA i en aquest tens 3 RBS, i els 3 tenen la mateixa afinitat, l’efecte polar és un (el que sigui) i tindràs molt del gen 1, menys del 2 i encara menys del 3. Però la cèl·lula pot matisar aquest efecte polar jugant amb les afinitats relatives de les seqüències dels RBSs – si fas que un RBS sigui lo millor de lo millor, tots els ribosomes aniran a per ell; si l’altre RBS (el del segon gen) és molt dolent, la diferència de producte gènic obtingut entre els dos gens no serà tan gran, perquè no tots els ribosomes que surten del 1 aniran cap allà perquè l’afinitat no serà tan bona. * Una mutació polar és aquella que està produïda en un punt determinat i que pot afectar a gens colindants a aquella localització (efecte fenotípic sobre gens que estan més avall).
 Tenim un mRNA i 3 cistrons diferents en plena traducció (en el cas de la imatge és l’operó lactosa). En verd, els productes gènics. Cada gen te el seu propi RBS i codó AUG. Es dóna una mutació sense sentit en un punt (nonsense allele – s’incorpora un codó stop en una seqüència codificant). Els ribosomes arriben a aquest stop, es desacoblen i no continuen produint tota la proteïna. Això pot tenir un efecte polar sobre la traducció dels altres gens, perquè si el ribosoma es desenganxa, dificulta que l’altre ribosoma s’enganxi al següent RBS, perquè poden haver estructures secundàries que ocultin el RBS dels altres gens, de manera que això pot produir una disminució dels gens situats més avall (incrementa l’efecte polar). Com veiem, una mutació en un punt afecta a gens situats més avall.
PROMOTORS BACTERIANS 6/10/14 En procariotes, l’inici de la transcripció és més senzill que en eucariotes – la RNA polimerasa reconeix promotors sense necessitat d’altres coses acoblades (en eucariotes són necessaris els factors de transcripció).
ESTRUCTURA DELS PROMOTORS BACTERIANS Tenim dues regions importants: la regió -10 (TATAA, regió d’ancoratge de la RNA polimerasa) i la regió -35 (regió de reconeixement, la RNA polimerasa la reconeix i llavors sap que la -10 està a prop).
Aquestes seqüències són les regions consens – són les seqüències que surten de mirar tots els promotors que tenim en una cèl·lula i veure a cada posició quin nucleòtid és més probable que hi hagi. Però no totes les regions -35 seran així, simplement són les seqüències més probables a trobar.
La regió consens no té perquè ser la regió òptima de reconeixement, però és la “mitjana” entre totes. Per tant, tindrem els promotors forts i els promotors febles. Simplement variant les regions d’ancoratge i reconeixement, podem fer que hi hagi una regió promotora molt bona (la RNA polimerasa s’hi enganxa perfectament) però també poden haver-hi de no tan bones. Això afectarà a la transcripció – els promotors forts es transcriuran moltíssim (la probabilitat de ser reconeguts és molt major que en els febles, ja que la constant d’afinitat de la RNA polimerasa per aquests promotors és molt alta). Aquesta és una manera de controlar l’expressió gènica – a nivell evolutiu, controles quin gen t’interessa que s’expressi molt i quin que s’expressi poc.
Totes les espècies bacterianes tenen les seqüències consens -35 i -10? No. Cada microorganisme, en funció de la seva RNA polimerasa, del seu DNA, etc., haurà adaptat les seves seqüències a la seva situació. Un dels factors més importants és la riquesa en GC – la regió o caixa TATAA pot arribar a esdevenir TAGGCT si un bitxo que té un alt contingut en GC i baix en TA (exemple en Pseudomones). Un altre factor que també afecta és la distància o posició relativa dels promotors respecte el +1 – que la regió -35 no estigui exactament a 35 pb del +1 també afecta a la força del promotor.
La RNA polimerasa és una proteïna bastant conservada entre microorganismes. Els promotors que són forts en un microorganisme, en canviar-los de microorganisme, poden passar de ser molt òptims a més febles pel canvi d’entorn, però seguirà sent un promotor tot i que tingui una taxa de transcripció més baixa. Tot i això hi ha promotors molt específics que només treballen com a tals en ambients molt específics.
REGIÓ PROMOTORA EN BACTERIS Pot existir més d’un promotor en la mateixa regió gènica. Això incrementa els mecanismes de regulació i modulació de l’expressió gènica: - A. Trobem gens (unitats transcripcionals, tant mono com poli) que s’expressen a partir de dos promotors diferents, i que depèn de les condicions quin dels dos funcioni.
Parlem de promotors continus.
- B. També ens podem trobar més d’un promotor controlant un mRNA però que estiguin solapats. Llavors només pot funcionar un dels dos (són excloents) – la RNA només reconeix un dels dos ja que la regió -35 queda oculta.
- C. També podem trobar-nos promotors enfrontats. Si expressem un, l’altre queda silenciat. * - D. També poden estar oposats. Quan reconeixem un no reconeixem l’altre.
- E. També podem trobar-nos promotors que generin productes diferents. Ens trobem amb promotors que expressen una unitat transcripcional policistrònica i promotors que estan al mig de regions codificants, de manera que la unitat transcripcional que surt només és monocistrònica.
Quan expresses des de l’1 obtens els 2 productes gènics dels 2 quadradets, quan ho fas des del 2 només obtens el producte gènic d’un quadradet.
Només en A poden funcionar els dos promotors “alhora” o bastant seguits. En al resta, o funciona un o funciona l’altre, ja que la RNA polimerasa només es pot enganxar a un dels dos.
La diferència entre C i D és que en C el promotor està dins la regió codificant, i en D està fora.
Però quan obres un no obres l’altre.
En A i B el producte gènic és el mateix (controlen el mateix gen), però el +1 pot ser diferent. És a dir, pots tenir des d’un un transcrit una mica més llarg que l’altre. Per tant el producte gènic obtingut per un promotor i per un altre pot estar contingut en unitats transcripcionals diferents. Les senyals que hi ha a la regió líder poden ser diferents i per tant poden controlarse de forma diferent.
El cas E (tens més d’un gen) es veu exemplificat quan la cèl·lula vol disminuir l’efecte polar de la transcripció d’una unitat policistrònica. Si només tinguéssim un promotor, per l’efecte polar tindríem més quantitat del 1 que del 2. A vegades això no li interessa ala cèl·lula, i posant un altre promotor l’efecte polar queda equilibrat, ja que com un pot ser més fort que un altre, pots acabar tenint la mateixa quantitat dels dos gens evitant l’efecte polar.
A part de les regions -35 i -10, les regions promotores bacterianes també tenen una regió upstream i una regió downstream. Upstream és la regió a 5’ situada més amunt del -35. La regió downstream és la regió a 3’ situada més avall del -10.
És on s’ancoren els reguladors transcripcionals (moduladors com repressors i activadors).
Normalment, els moduladors positius o activadors trobaran la regió d’interacció en la regió upstream del promotor, mentre que els moduladors negatius o repressors trobaran la regió d’ancoratge en la regió downstream del promotor. Aquests moduladors són proteïnes que enforteixen i afebleixen la transcripció de la RNA polimerasa ancorant-se al DNA. Per què se situen així? Perquè els que activen la RNA polimerasa, faciliten que aquesta entri, modulen i torcen el DNA perquè la RNA vegi la regió -35, així que els interessa estar a prop de la regió 35, i els que bloquegen eviten que la RNA polimerasa pugui entrar, per tant els interessa estar a prop de la regió -10. Però trobarem excepcions on se situaran a la inversa.
LA TRANSCRIPCIÓ – O Incio La RNA polimerasa reconeix i s’uneix a les seqüències -35 i s’ancorarà amb força un cop vegi la -10. És a dir, reconeix la -35 i fa plof i cau sobre la -10 i s’enganxa (és una proteïna molt gran – reconeixent la -35 ja ho té tot fet, es deixa caure sobre el DNA i ja s’ancora a la -10; no es que es desplaci). Un cop estabilitzada és difícil fer-la saltar. Si reconeix la -35 però no troba la -10, perd l’equilibri ja que la interacció és força baixa.
La regió upstream facilita l’adhesió de la RNA polimerasa (conté els activadors). A la que veu la regió upstream (és capaç d’enganxar alguna subunitat de la RNA polimerasa, té afinitat per ella) veu molt més fàcilment la -35 – l’activador el que fa és doblegar-se per ensenyar-li la regió -35.
És necessari que la curvatura del DNA sigui idònia pel funcionament de la RNA polimerasa – la torsió del DNA ha de ser aquella que deixi al descobert la regió -35.
Encara que les regions -35 i -10 no estiguin a una distància correcte, amb un associament de proteïnes adient l’expressió d’un promotor feble pot arribar a ser forta.
Promotor. Regions -35 i -10. És un promotor fatal. En el promotor s’hi enganxen proteïnes activadores, donen una torsió al DNA i a més tenen afinitat per la RNA polimerasa, i la col·loquen on toca. Sinó hi fossin, la RNA polimerasa ni el veuria.
Les posicions també són importants (distància). Si les regions estan més separades del que toca, la transcripció a partir d’aquell promotor serà molt baixa.
Però hi ha activadors que reconeixen regions upstream i downstream. S’hi ajunten i fan força i ajunten les regions -35 i -10. Veiem que quan estan més juntes, la transcripció de la proteïna en qüestió (secA) és molt més alta.
Si tallem el tros de DNA que sobra perquè estiguin a la distància que toca, la transcripció augmenta. Però a la cèl·lula no li interessa fer això, li interessa que estiguin aquestes proteïnes, ja que la cèl·lula utilitza aquesta distància per fer que aquest gen s’expressi o no. Han triat evolutivament aquest sistema per controlar l’expressió gènica. Sinó, ja s’haguessin ajuntat fa temps.
LL = HL amb regions -35 i -10 més juntes.
De moment tenim molts elements que controlen l’expressió: regions upstream i downstream, promotors forts i febles, regions policistròniques o monocistròniques, els efectes polars, les distàncies de les regions -35 -10, les seqüències de les regions -35 -10, els promotors solapats, la col·locació en els cromosomes, les seqüències dels RBS, etc. El cúmul de tots ells fa que els gens s’expressin d’una forma o d’una altra.
RNA POLIMERASA La RNA polimerasa és un holoenzim amb diferents subunitats cada una amb la seva funció. Tots els gens relacionats amb la RNA polimerasa s’anomenaran rpoX.
secA és una translocasa que forma part d’un sistema de secreció.
La subunitat α (rpoA) és la que permet la interacció de la RNA polimerasa amb el promotor del DNA – sense aquesta subunitat, la RNA polimerasa no es pot unir al promotor.
La subunitat σ (rpoD)és la que permet el reconeixement del promotor, és la que reconeix la regió -35, mou la RNA polimerasa fins a -10, i allà és on actuarà la subunitat α i permetrà la interacció.
Diem que el nucli de la RNA polimerasa està format per les subunitats β (rpoB – unió nucleòtids), β (rpoC – unió al DNA motlle) ‘i α (totes menys σ).
Tenim un altre manera de controlar l’expressió gènica relacionada amb la subunitat σ. En procariotes trobem en una mateixa cèl·lula diferents subunitats σ, i cada una té regions consens una mica diferents a la resta de subunitats σ que modularan l’expressió gènica.
Tenim el nucli de la RNA polimerasa, on s’ajunta la regió σ i llavors es reconeix el promotor (primer la regió -35 i després la -10 amb α). Un cop hagi passat això, σ s’escindeix i el nucli és qui polimeritza l’RNA. Per tant, la regió σ és qui modula quina és la regió -35 que veig. Si una cèl·lula té diverses subunitats σ, en funció de quina s’uneix a la RNA polimerasa, l’òptim del promotor serà un o altra, ja que cada un reconeix seqüències una mica diferents.
Imatge: tenim representat σ en groc. Ens hem d’imaginar que hi ha σ d’altres colorets pul·lulant por ahi. Depenent del coloret, s’uniran o no en funció de la seva proporció relativa, i aquella RNA en funció del coloret reconeixerà uns promotors o uns altres.
Per tant, en diferents fases de creixement bacterià podem trobar diferents concentracions de subunitat σ. Així es controla el programa de transcripció de la cèl·lula perquè σ és la responsable de reconèixer el promotor que ella cregui més òptim, per tant és la responsable de reconèixer quins gens seran més òptims per expressar en cada moment. Aquesta proporció de subunitats σ variarà en funció de les condicions – d’aquesta manera pots afavorir o no l’expressió de determinats gens.
Les unitats σ són intercanviables entre RNAs polimerases. És a dir, un cop la RNA polimerasa s’ha enganxat i funciona, la σ se’n va. La cèl·lula per tant controla el patró d’expressió en funció de quantes σ d’un color determinat produïm i degradem.
Per exemple, els gens implicats en la captació de ferro tenen tots regions -35 molt similars. Tots ells s’expressaran en global quan aquella σ específica incrementi la seva concentració En aquest esquema de la RNA polimerasa, trobem un canal d’entrada del DNA i un canal de sortida del RNA. La subunitat σ està ancorada a l’extrem de la RNA polimerasa, de manera que quan s’hi troba enganxada, el canal de sortida del mRNA està bloquejat. Per això diem que quan la RNA polimeritza la σ ja s’ha escindit.
DIFERÈNCIES ENTRE LA REPLICACIÓ I LA TRANSCRIPCIÓ La RNA polimerasa i la DNA polimerasa són molt diferents a l’hora d’actuar. En la DNA polimerasa, algú (helicases, etc.) obria les cadenes i ella anava polimeritzant – les cadenes s’obrien abans que ella actués. En canvi, davant i darrere de la RNA polimerasa no veurem cadenes obertes. L’obertura de les cadenes en la RNA polimerasa no es dóna fora d’on es troba ella. Per davant i darrere d’on se situï, els ponts d’hidrogen seguiran mantenint el DNA en doble cadena. A més és ella mateixa que va girant el DNA per evitar entortolligaments que aturin la transcripció; ella mateixa dóna la torsió que toca per evitar qualsevol tipus de problemes d’avanç (no té girases ni res).
MECANISME D’INICI DE TRANSCRIPCIÓ 8/10/14 La RNA polimerasa s’ha d’enganxar al promotor – ha de poder veure les regions -35 i -10 per poder començar a sintetitzar mRNA. Recordem que la transcripció es dóna al voltant del nucleoide, no al mig (pel molecular crowding).
Per si sola, el nucli de la RNA polimerasa no pot unir-se al DNA, primer s’ha d’unir al factor σ.
Un cop muntat l’holoenzim, ja és capaç de reconèixer les regions -35 (ho fa la subunitat σ), llavors es reconeixerà la -10 i α s’ancorarà.
En aquest primer moment tenim dues situacions molt diferenciades: quan la RNA polimerasa està unida però el complex tancat i quan la polimerasa està unida i el complex ja està tancat. Què marca la diferència? Dins de la RNA polimerasa es trenquen els ponts d’hidrogen en la regió -10 – això fa que les cadenes es comencin a separar a l’interior de l’RNA polimerasa (es parla de complex obert). Recordem que aquesta regió -10 era rica en AT – ara veiem el motiu, i és que només són necessaris 2 ponts d’hidrogen entre AT.
Un cop el complex està obert, s’incorporen els primers nucleòtids (fins a 3) per fer la polimerització del mRNA, els primers dels quals serà una A o una G. La subunitat σ és important perquè manté l’estabilitat – fa com de tap, ja que bloqueja el canal de sortida del mRNA. Quan la subunitat σ s’escindeix, s’accelera la producció de mRNA, es va elongant el DNA. Per tant, el responsable de produir el RNA és el nucli o core de l’enzim i no l’holoenzim, ja que funcionarà l’enzim sencer la subunitat σ.
Nosaltres tenim un tub que va passant pel DNA i ha de córrer per amplificar, per tant no pot tenir cap tap. Mentre surt el mRNA, el DNA va avançant i es va obrint i tancant perquè per davant i darrere de la polimerasa el DNA es manté inalterat (no veiem res obert) – el trencament de ponts d’hidrogen es dóna a l’interior del complex.
ELONGACIÓ DEL DNA Aquesta unió de la subunitat σ dóna estabilitat – nosaltres tenim oberta la regió -10 (molts trencaments de ponts d’hidrogen); però no posem el primer nucleòtid fins el +1. Per tant, la interacció és dèbil a la regió -10. Però mentre la RNA polimerasa va buscant per ancorar una A/G no és massa estable, i per això σ aguanta la polimerasa fins que es col·loquen els primers 3 nucleòtids, ja que això li dóna peu per anar obrint el DNA i s’estabilitza. Però arriba un moment en que no aguanta més, ja que el mRNA està fent pressió i el complex ha d’avançar sobre el DNA. Llavors comença a elongar-se el DNA i continua la polimerització.
Estudis in vitro diuen que la RNA polimerasa pot estar dies unida al DNA (dies transcrivint). És a dir, l’estabilitat al DNA és molt alta si no hi ha res que ho impedeixi. En el moment en que salta σ, si es desenganxa la RNA polimerasa del DNA no pot tornar a enganxar-se, no ho pot fer perquè per unir-s’hi necessita la σ que té afinitat per les regions -35 i -10.
Les RNA polimerases tenen una vida mitjana molt llarga – un cop es desacoblen del DNA poden tornar a transcriure més tard (es reciclen).
LA TRANSCRIPCIÓ – O final La RNA polimerasa és molt estable com diem, però necessitem que dugui a terme els transcrits que el microorganisme necessiti. Per tant, ha d’existir algun mecanisme d’aturada.
Aquesta aturada, en procariotes, es fa mitjançant la presència de terminadors transcripcionals – la finalització de la transcripció es basa sempre en un sistema de bucles de DNA que provoca, entortolligant la RNA polimerasa, la disminució de la velocitat de la RNA polimerasa, fent que el complex es torni a tancar i ja no pugui tornar-se a obrir (no estem a la regió TATAA) i s’acaba la transcripció perquè i la RNA polimerasa deixa de ser estable i es desplaça del DNA.
Aquests bucles del DNA són hairpins, bucles, situats en les regions terminadores.
Dins d’aquesta idea de disminució de velocitat, en procariotes s’han descrit dos tipus de mecanismes de finalització de la transcripció: Rho dependents i Rho independents.
MECANISME DE FINALITZACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ MECANISME RHO DEPENDENT La proteïna Rho es veu implicada. Aquesta té diferents propietats: - És una helicasa (desfà interaccions entre RNA i DNA).
És una proteïna hexamèrica de subunitats idèntiques.
Té un domini d’unió a RNA i d’hidròlisi d’ATP.
Reconeix una seqüència específica en el RNA (té molta afinitat).
S’uneix al RNA i circula sobre ell fins atrapar a la RNA polimerasa.
ESQUEMA. El DNA arriba a unes seccions de terminació. El complex de la RNA polimerasa està obert (no hi ha ponts d’hidrogen) i s’està donant la polimerització del mRNA que està sent traduït per una sèrie de ribosomes donant lloc a un polipèptid.
La proteïna Rho s’embolcalla al RNA, avança pel RNA – s’enganxa en l’extrem 5’ i va avançant fins que s’estanca en la seva regió d’interacció (regió RUT).
Aquesta regió es troba a tocar de la RNA polimerasa.
Aquesta interacció enter Rho i la polimerasa ja disminueix una mica la velocitat de transcripció de la RNA polimerasa (és com que l’agafa).
Llavors el complex s’anirà tancant, la velocitat baixa fins que s’escindeix del DNA.
La seqüència RUT incrementa la unió de Rho al RNA. La unió, encara que amb menys eficiència, també es pot donar sense la presència de RUT. * A part de la interacció amb Rho, una altra cosa que fa baixar la velocitat és que en la regió terminadora tenim una regió com la de la imatge – una estructura secundària (hairpin, bucle) formada ja en l’interior de l’RNA polimerasa. La sortida d’aquest bucle fa que la RNA polimerasa no avanci tan ràpid. Rho a més estabilitza aquest bucle.
O SEA. Arriba una zona en que quan es produeix l’RNA trobarà una regió complementària (regions palindròmiques enfrontades) i sorgeix un bucle. Això és un follón per la RNA polimerasa (és molt més fàcil treure un fil que un nus per un forat). Per tant el bucle fa una mica com de tap, i a més Rho interacciona amb el bucle i l’estabilitza.
La seqüència del bucle ve determinada per la seqüència del terminador transcripcional, la qual a su vez ve codificada en el DNA però es forma en el RNA que està sortint de la RNA polimerasa. Aquest bucle format no és molt estable – té moltes As i Us (no té molts ponts d’hidrogen). Perquè aquest bucle pari la transcripció necessita l’ajut de Rho (model Rho dependent).
EFECTES SOBRE LA TRANSCRIPCIÓ – Mutacions polars Vam veure les mutacions polars sobre la traducció. Sobre la transcripció, també en trobem.
Tenim un RNA recobert de ribosomes. Si Rho s’ancora a l’extrem, haurà d’esperar i anar al pas d’avanç dels ribosomes. Quan el ribosoma es desenganxa, arriba al seu lloc i coincideix amb que s’ha arribat al final del transcrit (les cèl·lules han evolucionat perquè Rho arribi quan ha d’arribar, però d’alguna manera hi ha un timer).
Però i si hi ha una nonsense mutation? Si tenim un codó stop prematur, llavors ens trobem un tros bastant gran de RNA no recobert de ribosomes. L’avanç de Rho és molt més ràpid (no hi ha ribosomes que taponin el seu avanç). Per tant, Rho arriba abans a la RNA polimerasa abans que ella arribi al final del transcrit – ens quedem a mig gen (transcrit curt).
Per tant, quan l’efecte polar genera un canvi en la transcripció, ni tan sols transcriurem – genotípicament la cèl·lula és salvatge, fenotípicament és deficient per una sèrie de gens.
Amb una mutació d’inserció de codó stop poden passar 3 coses: es muta el gen i ya; si la mutació està molt endavant, s’afecta la traducció d’aquell gen i dels altres (els ribosomes no arriben amb tanta freqüència – efecte polar sobre la traducció); pot passar que, si deixem molt espai i Rho atrapa la RNA polimerasa, la transcripció s’acabi, o sigui no és que afecti la traducció, directament no hi ha transcrit a traduir. És a dir, hi ha efecte polar sobre la transcripció si hi ha aquest tipus de mutació sense sentit. Si no, l’efecte polar serà a causa dels ribosomes.
Tota mutació sense sentit dins un ORF d’una unitat transcripcional policistrònica tindrà un efecte polar sobre la transcripció? NO. De què depèn? Del lloc on es generi l’stop – la quantitat de RNA que deixem sense recobrir serà més gran o més petita.
Recordem l’estructura estàndard de les unitats transcripcionals policistròniques: En la imatge: UAG-1 o UAG-2, quina tindrà efecte polar? La distància existent entre la mutació sense sentit i el proper RBS determinarà el possible efecte polar. Si la mutació i el RBS distal estan molt propers, no hi haurà temps per la separació dels ribosomes del mRNA i la RNA polimerasa continuarà protegida de la proteïna Rho.
MECANISME RHO INDEPENDENT Tenim transcrits que només amb la presència de bucles, la RNA s’alenteix i s’atura. Aquests bucles són molt estables – tenen regions molt riques en GC (els altres eren rics en AT) i, a més, van seguits de regions molt riques en uracils. Per tant, tenim una estructura secundària que forma un bucle molt estable (amb molts ponts d’hidrogen) enganxat a la RNA polimerasa; això ja alenteix el complex (el bucle l’estira), i a sobre els nucleòtids que venen després del bucle que podrien anar obrint el transcrit només generen 2 ponts d’hidrogen en l’heterodímer RNA-DNA, de manera que, havent d’escindir el complex del RNA polimerasa, és més senzill si hi ha 2 ponts d’hidrogen. Si tens molts uracils és molt més fàcil que salti el DNA (és un velcro amb pocs pèls).
Per què tenim dos mecanismes, un dependent de Rho i un no? No se sap del tot. Aquests bucles tant estables es troben en la regió tràiler del mRNA que no es tradueix, i el fet que no es tradueixi protegeix la degradació del RNA – això pot ser un dels motius pels quals tenim els dos tipus, i és que la vida mitjana d’aquests RNAs és més llarga que dels altres perquè el protegeixes dels enzims que el volen degradar.
Imatge dreta: formació del bucle  tancament de la bombolla  desestabilització de la unió entre RNA polimerasa i DNA  finalització de la transcripció.
...