Seminaris: Purificació de proteïnes i Tècniques associades (sencer) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 1º curso
Asignatura Bioquímica
Año del apunte 2016
Páginas 6
Fecha de subida 08/04/2016 (Actualizado: 06/05/2016)
Descargas 35
Subido por

Descripción

Resum dels seminaris de Bioquímica: purificació de proteïnes i tècniques associades

Vista previa del texto

Breca PURIFICACIÓ DE PROTEÏNES i TÈCNIQUES ASSOCIADES Per purificar les proteïnes dels teixits i obtenir-les aïllades cal dur a terme un seguit de processos.
Actualment també es pot fer a partir d’un teixit de cèls recombinants.
HOMOGENEÏTZACIÓ 1. Trenquem el teixit i les membranes de les seves cèls per obtenir les proteïnes del citoplasma i del nucli.
2. L’homogeneïtzació no pot tenir lloc en sec, sinó que s’ha de dur a terme mitjançant una solució tampó al voltant del pH fisiològic (pH = 7,37). Dilució d’entre 2-4 vegades.
3. Homogeneïtzació.
APARELLS HOMOGENEÏTZADORS Cal usar aigua amb gel per reduir l’escalfor que desprenen aquests aparells.
• Politró (batedora).
• Bouncer i Potter (manuals).
• Blender: aparell homogeneïtzador clàssic.
• Sonicació: cal usar cascos.
També ho podem aconseguir afegint detergents, que trenquen la membrana plasmàtica i ens permeten obtenir les proteïnes en la solució tampó.
• Exemples: Triton-X-100, NP-40, CHAPS, SDS.
SOLUCIONS TAMPÓ La solució tampó que ens interessarà serà la que tingui el pKa més proper al pH que ens interessa treballar. Algunes solucions tampó habitual són: • Àc acètic / Acetat sòdic.
• Àc fosfòric / Fosfat de sodi (polipròtic).
• Àc cítric / Citrat de sodi.
• Àc bòric / Borat de sodi.
• TRIS buffer (molt utilitzat).
Algunes consideracions importants que cal tenir en compte són: • Si estem usant un detergent, el tampó que usarem haurà d’estar per sobre del valor de pH que ens interessa.
• El tampó és més tamponant quan el trobem en concentracions elevades, al voltant de 40-50 mM • Les [ions] a la cèl·lula són: [Na+] = 140 mM, [K+] = 4-5 mM, [Cl-] = 80-100 mM.
• Els enzims treballen a temperatures baixes, però la seva afinitat pel substrat serà molt baixa i, per tant, el seu efecte es veurà molt reduït. Això ens pot interessar si volem disminuir la velocitat de la reacció. A temperatures altes no treballen perquè es desnaturalitzen.
Breca CENTRIFUGACIÓ Serveix per separar els components de la dissolució, que normalment és la sang. L’acceleració de centrifugació es mesura amb g (nosaltres aguantem unes 120 abans de desmaiar-nos).
• A 500g uns 10’ obtindrem els nuclis, a 10.000g uns 20’ obtindrem les mitocòndries i a 100.000g uns 60’ obtindrem les proteïnes i microsomes (residus artificials de parts de RE).
• Tipus de centrifugadores: de sobretaula, secció centrífuga, de micro tubs, de pols, d’alta velocitat i ultracentrífuga.
• a = w2 · x, on w és la velocitat angular (w = 2π·rpm/60), x és el radi, en metres, i a és l’acceleració, en g.
FRACCIONACIÓ AMB SALS Hem de seleccionar la fracció cel·lular en què es troba la proteïna que busquem. Un cop la tenim homogeneïtzada, fem precipitar la proteïna amb una sal (per exemple, amb sulfat d’amoni) a una concentració calculada prèviament.
• Si desconeixem la concentració de proteïna necessària, anirem augmentant un 10% la seva concentració (10% → 20% → 30%…). La majoria precipiten en concentracions d’entre el 30-40% de sulfat d’amoni.
DIÀLISI • Consisteix en posar la solució concentrada dins d’una bossa de diàlisi en un vas de precipitats ple d’una solució tampó determinada (canviarà segons el que ens interessi treballar).
• La bossa consisteix en una membrana semipermeable, que no deixa passar la nostra proteïna, perquè és d’un pes molecular alt, però si els altres components.
Per equilibrar concentracions, els components sortiran de la bossa de diàlisi per difusió, de • manera que al punt d’equilibri (després d’unes 2h) haurem reduït la concentració de components diferents de la proteïna dins de la bossa.
• Repetim el procés tres vegades (aproximadament) per obtenir la proteïna sola a la bossa.
Breca CROMATOGRAFIES • Penetrabilitat (gel filtració): Les molècules amb major massa molecular surten abans que les que tenen menys massa molecular, que entren a les estructures que forma el gel i “s’entretenen” més a baixar.
