TEMA 4 Biologia Molecular (BIOMOL) (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 37
Fecha de subida 01/07/2017
Descargas 1
Subido por

Descripción

Inclou els apunts corresponents al tema 4 de l'assignatura Biologia Molecular: RNA

Vista previa del texto

Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) TEMA 4: RNA El RNA la seva estructura primària està formada per: - Cadena de polinucleòtids, ribonucleòtids perquè presenten un grup OH al C 2’ de la ribosa. S’uneix al següent per un enllaç fosfodièster 3’ – 5’.
Substituïm la base de timina per una base de uracil El RNA a diferència del DNA és de cadena senzilla però sí pot formar estructures de doble hèlix. Normalment ho fa amb una part de la cadena i una altre part de la mateixa cadena, conegut amb el nom de autoaparellament.
Molts cops aquest autoaparellament no és perfecte, però pot sortir un nucleòtid que no s’aparelli i em formi una protuberància, un llaç intern. Pot ser que doni un stem loop.
Les parts que formen aparellament de bases formen una doble hèlix. Podem tenir dobles cadenes formades per RNA sense que sigui per autoaparellament. Són aparellaments curts i el més normal és que el RNA sigui de cadena senzilla.
És factible tenir dobles cadenes formades per una cadena de RNA amb una cadena de DNA. La doble hèlix que es forma mai pot ser de tipus B-DNA. Sempre són de tipus A-DNA per la presència al carboni 2’ del grup hidroxil. Una cadena de RNA amb un grup fosfat a l’extrem. El grup OH està a una distància de Van der Waals inferior a la que hauria de ser, hi ha impediments estèrics. Malgrat la cadena de RNA adopta una forma de doble hèlix ha de ser A–DNA. És més ample i no forma impediments estèrics.
1 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Les riboses no encaixen dins d’una hèlix de tipus B degut a que no hi ha suficient espai per l’àtom d’oxigen 2’. Les marques grogues de la figura indiquen que els àtoms assenyalats estarien a una distància inferior a la de Van der Waals.
ESTRUCTURA SECUNDÀRIA DEL RNA Es pot replegar sobre si mateixa  Molts cops aquesta estructura secundària es replega sobre si mateixa, es pot plegar sobre si mateix i aparellar-se. Per exemple el tRNA. A un pal de la L tenim el triplet pel codó i al altre pal tenim l’aminoàcid unit. En el cas de l’ARN quan forma les dobles hèlix no es formen els enllaços per ponts d’hidrogen entre una guanina i un uracil. És possible en aquest cas tenir estructures o aparellaments de bases diferents de les que hem descrit per Watson i Crick.
2 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Possible estructura secundària d’un RNA: Els parèntesis assenyalen regions que poden aparellar-se quan el RNA adopti estructura tridimientsional. Els punts blaus indiquen els parells de bases G=U que no presenten aparellament de tipus Watson i Crick. Aquests aparellaments es formen quan els RNAs es pleguen sobre si mateixos.
A diferència de l’ADN, l’ARN normalment sempre va associat a proteïnes. No trobem normalment RNA tot sols, despullats. En aquest cas, els RNA associat a proteïnes poden adquirir una funció catalítica. Poden fer o funcionar com si fossin enzims i parlem de RIBOZIMS. Per exemple el rRNA participa a la formació de l’enllaç peptídic.
RNA de la cèl·lula el podem separar en RNA que codifica per proteïnes i donarà lloc a mRNA i la resta que és RNA no codificant, el qual es troba a les regions del genoma que no codifiquen per proteïna i pot tenir funciones estructurals, catalítiques o reguladores (poden regular l’expressió gènica).
Aquests RNA no codificant formen part de la part del genoma DNA que té copia única, però no del que codifica per proteïnes.
ncRNA: RNA que “participa” en la síntesi de proteïnes  rRNA (els més abundants dins les cèl·lules i alguns d’aquests tenen funcions catalítiques perquè participen en la formació de l’enllaç peptídics) i tRNA (RNA més petits alguns d’ells que els ribosòmics, 75 bases, adopten l’estructura terciària esmentada abans i fan un paper d’adaptadors entre la seqüència de mRNA i la seqüència d’aminoàcids de la proteïna codificada per aquell gen. Presenten bases modificades. Porten algunes bases que no són les 4 que portem sempre).
RNA citoplasmàtics petits: són de mida curta i es troben al citosol. Formen part del que es coneix amb el nom de partícula de reconeixement de senyal. Aquesta partícula de reconeixement de senyal està formada per un conjunt de proteïnes i RNA citoplasmàtics petits. Proteïnes que han de ser secretades porten a la seva seqüència extrem N-terminal un pèptid senyal. Aquest és reconegut per la partícula de reconeixement del senyal i van a parar al reticle endoplasmàtic, queden a dins de vesícules encara no plegades totalment i van a parar a la membrana plasmàtica, es fusionen i van a parar a l’exterior. Participen en el procés d’excreció de les molècules a l’exterior de la cèl·lula.
tmRNA  transfer Messenger RNA, participen en la síntesi proteica. Aquests són RNA que es troben en procariotes i tenen característiques de RNA de transferència i de RNA missatger. La funció que fan és que quan un mRNA està sent traduït, el mRNA missatger perd el codó d’stop i la traducció s’aturaria. El missatger perd el codó de stop, queda parat i enganxat el ribosoma al mRNA. Com es pot perdre un codó d’stop?  Atura la transcripció i no arribo al final, no transcrivim el codó d’stop.
Aquesta seqüència és truncada i és traduïda. El ribosoma queda parat si no tenim codó de stop. Tenen estructura semblant a un tRNA amb un aminoàcid enganxat (alanina) i la part codificant. Es situa al lloc A del ribosoma i aquí situa l’alanina. Fa saltar el mRNA. La part codificant substitueix el mRNA i porta una cua que porta la part codificant. RNA va cap a degradar, el ribosoma salta i la proteïna queda marcada (s’afegeix una petita cua) com a no funcional per a degradar.
3 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) RNA que participa en la maduració de mRNA i en el procés de replicació Dels que participen en la maduració del mRNA són: - - - snRNA  RNAs nuclears petits, són RNA relativament curts (menys de 200 pb) es troben al nucli i formaran el complex de la maduració del mRNA. Formen part de les partícules ribonucleiques nuclears petites. Això forma part de la maquinaria d’eliminació d’introns (spliceosoma). Com el procés de maduració de mRNA el veurem més endavant i els tipus de sRNA també.
RNA nucleolars petits (snoRNA)  no tenen un gran nombre de bases i es troben en el nucli, concretament a la regió del nuclèol. Aquests participen o interaccionen amb enzims que la seva funció és modificar bases nitrogenades de tRNA o rRNA. Al nuclèol es generen els ribosomes. S’associen a enzims i conjuntament els RNA i els enzims fan canvis en bases nitrogenades de tRNA i rRNA. És com un procés de maduració de tRNA i rRNA.
RNA que trobem associat a la telomerasa, RNA telomèric, associat a l’enzim de telomerasa que addiciona als extrems de cromosomes els telòmers, evitar a mesura que es produeix el procés de replicació anar perdent informació.
5’  3’ 3’  5’ 4 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Un cop acabat el procés de replicació els encebadors són eliminats i les cadenes queden escurçades pels extrems 5’ i si això es dóna contínuament es pot arribar a perdre informació. Les seqüències que allarguen els cromosomes són els telòmers. N seqüències repetides en tàndem, còpies de RNA telomèric. Eviten que tot i que en procés de replicació escurcem els telòmers, duraran molt abans que es comenci a perdre informació. És el motlle que servirà per copiar els telòmers.
- Ribozim  hi ha RNA que tenen activitat catalítica.
o RNasa P  permet fer madurar l’extrem 5’ dels tRNA.
o RNasa MRP  participa en el processament del pre-RNA ribosòmic eucariota.
Concretament es sintetitza com una molècula més llarga i trobem per un cantó 5S i l’altre cantó 18S. Aquesta RNasa MRP a partir del transcrit primari dels rRNA i els fragmenta i acabarà donant els que forment part dels ribosomes. També participa en la replicació del DNA dels mitocondris (tenen funcions en cèl·lules eucariotes).
RNA que participen en la regulació de l’expressió gènica. Conjunt de RNA que tenen funcions reguladores: - sRNA  small RNA o RNA petits. Aquests són o es troben exclusivament a procariotes. Funció de regulació de l’expressió gènica pot ser a dos nivells; o Reconeixen un determinat mRNA i s’associen i aquest sRNA forma aparellament de bases amb el mRNA diana. Són RNA molt curts i s’associen a proteïnes xaperones (ajuden al plegament proteic) i asseguren la unió entre sRNA i mRNA diana. La unió es desenganxaria perquè el sRNA és molt petit. Un cop s’ha donat la associació, el mRNA queda etiquetat per ser degradat i és eliminat per la RNasaE. Aquest mRNA ja no passa a traducció sinó que es degrada per aquest enzim que degrada RNA.  degradació de heterodúplex per RNasaE o També poden tenir efectes sobre la traducció d’aquests mRNA i poden ser positius (augmentant la traducció de mRNA) o negatius (disminuint), activant-la o reprimint-la. Sequència codificant: a) En l’estructura secundària la seqüència corresponent al lloc d’unió del ribosoma en 5’, està formant aparellament de bases i no està massa accessible perquè pugui ser reconegut pel rRNA 16S i és difícil que el ribosoma es pugui unir en aquesta regió.
Si s’afegeix sRNA que presenti complementarietat de bases que és la regió d’unió del ribosoma i passem a una estructura de tipus (ACTIVACIÓ). La regió queda més 5 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) accessible perquè sigui reconeguda pel 16 S dels ribosomes. Increment de la traducció del missatger.
b) Pot passar just el contrari, la estructura secundària del ribosoma ja tingui la zona accessible i el rRNA 16 S es pot unir per realitzar la traducció fàcilment. Si afegim un sRNA que forma aparellament de bases ja no deixa disponible el lloc d’unió amb el rRNA 16S, dificultem l’entrada del ribosoma i disminuïm la traducció d’aquest mRNA.
- Ribocommutadors (PREGUNTA D’EXAMEN)  estan formats per una regió que rep el nom d’octàmer i la plataforma d’expressió. El riboswitch o ribocommutador té la capacitat d’unir determinats lligands i per passar d’un estat activat a un estat desactivat per la unió del lligand a l’octàmer. Un cop ha unit al lligand canvia de conformació i això es transmet a la plataforma d’expressió. Canvia la conformació o facilito la transcripció o traducció o bé bloquejo transcripció o traducció.
Normalment els gens que van darrere dels ribocommutadors codifiquen per la ruta de biosíntesi del lligand.
Exemples (estructura secundària) i molècules efectores  Ribocommutador de sadenosil metionina. Síntesi d’aminoàcids o bases nitrogenades. Ribocommutador de lisina i el lligand és la lisina, el mateix pel de guanina i pel d’adenina. Actuen tant a nivell de transcripció com a nivell de traducció.
Com sempre, tenim un extrem 5’ de ARN on tenim la zona de ribocommutador i adopta una estructura secundària determinada. Tenim 4 seqüències de les quals la 2 i 3 formen aparellament de bases i això permet la transcripció de tots els gens que venen 6 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) a continuació. Si s’uneix el lligand, la unió d’aquest canvia la estructura secundària del fragment de DNA i l’aparellament de bases es dóna entre la seqüència 3 i 4.
Terminador de la transcripció i per tant els gens que venen a continuació no es transcriuen.
A nivell de traducció: Aparellaments de bases entre la seqüència 2 i la 3, la seqüència 4 té la lloc d’unió de ribosomes i és més fàcilment reconeguda per part de rRNA 16S i es pot traduir el que ve a continuació perquè la regió 4 no estava donant aparellament de bases.
Octàmer i aparellament entre 2 i 3 hi ha aparellament de bases però ara s’està donant entre 3 i 4. La entrada del ribosoma es veu dificultada i per tant la traducció dels gens també.
Si es dóna la transcripció també es podrà donar la traducció. En l’altre situació suposes que ja està transcrit i només regulem la traducció.
El ribocommutadors es troben a llevats, plantes i també a procariotes.
- Long non-coding RNAs  RNAs llargs no codificants. Són majors de 200 bases i tenen múltiples funcions, sobretot en eucariotes (desenvolupament embrionari, diferenciació cel·lular) i funcionen de diferent manera. Es poden transcriure en resposta a senyals. Principals funcions atribuïdes als IncRNAs que acaben afectant l’expressió gènica: 7 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) o o o o El que fa és acostar a determinats punts del genoma factors de transcripció o acosta proteïnes al transactivador. Una activació de l’expressió gènica.
Segrestar determinat transactivadors i per tant el que obtinc és una supressió de l’expressió gènica Guia  té una part de la seva seqüència complementària d’una part del genoma on hi ha algun tipus d’element en cis que regula l’expressió gènica. El RNA llarg pot fer de guia un cop s’ancora i atrau elements remodeladors de l’estructura de la cromatina, introduieix acetilacions i passa a eucromatina i permet l’expressió gènica Al damunt seu s’ensamblen o col·loquen elements que permeten la remodelació de la cromatina.
Les maneres que poden afectar és amb aquests 4 mecanismes. Tot va a activar o inhibir l’expressió gènica, sigui d’una manera o altre.
- - gRNA o RNA guia  es van trobar en mitocondris de tripanosomes. Participen en un procés que rep el nom d’edició del mRNA. En un d’aquests mecanismes el que fa és introduir molts canvis en el mRNA madurs. Un cop un mRNA ha passat per un procés de edició no pot formar aparellament de bases amb el gen que el codificava inicialment.
vRNA o vtRNA  RNA volta o vault RNA. No es coneixen gaire i no van sols, sinó que s’associen a proteïnes formant un complex anomenat complex volta o volt.
Proteïna majoritària d’aquest complex que forma una estructura formada per més una proteïna volta i més d’un RNA. Sembla una espècie de pilota de rugbi amb un extrem al mig. S’ha relacionat amb la resistència de fàrmacs, s’ha vist estudiant la resistència de fàrmacs a cèl·lules tumorals. Pot segrestar els fàrmacs i impedir que facin la seva acció al citosol o evitant que entrin al nucli. No se sap exactament com i també s’han associat amb una sèrie de proteïnes de membrana (una cèl·lula tractada amb diferents fàrmacs i aquest entra a dins, es segresten i eviten que entren a nucli) es sobreexpressen unes proteïnes de membrana quan es tracten les cèl·lules amb fàrmacs antitumorals i aquestes proteïnes actuen com a bombes d’extrusió de fàrmacs.
Un exemple d’aquestes proteïnes s’anomena P-gp o glicoproteïna P. Aquestes proteïnes de membrana són bombes per tirar cap a for els fàrmacs que han entrat i fan un cicle. Podem anar posant fàrmac però cada cop tinc més bombes que els treuen 8 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) fora. Es creu que aquest complex volta participa en l’expressió d’aquestes proteïnes de membrana que fan de bombes d’expulsió tot augmentant la resistència contra fàrmacs i no se sap exactament com ho fa el mecanisme, no és conegut. S’ha vist una relació però no com es fa.
- - Dins dels RNA que participen en regulació de l’expressió gènica trobem els microRNA i els siRNA. Es creia en un principi que tots eren exògens (Afegits des de l’exterior). Tots dos són de doble cadena entre 22 i 23 base: microRNA o miRNA  endògens siRNA  Això es coneix com RNA d’interferència. Exògens (alguns són endògens) Es van conèixer quan es volia silenciar uns gens i es buscava que els RNA fossin complementaris amb un segment del genoma i impedís l’expressió. En comptes de ficar un fragment de cadena senzilla va ficar un de doble i va funcionar millor.
No se sap ben bé la diferència entre uns i altres.
Per obtenir els RNA de doble cadena, madurs, hi ha un punt on convergeix la maduració de siRNA o miRNA.
Com es produeixen aquests miRNA Estan codificats al genoma i poden estar codificats en qualsevol part del genoma.
Es pot trobar en seqüències intergèniques (no codificant) o codificant inclús enmig d’un gen tant en introns com exons. Estan escampats per tot el genoma.
Es transcriuen per la RNApol2 o pol3 i donen lloc a una molècula de RNA anomenat micro RNA primari (pri-mi-RNA). Es troba dins del nucli i adopta una estructura secundaria extrem 3’ no aparellat amb cua de poliA i extrem 5’ aparellat. Estructura semblant a stem loop. Aquesta estructura secundària poden haver-hi desaparellaments, hi ha punts de mal aparellament. Un cop transcrit i format aquest mi-RNA primari experimenta una primera etapa de maduració o processament i passem de pri-mi-RNA  pre-mi-RNA. L’estructura o proteïna encarregada de processar-lo està format per DROSHA i ajudat per una altre proteïna anomenada DGCR8 permet que DROSHA es situï correctament sobre el pri-miRNA perquè la activitat ribonucleasa 3 d’aquest complex proteic provoqui un primer tall en aquesta doble cadena formada per autoaparellament.
Aquesta talla al biaix, mai exactament igual a una cadena que a l’altre. Talla i deixa un extrem 3’ que sobresurt. DROSHA provoca el tall i per saber on ha de tallar exactament s’ajuda de DGCR8. Un cop s’ha fet el tall obtinc el pre-mi-RNA dins del nucli. Aquest, per continuar el procés de maduració ha de sortir del nucli i aquest és reconegut per una proteïna d’exportació nuclear anomenada exportina 5. Aquest pre-miRNA reconegut per la exportina 5 associada a una proteïna run (la qual hidrolitza GTP, necessita energia) i tot el complex passa a través dels complexos de porus nuclear de la membrana nuclear. Arriba al citosol i és reconegut pel complex anomenar DICER que s’encarregarà de madurar el pre-miRNA a miRNA madur. En aquest punt, actua DICER i tant es produeix la maduració del pre-miRNA com dels siRNA. S’ajunten i arriben a la forma madura que produirà el silenciament de l’expressió gènica. Tots, tant exògens com endògens acaben arribant a DICER.
9 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Interferència de RNA Dins del RNA reguladors anomenem RNA d’interferència RNA petits que inhibien l’expressió d’un determinat gen de manera específica. Podem distingir de dos tipus: siRNA i microRNA. La diferència està en el seu origen. Els siRNA són exògens i els microRNA els produeix la pròpia cèl·lula (endògens) i es generen de forma específica.
Un sRNA s’aparella al mRNA i impedeix la traducció.
Els microRNA poden provenir d’un intró o de seqüències intergèniques.
Steem loop 65 o 70 nucleòtids. Per activar-lo cal que viatgi fora del nucli. Hi ha una sèrie de proteïnes que regulen cap a on anirà cada biomolècula. Per anar del nucli a citoplasma tenim les exportines. Per fer el viatge contrari tenim les importines.
El pre-microRNA és captat per l’exportina 5 i l’envia al citoplasma. Un cop aquí és reconegut per un complexe de proteïnes, DICER que elimina una part del stem loop, gairebé tots els nucleòtids que queden són de doble cadena. S’elimina l’stem loop i es converteix en microRNA madur amb uns 23 pb dsRNA.
Què passa un cop al citoplasma?  tenim el mateix que si hagués vingut de fora. Si l’haguéssim injectat tindríem RNA bicatenari (siRNA) i ve de dins és microRNA.
10 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) El siRNA és captat per un complex de proteïnes anomenades RISC (complex de silenciament induït per RNA). Silencien l’expressió gènica i és capaç d’unir-se a RNA.
Què fa risc?  el primer que fa és agafar el microRNA i gràcies a la despesa d’ATP desnaturalitza el RNA bicatenari i es queda només amb una de les dues cadenes.
Quina de les dues cadenes es queda?  la que li permetrà fer una acció específica sobre un gen. Com ho decideix? Com ho sap?  RISC no és 100% bicatenari, als seus extrems hi ha fragments monocatenaris i això permet decidir quina de les dues cadenes es quedarà RISC. Què fa RISC? Perquè vol aquesta molècula monocatenària?  fa de guia, s’aparella amb una zona específica i a la zona on s’hagi aparellat podrà fer la seva funció. No actuarà sobre qualsevol nucleòtid, només actuarà allà on s’aparelli. Si hi ha un aparellament perfecte és molt específic. És difícil que hi hagi una molècula exactament igual. ¼ al primer nucleòtid i al segon ¼, però la mateixa posició del primer i el segon iguals és ¼ * ¼. Per això és específic.
RISC pot actuar de diferents maneres, inhibint la traducció del RNA al qual s’aparella o silenciant l’expressió d’un determinat gen inhibint la transcripció.
Hi ha dues cadenes i ens queda una. Què li passa a l’altre?  És captada per una RNA polimerasa RNA depenent (RdRP), bàsicament sintetitza la cadena complementària. Tenim RISC, amb les dues cadenes. RISC el que fa és quedar-se amb una de les dues cadenes que farà servir de guia i allibera l’altre cadena, la RNA polimerasa RNA depenent (RdRP) sintetitzarà la cadena complementària. Tot i que el microRNA s’hagi unit a RISC no s’ha acabat. Com a conseqüència, l’efecte del 11 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) micro i si RNA és molt potent. Costa molt de gastar perquè la cadena que s’allibera serveix per sintetitzar un nou microRNA.
microRNA: mecanismes inhibició expressió gènica Com actua RISC?  actua diferent en plantes i animals: - - En plantes, el més típic és induir la degradació de RNA. RISC conté el RNA guia provinent del microRNA i s’aparellarà de manera específica amb el RNA. RISC té activitat nucleasa quan té un RNA bicatenari aparellat. Talla pel mig i un cop tallat el mRNA ja no és funcional.
En animals, la situació tal i com la coneixem avui dia és diferent. L’aparellaments no és 100% (a diferència de plantes) i té la conseqüència de que baixa el nombre d’aparellaments necessaris i pot estar regulant a la vegada diferents gens. Un microRNA pot regular diferents gens. A les bases de dades busques com actua un microRNA i actua sobre múltiples gens alhora. Inhibeix la traducció sense fer malbé el mRNA. Hi ha diversos mecanismes (7 o 8) i ens presenta 3: 1. segrest o P-bodies  P-bodies són inclusions al citoplasma que acumulen mRNA que no és accessible al ribosoma. Al citoplasma hi ha inclusions citoplasmàtiques, zones diferenciades al citoplasma no separades per cap membrana però hi ha a dins una determinada molècula. Als P-bodies hi ha RNA i proteïnes que permeten que no es mescli al citosol. Magatzem de RNA que en aquell moment no es pot traduir. Estem impedint que pugui ser traduït.
2. Unint-se, impedint que pugui unir-se al ribosoma. S’inhibeix la traducció.
3. Impedint que s’uneixin les dues subunitats del ribosoma i no es pot donar la traducció.
Diferències principals entre mRNA procariota i eucariota La traducció en eucariotes és diferent de procariotes. El casquet s’uneix una de les dues subunitats del ribosoma i gràcies a proteïnes aquesta subunitat viatja per trobar el codó d’inici, i un cop aquí es permet que s’uneixi l’altre subunitat per dur a terme la traducció.
RISC té el seu guia i és enviada cap al nucli amb importines i s’aparella al DNA, específicament a un determinat gen i indueix canvis en l’estat de compactació del DNA, augmentant la compactació del DNA i si està més compactat no es pot transcriure. S’han descrit alguns casos on el microRNA fan desempaquetament.
12 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) RNA codificant o RNA missatger  Conté la informació per la síntesi de proteïnes. Té uns 2000 pb de mitjana i és un percentatge molt petit de tot el RNA que trobem dins la cèl·lula. Un 3%. El RNA no codificant és superior al missatger, hi ha molt que no és codificant. Eucariota i procariota són RNA molt diferents.
El RNA procariota és senzill, quan purifiquem mRNA obtenim molècules de RNA.
Quan ho fem amb eucariotes el mRNA està complexat amb múltiples proteïnes, implicades en la maduració o bé relacionades amb l’exportació al citoplasma, vida mitja, ... gairebé és una ribonucleoproteina.
En procariotes són policistrònics i els eucariotes no. Policistrònic  codifica per diferents gens alhora. Un operó procariota es posa amb promotor+operador+gens de l’operó+terminador. Tots els gens es regulen per un únic promotor. Tenim un mRNA amb diferents gens. Això és un RNA policistrònic. Això es tradueix en que hi ha una RBS (seqüència de Shine Dalgamo) on es comença a traduir, lloc d’unió del ribosoma.
Encara que els tres gens es trobin en un mateix mRNA es poden traduir de manera independent, que trobem codons d’inici i stop. En eucariotes no hi ha operons, cada mRNA codifica per un sol gen.
A procariotes allò que s’ha transcrit és el que es traduirà, el mRNA no es modifica. En el cas dels eucariotes sí, s’afegeix una estructura al final. Cua poliA, introns, metilar les bases o les riboses, procés d’addició (modificació de la seqüència, canvi de base per una altra). No és la mateixa seqüència que hi havia inicialment, inserció d’una base, canvi d’una base per una altre... el RNA eucariota sofreix tota una sèrie de modificacions.
Pre-mRNA (mRNA que s’ha transcrit i després ha de madurar). Això en el fons no existeix. Tenim DNA amb la bombolla de transcripció i el ribosoma amb un domini C termial o CTD. S’uneixen altres proteïnes que van modificant el mRNA conforme va sortint. La transcripció la modificació post-transcripcional té lloc en paral·lel. És molt estrany que es produeixi un pre-mRNA, serà modificat abans d’acabar la transcripció.
Dins del RNA procariota com eucariota tenim dues zones als extrems no traduïdes que anomenem UTR. En procariotes tenen nom de líder i tràiler. En eucariotes no tenen nom. Són molt més curtes en procariotes. En eucariotes són molt més llargues perquè s’uniran proteïnes que aniran fent la modificació post-transcripcional.
13 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Estructura de l’extrem 5’ dels mRNAs (CAP) Modificacions post-transcripcionals. Tenen molta relació amb la regulació de l’expressió gènica, a partir d’un gen es poden sintetitzar proteïnes diferents en funció de les proteïnes utilitzades.
- Addició del CAP Aquesta és una estructura post-transcripcional situada a l’extrem 5’ dels mRNA. És una estructura molt necessària perquè el mRNA és un 3% del ribosoma. Senyal que diferenciï el RNA del mRNA. Permet que hi hagi la traducció, és el lloc on anirà a parar la subunitat del ribosoma. Si no la té la confondrà amb un RNA no codificant.
Té una guanina, és una metil-guanosina. Aquest nucleòtid amb el següent no està unit per un enllaç fosfodièster 3’ – 5’, sinó un enllaç pentaester 5’ – 5’ i en alguns casos CAP té modificacions addicionals. Les metilacions es donen al mRNA. Aquesta estructura esta marcant que hi hagi un mRNA i permet començar la traducció. La traducció té un altre efecte, augmenta la freqüència de traducció d’un mRNA. Hi ha 3 fosfats entre dos nucleòtids.
mRNA comença amb CAP i acaba amb cua poliA. Els mRNA eucariotes tenen un aspecte circular (no estan covalentment tancats). Està molt a prop el principi del final perquè sigui molt fàcil tornar a fer la unió del ribosoma al mRNA. Si fos lineal, hauria de donar tot el recorregut per tornar al principi.
Protegeix l’extrem 5’ i com tenim una estructura formada per enllaços fosfoester no és fàcilment reconeguda per les exonucleases.
Cal un procés de transport el qual és un punt de regulació de expressió gènica, exportines envien mRNA cap al citoplasma gràcies a la seva unió al CAP. Com es fa aquest procés?  La transcripció i maduració són processos paral·lels. Domini CTD és on es donen les modificacions.
14 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) S’hidrolitza el fosfat del nucleòtid trobat a 5’. Per fer la polimerització d’un àcid nucleic calen nucleòtids trifosfat que porten l’energia per fer l’enllaç fosfoèster i per això el primer també té tres grups fosfat. Hi ha un enzim anomenat fosfohidrolasa que elimina un, la primera base ha perdut un primer grup fosfat i un cop perdut hi ha la guanilil transferasa, que transfereix una part del GTP sobre el grup fosfat.
-OH + àcid gras  éster + H2O -SH + àcid gras  tioèster + H2O -OH 3’ + àcid fosfòric  éster Grup fosfat es pot transferir a un altre lloc, per exemple: ATP + Glu  Glu-P Reaccions oposades: PEP + ADP  Pyr + ATP ADP + GTP  ATP + GDP L’energia lliure de Glu-P és menor que no ATP Amb la reacció de sota el contrari i amb la reacció de sota estan iguals Si tenim GTP, el fosfat s’uneix formant un nou fosfoèster i el grup fosfat s’uneix a la molècula. Un grup fosfat s’uneix amb altres OH i si s’uneix a un altre P forma un grup fosfoèster.
Transferim dels tres grups P amb la guanosina i sobra un grup fosfat. Tres grups P units per enllaços fosfoèster entre l’extrem 3’ d’un nucleòtid i 5’ de l’altre. Tenim 3 metilacions: guanina metil-transferasa i altres metil-transferasa al hidroxil en 2’, es forma l’estructura del CAP. Es transfereix GT-P sobre el grup fosfat de l’ADP-P Sobre el segon fosfat del primer nucleòtid, primer guanina i després dels altres dos. El de la guanina sempre es dóna i els altres dos no sempre.
Possibles funcions: 1. Participació en les reaccions d’eliminació d’introns 2. Contribuït a l’estabilitat dels mRNAs protegint-los de l’acció de nucleases que actuïn sobre l’extrem 5’ 3. Facilitat la traducció dels mRNAs per part dels ribosomes Ancoratge a la maquinària ribosomal per 5’.
4. Contribució al transport al citoplasma.
Modificacions del mRNA eucariotes.  Modificació en l’extrem 5’ per l’addició de l’estructura de cap i l’addició a l’extrem 3’ de la cua poli A. Concretament aquesta modificació s’afegirà al final del tot el procés però abans s’han d’eliminar els introns.
Splicing Procés d’eliminació d’introns. Els gens eucariotes estan fragmentats. Les regions codificants o exons estan separades per regions no codificants o introns. Quan té lloc el procés de transcripció, aquesta estructura es manté i obtenim el que rep el nom de transcrit primari o pre-mRNA. Aquests transcrits primaris o pre-mRNA són uns mRNA que a la cèl·lula tenen una vida mitja més curta, de seguida maduren i formen els mRNA madurs. El procés es coneix com a tall i unió o splicing i consisteix (en un principi) en eliminar les regions intròniques i unir els diferents exons fins donar lloc a un mRNA madur sense exons, amb exons units. Si ens quedem amb aquesta imatge, 15 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) l’eliminació dels introns (tallar en punts determinats) i unir els dos exons ha de ser un procés molt precís, s’ha de tallar exactament, s’ha de saber on s’acaba l’exó i on comença l’intró. Sinó estaríem ajuntant fragments que possiblement no donarien lloc a un mRNA que presentaria una pauta de lectura alterada i, per tant, possiblement codifiqués per una proteïna no funcional. Per tant el tall d’aquests introns i la unió dels exons ha de ser un procés molt estricte. S’ha de reconèixer molt bé el punt de tall i unió d’ambdós extrems.
Seqüències consens presents en els introns Quan s’han seqüenciat diferents introns que pertanyen a diferents gens es veu que tots ells presenten una seqüència consens, és a dir, si alineo diferents seqüències tant a l’extrem 3’ com 5’ dels introns hi ha una sèrie de nucleòtids són gairebé els mateixos en totes les seqüències. Es pot extreure una seqüència consens, és a dir, tots presentaran la mateixa seqüència. S’ha vist que tant a l’extrem 5’ dels introns com a l’extrem 3’ es troben les seqüències consens, és a dir, aquelles seqüències que seran reconegudes per la maquinària que tallarà aquests introns i que unirà el exons. La seqüència de tall i unió situada en 5’ de l’intró conté dos nucleòtids que estan a dins de l’exó.
Aquesta seqüència rep el nom i està just en el punt on es talla lloc de tall i unió en 5’ o connexió donadora. En 3’ també tinc una seqüència consens i no està tan ben conservada (n pot ser qualsevol nucleòtid i Pi pot ser un tros de Polipirimidina i N pot 16 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) variar uns quants nucleòtids entre un intró i un altre). Aquesta seqüència consens en 3’ també agafa un nucleòtid de l’exó i rep el nom de lloc de tall i unió en 3’ o connexió acceptora. A més de les seqüències consens en 5’ i 3’ trobem una seqüència consens a l’interior de l’intró normalment més propera a l’extrem 3’ que no pas a l’extrem 5’ anomenada punt de ramificació. Aquest punt de ramificació en eucariotes inferiors, llevats està molt ben conservat i en canvi en eucariotes superiors o mamífers està menys ben conservat. N pot ser qualsevol nucleòtid, R pot ser qualsevol purina i el que està molt ben conservat en el punt de ramificació és un nucleòtid, concretament l’adenina. Aquest nucleòtid és crític perquè es dugui a terme el procés d’eliminació dels introns.
Esquema general de la reacció d’eliminació d’introns del grup III Per entendre el paper que juguen les seqüències consens hem de veure com tenen lloc des d’un punt de vista químic el procés d’eliminació d’introns (del grup 3, presents als pre-mRNA o transcrits primaris).
El procés pel qual s’eliminen aquests introns del grup 3 està esquematitzat: Dues reaccions de transesterificació successives. Trencarem dos enllaços fosfat però formarem dos enllaços fosfat. De quina manera?  en verd tenim els exons i el lloc de tall i unió en 5’ o connexió donadora amb la seva seqüència consens corresponent, en 17 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) groc tenim representat l’intró amb el punt de ramificació o seqüència consens del punt de ramificació i a continuació vindria el segon exó.
- La primera reacció de transesterificació consisteix amb un atac del grup hidroxil de la posició 2’ de la ribosa d’aquest nucleòtid d’adenina del punt de ramificació.
Aquest grup hidroxil és el que inicia el procés (d’aquí la importància del punt de ramificació i del nucleòtid d’adenina). Aquest grup hidroxil en posició 2’ de la ribosa del nucleòtid d’adenina ataca nucleofílicament al enllaç fosfodièster trobat al límit entre exó i intró a l’extrem 5’ de l’intró. Aquest atac nucleofílic trenca aquest enllaç fosfodièster i alhora allibera l’exó 1 però paral·lelament aquest grup hidroxil queda unit mitjançant un enllaç fosfodièster 2’  5’ a aquest grup fosfat o en aquest nucleòtid en el punt on s’ha efectuat el tall.
Per tant, en la primera reacció de transesterificació allibero l’exó 1 i queda l’exó 2 unit encara a l’intró però aquest com ha format un enllaç 2’  5’. Nucleòtid d’adenina.
Enllaç fosfodièster 2’  5’. S’enganxa l’adenina amb la guanina, continua per l’altre costat cap a l’extrem 3’. El enllaç fosfat que he perdut que unia el intró i exó el conservo mitjançant aquest enllaç fosfodièster 2’  5’ entre nucleòtid d’adenina pel punt de ramificació i aquesta guanina de l’extrem 5’ de l’intró.
- En una segona reacció (de transesterificació), passa exactament el mateix. Però passa que el grup hidroxil en 3’ (del nucleòtid que tenim a l’extrem 3’ de l’exó que hem alliberat) ataca nucleofílicament l’enllaç fosfodièster que uneix l’intró amb l’exó 2. Passa un altre cop que aquest enllaç fosfodièster es trenca i amb la qual cosa alliberem l’intró. Amb la qual cosa es forma un nou enllaç fosfodièster normal 3’  5’ que uneix els dos exons. Eliminem l’intró i unim els dos exons.
Aquí partim d’una estructura que té dos enllaços fosfodièster i acabo el procés amb dos enllaços fosfodièster. El procés en el seu conjunt és conservatiu des del punt de vista d’enllaços fosfodièster, mirant el nombre d’enllaços fosfodièster formats.
Els enllaços trencats a cantó i cantó de l’intró es reformen quan es fusiona l’exó i l’altre es manté a l’estructura de llaç, l’enllaç fosfodièster 2’  5’ de l’intró.
Components de la maquinària de tall i unió (espliceosoma) L’espliceosoma està format per 5 snRNAs i unes 150 proteïnes (generals, específiques i no-snRNP).
snRNAs: - Realitzen moltes de les funcions de l’espliciosoma Presenten CAP trimetilat Són exportats al citosol, s’associen amb components proteics i són re-importats al nucli 18 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) En teoria, per dur a terme aquestes dues reaccions de transesterificació no caldria aport d’energia en forma d’ATP. Sempre conservem el nombre d’enllaços fosfat, i si això és així en principi no caldria aport d’energia en forma d’ATP però sí la necessitem per ensamblar tota la maquinària que finalment podrà catalitzar aquestes dues etapes de transesterificació. Aquesta maquinària que pot dur a terme el procés d’eliminació d’introns s’anomena spliceosoma o maquinària de tall i unió.
En aquesta maquinària de tall i unió participen uns RNAs, que són els RNA nuclears petits. Dins d’aquesta maquinària de tall i unió trobem cinc RNA nuclears petits que estan batejats com a U1, U2, U5, U4 i U6. Aquests RNA nuclears petits són els que jugaran un paper important en el procés d’eliminació d’introns. Com molts RNA no van tot sols, van acompanyats d’una sèrie de partícules ribonucleiques nuclears petites.
Aquestes partícules ribonucleiques nuclears petites estan formades cada una d’elles per un RNA nuclear petit i per tant: - Parlarem de la partícula U1 quan porti aquest RNA nuclear petit.
Parlarem de la partícula U2 quan porti el RNA nuclear petit U2 Parlarem de la partícula U5 quan porti el RNA nuclear petit U5 Parlarem de la partícula partícula U4/U6 perquè porta dos molècules de RNA, els quals estan formant aparellament de bases.
Tenim doncs, 4 partícules i 5 RNA. Partícula U1 porta un U1RNA i així amb tots excepte la partícula U4/U6 que porta dos RNA (U4 i U6).
Aquests RNA mai van sols, sinó que van associats a diferents proteïnes. Que formen part d’aquestes partícules, a banda dels RNA tenim a cada partícula un RNA concret nuclear petit. Cada partícula està formada per aquest RNA associat a un conjunt de proteïnes anomenades generals. Aquestes, totes les proteïnes generals són les mateixes per aquestes partícules.
Un conjunt de proteïnes específiques també formen part de les partícules i aquestes són diferents per cada tipus de partícula. Per exemple, U2 portarà les mateixes proteïnes generals que U1 però diferents proteïnes específiques.
Perquè es dugui a terme el procés de tall i unió, a banda de RNA petits i proteïnes generals o específiques participen tot un altre conjunt de proteïnes que molts cops són específiques de pre-RNA anomenades proteïnes no-snRNP. Aquestes proteïnes no formen part de les partícules ribonucleiques nuclears petites. Conjunt de proteïnes batejades amb el nom de que no formen part de manera directa de les partícules de RNA ribonucleiques petites.
19 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) D’aquesta manera, tenim els RNA nuclears petits, les proteïnes específiques de cada partícula, les proteïnes generals i fora de la partícula tenim un conjunt de proteïnes no sn-RNP.
Aquests RNA nuclears petits fan diferents funcions dins de l’estructura de maquinària de tall i unió.
Tots ells, com si fossin missatgers porten una estructura de cap en 5’ metilada (3 grups metil) i malgrat que fan la seva funció a l’interior del nucli són transcrits a l’interior del nucli però surten cap al citosol i es carreguen les proteïnes corresponents formant les partícules i un cop són partícules tornen a entrar al nucli. Es creu que aquest procés de sortir i entrar al nucli és un mecanisme de control de que les partícules han estat correctament ensamblades. Fan el paper crític d’eliminar introns i ho han de fer de forma precisa. Dins d’aquestes partícules tenim funcions concretes associades a cadascun d’aquests RNA o partícules.
- La partícula U1 reconeix a través del seu RNA l’extrem 5’ del intró i també l’extrem 3’, els quals s’han de tallar i empalmar.
La partícula U2 reconeix amb el seu RNA el punt de ramificació i forma aparellament de bases amb la seqüència del punt de ramificació.
La partícula U5 reconeix l’extrem 5’ i 3’ i substitueix el paper que feia la U1 en un principi.
La partícula U4/U6 (formant aparellament de bases) U4 té com a funció emmascarar l’activitat que tindrà el RNA nuclear petit U6 el qual un cop se separa de U4 és el que es creu que catalitza les dues etapes de transesterificació anteriors.
Esquema formació partícula tall i unió (espleciosoma) Com es construeix tot aquest espleciosoma o partícula de tall i unió? (es necessita ATP).  Tenim en verd un exó i en groc un intró, després tornem a tenir un altre exó.
La A indica el nucleòtid d’adenina situat al punt de ramificació. El procés d’ensamblatge d’aquesta maquinària de tall i unió comença per l’entrada de la partícula U1. Aquesta partícula U1 a través del seu RNA reconeix l’extrem 5’ de l’intró 20 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) i el 3’ de l’intró, comença a acostar els extrems perquè posteriorment siguin tallats.
Perquè pugui entrar aquesta partícula de moment no necessitem ATP.
Ara bé, un cop ha entrat la primera partícula, després entra la segona partícula U2 i perquè entri aquesta segona partícula ja necessito hidròlisi d’ATP, l’he de trencar i formar diferents enllaços. Aquesta partícula U2 reconeix la seqüència del punt de ramificació i per tant s’associa a través del seu RNA que forma aparellament de bases amb aquest punt de ramificació en aquesta posició. I necessito també en aquesta etapa, aquestes proteïnes no-snRNP. Concretament, les primeres etapes són les que es coneixen més bé del procés i el que es coneix amb el nom de factor auxiliar U2 i el que es coneix amb el nom de factor d’splicing 1 i factor d’splicing 3. Això el que fa és que aquests RNA són petits i s’associen o formen aparellaments de bases en diferents punts de pre-mRNA i hi ha poc tros d’aparellament. Necessiten diferents proteïnes que ajudin a ancorar i posicionar correctament aquestes partícules.
A partir d’aquí, un cop s’ha fixat la partícula U2 entren la resta de partícules. Per un cantó la U5 i per un altre cantó la U4/U6. En aquesta etapa també necessitem hidròlisi d’ATP perquè anem trencant i formant interaccions entre proteïna i RNA, entre RNA i RNA i entre proteïna i proteïna. És una estructura molt dinàmica, es trenquen i formen interaccions contínuament. Aquesta maquinària ha de reconèixer tots els pre-mRNA que han de ser processats. Per tant, moltes vegades necessitarem la participació d’alguns d’aquests factors i d’altres vegades d’altres factors perquè es reconegui i se sàpiga com s’ha de processar aquest transcrit primari. Després veurem que un mateix transcrit primari pot ser processat de diferents maneres.
Un cop han entrat les partícules U4/U6 i la U5, com hem dit que la U5 acosta els extrems 3’ i 5’ substitueix el paper que feia la partícula U1 que se’ns envà del complex (marxa tot). I també se’ns trenca l’aparellament de bases entre el RNA de U4/U6 i el RNA de U4 també surt del complex (marxa l’RNA segur però encara no es coneix prou bé aquestes etapes i no sabem si marxa tot) amb la qual cosa U6 pot formar un nou aparellament de bases amb U2 i quan U6 queda lliure i forma aquell nou aparellament de bases amb U2 és quan tenim el complex o se’ns forma el complex catalíticament actiu, és a dir, el que pot dur a terme les dues etapes de transesterificació descrites abans. U6 adquireix la seva capacitat catalítica quan es desprèn de U4 i s’uneix a U2.
A partir d’aquí, tallem el primer exó i ens queda el segon unit a l’intró i posteriorment entrem a la segona etapa: unió dels exons i alliberament de l’intró. Molts cops els introns són degradats.
No tots els transcrits primaris es processen de la mateixa manera.
Conjunt d’aparellaments que tenen lloc en formar-se l’espliceosoma Regió consens i interacció amb U1. Interacció amb U2 (només el RNA) que forma aparellament de bases excepte l’adenina perquè sinó no podria fer l’atac nucleofílic.
Tenim l’exó, tot això d’aquí és l’intró i acaba amb l’altre exó. Aleshores, hem dit que U1 ens acosta els punts de tall i unió i interacciona tant amb l’extrem 3’ com 5’ de l’intró.
Necessitem proteïnes que ajudin a estabilitzar les interaccions. Un cop ha entrat U1 entra U2 i U2 forma aparellament de bases amb el punt de ramificació (indicat amb l’A). Un cop ja han entrat U1 i U2, entra U5 i U5 ens acosta 3’ i 5’, i U1 salta. En principi, U4 i U6 estan formant aparellament de bases. On entra U4 i U6 junt amb U5 aquest aparellament entre U4 i U6 es trenca, U4 s’allibera i U6 forma aparellament de 21 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) bases amb U2. Arribem al complex catalíticament actiu i pot eliminar de les dues etapes de transesterificació.
Tipus de splicing 22 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Fins ara hem vist des d’un punt de vista químic com s’eliminen els introns, hem vist com s’ensambla la maquinària per eliminar els introns del grup III. Fins ara ens hem cregut que dels transcrits primaris s’eliminaven tots els introns i es fusionaven els exons. De fet, això és cert quan es dóna el mecanisme d’splicing constitutiu. Tenim un fragment de DNA amb els tres exons separats pels introns corresponents. Això es transcriu i donarà lloc al pre-mRNA que té exactament la mateixa estructura. La connexió en 5’ de l’intró s’anomena connexió donadora i la connexió localitzada a l’extrem 3’ s’anomena connexió acceptora.
L’splicing constitutiu implica sempre unions entre connexions donadores i acceptores consecutives, amb la qual cosa s’eliminen els introns i s’uneixen tots els exons.
De vegades, l’splicing es dóna pel mecanisme d’splicing alternatiu. Són unions entre connexions donadores i acceptores no consecutives. No la que té exactament al costat i això implicaria la unió dels exons 1 i 3, s’eliminarien els introns però també s’eliminaria l’exó 2.
El mecanisme de splicing, per tant, és un mecanisme que elimina introns i de vegades també exons (parts catalogades com a codificants). Com més exons participen en aquest mecanisme alternatiu més mRNA puc obtenir madurs. Hi haurà transcrits primaris que es podran processar de manera constitutiva i el mateix transcrit primari en un altre tipus de cèl·lula o depenent de l’estadi de desenvolupament de la cèl·lula pot ser processat amb un mecanisme alternatiu.
Dit d’una altre manera, a partir d’un únic gen puc aconseguir més d’un mRNA madur i per tant puc aconseguir més d’una proteïna. Aleshores, això és un dels aspectes que parlàvem al començament del tema 2. Els humans tenim un nombre de gens similar als d’una mosca o cuc i no s’entenia que parléssim d’espècies més evolucionades o situades més amunt en l’escala evolutiva si tenien el mateix nombre de gens o inclús inferior que altres espècies menys evolucionades o situades més avall a l’escala evolutiva. Es creu que justament aquesta possibilitat d’obtenir més d’un mRNA madur a partir d’un únic gen, més d’una proteïna, permet obtenir més variabilitat en organismes situats més amunt en l’escala. Dels gens eucariotes un 90% aproximadament experimenta o són transcrits primaris que experimenten splicing alternatiu. Com més exons participin en aquest procés d’splicing alternatiu més probabilitats tindré d’obtenir missatgers diferents i per tant proteïnes diferents o lleugerament diferents perquè variaran en determinades parts.
Tipus d’splicing alternatius (diferents mecanismes) En aquesta imatge d’aquí podem veure els diferents mecanismes coneguts d’splicing alternatiu. En un mateix gen es pot donar que uns exons siguin processats de manera constitutiva, uns altres per un mecanisme d’splicing alternatiu, uns altres per un altre mecanisme d’splicing alternatiu. Per tant, quan combinem tot això podem obtenir una variabilitat de mRNA madurs brutal.
Aleshores, en aquest esquema trobem els quadrats que representen exons i la línia contínua negra representa els introns. Les línies de dalt o sota representen diferents possibilitats de processament d’aquests suposats transcrits primaris.
El primer dels mecanismes d’splicing alternatiu és el que es coneix amb el nom de mecanisme d’splicing per exons combinatoris o exons de cassets alternatius. En 23 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) aquí ens hem d’imaginar cada exó com un bloc de informació que puc incorporar o no al meu mRNA madur. A l’exemple, l’exó blau pot ser incorporat i tindríem el exó 1 enganxat al 2, el 2 amb el 3, el 3 amb el 4 i el 4 amb el 5. Però també es podria donar que l’exó no s’incorpori i s’enganxaria el 1 amb el 2, el 2 amb el 4 i el 4 amb el 5. Amb un únic transcrit primari es poden obtenir dos missatgers madurs.
Només tenim dibuixat un sol exó que participa al procés de splicing alternatiu (seria com un constitutiu). Si hi ha més d’un pots incorporar un o l’altre, tots dos o cap. Si hi ha tres anar fent les combinacions. De tal manera que si n és el número d’exons que participen en el mecanisme d’exons combinatoris podem arribar a obtenir 2n mRNA madurs.
Per tant, mitjançant splicing alternatiu a partir d’un únic gen es poden obtenir diversos mRNA i per tant diferents proteïnes. Aquestes proteïnes reben el nom de proteïnes isomorfes. Són proteïnes que poden ser relativament similars entre elles però que li poden faltar un tros més gros o més petit segons els exons que contingui o fins i tot poden no tenir funció.
El següent mecanisme és el de exons mútuament excloents. Aquest mecanisme implica sempre dos exons que estan un al costat de l’altre (1 i 2). En aquest cas, l’entrada d’un dels exons implica obligatòriament l’exclusió de l’altre. Si es processa d’aquesta manera, el 2 forçosament s’ha d’unir amb el 3 perquè el que tenim numerat amb el número 2 queda exclòs. Si unim el 1 amb el 3 forçosament s’exclou el número 1. Per tant, si s’inclou el 1 s’exclou el 2 i si s’inclou el 2 s’exclou el 1.
En aquest mecanisme podem parlar de l’existència d’un fals intró i aquest el tenim entre els exons mútuament excloents. Perquè se l’anomena fals intró?  Perquè és un intró que mai eliminem per la seva connexió donadora amb la seva acceptora. Si l’elimino però mai per unió entre la seva connexió donadora i acceptora d’aquest intró situat entre els dos exons mútuament excloents. Si jo processo això i elimino l’intró. Si processo així elimino l’intró. Aquest intró entre els dos exons mútuament excloents.
Sempre perdo l’intró però no el perdo mai per unió de la seva connexió donadora i acceptora. Per això diem que l’intró que connecta els exons mútuament excloents és un fals intró, perquè sí eliminem l’intró però mai l’elimino per unió de la seva connexió donadora i acceptora. O s’utilitza la connexió donadora o la connexió acceptora, però mai totes dues alhora.
Un altre mecanisme implica la retenció d’introns. Aquest intró retingut està de color vermell. Fins ara estàvem eliminant exons o parts codificants en aquest mecanisme incorporem la part que en principi no és codificant (intró). Es pot processar el transcrit primari on s’elimina l’intró i és com un mecanisme “constitutiu” però si s’uneix el 1 amb el 2 i el 2 amb el 3 s’uneixi no per eliminació d’introns sinó perquè es reté l’intró. A partir d’aquí, els termes d’exó codificant i intró no codificant es fan ambigu.
En aquest cas perquè el mRNA sigui funcional, l’intró retingut ha de conservar la pauta de lectura perquè sinó