• Per accelerar el procés els tubs es centrifuguen cada vegada que s’afegeix el buffer.
• Normalment s’usa una columna de Sephadex (sepha = bola, dex = dextrà), però també se’n poden fer de Sepharosa (d’agarosa) i de Sephacel (de cel·lulosa).
• Inconvenient: la mostra es dilueix bastant.
• Intercanvi iònic: les molècules es separen segons la seva càrrega.
• La càrrega de la proteïna depèn de la cadena lateral.
• Les substàncies carregades que normalment s’usen per a l’intercanvi iònic són el DEAE (+) i el Phospocel (-).
• Només sortiran les molècules de la mateixa càrrega que les boles (pass through), les altres es quedaran enganxades i no sortiran (són les que ens interessen).
• A continuació es fa una neteja per eliminar les proteïnes que no volem i s’afegeix una solució in creixendo de NaCl (fins a 200 mM), que competirà per unir-se a les boles carregades, de manera que la proteïna que ens interessa se’n desenganxarà i la podrem obtenir sola.
Breca • Afinitat: es tracta de buscar quelcom que sigui molt afí per la nostra proteïna, de manera que s’hi uniran i, en afegir un altre component afí per la nostra proteïna, aquests dos competiran.
• També es pot aconseguir canviant el pH, de manera que l’afinitat es perdi i obtinguem la proteïna sola.
• Electroforesi: separació de les proteïnes en funció de la seva massa molecular i gràcies a l’ús d’un camp elèctric, d’un cert voltatge o diferència de potencial (V = 220V) i intensitat (I = 1mA).
El procés consisteix en: 1. Desnaturalitzar les proteïnes. S’usen l’SDS (trenca les interaccions hidrofòbiques i carrega negativament les proteïnes) i el ß-mercaptoetanol (trenca els enllaços disulfur). → En el sample buffer.
2. Tenyir les proteïnes. S’usa blau de bromofenol, que permet visualitzar el desenvolupament de l’electroforesi. → En el sample buffer.
3. Densificar la mostra per evitar que s’escapi dels pous del gel. S’usa glicerol. → En el sample buffer.
4. Introduir el gel de poliacrilamida a la cubeta, omplir el compartiment intern amb el running buffer i l’extern amb el tampó necessari per submergir la base del gel (eliminar O2!!).
5. Carregar de mostra els pous del gel. Carregar els marcadors (proteïnes patró de massa molecular coneguda, que serviran de recta de calibratge) al darrer pou.
6. Tapar la cubeta, connectar els elèctrodes i aplicar un corrent de 20mA.
• Les proteïnes de menys massa molecular arribaran més lluny, perquè el gel no els oposarà tanta resistència com a aquelles proteïnes de més massa molecular.
• Distingim el càtode (pol -) i l’ànode (pol +), on aniran les proteïnes que hem afegit.
7. Al cap d’1h (aprox.), tancar el corrent, obrir la cubeta, buidar el tampó i treure els gels.
8. Tallar el gel apilador i tenyir (Coomassie Blue) el restant fins a distingir-ne les bandes, a partir de les que determinarem les masses moleculars de les proteïnes de la mostra.
• La massa molecular mitjana d’un AA és de 110 Da. Com que cada SDS s’uneix a 2 AA, una cadena de 11.000 AA tindria 5.500 SDS, és a dir, 5.500 càrregues negatives.
Breca En la separació de DNA usem gel d’agarosa, mentre que en separacions de proteïnes usem gel de poliacrilamida, del qual distingim el gel apilador (5%, pH = 6,8), a sobre i el gel separador (10%, pH = 8,9) a sota.
• El gel s’obté d’un buffer TAE (tris-acetat-EDTA) o TBE (tris-borat-EDTA), que s’escalfa i es deixa solidificar. A continuació es fan les pintes, és a dir, es forada el gel a la part superior, on posarem la mostra.
• Hi ha gels natius que aprofiten les càrregues intrínseques de les proteïnes, és a dir, no necessiten additius.
També podem separar les proteïnes aplicant un gradient de pH al gel. Així aconseguirem que la proteïna amb què treballem es quedi parada en el seu punt isoelèctric, de manera que podrem fer una separació proteica per isoelectroenfocament.
Breca WESTERN BLOT És la detecció de proteïnes utilitzant anticossos específics de cada una de les proteïnes que volem estudiar.
El procés consisteix en: 1. Separar les proteïnes (desnaturalitzades) per una electroforesi en gel.
2. Transferir les proteïnes a una membrana (acostuma a ser de nitrocel·lulosa) fora del gel.
3. Aplicar els anticossos corresponents per veure si reaccionen o no amb les respectives proteïnes. La unió es pot detectar per coloracions, radiacions, fluorescències… ...

Tags: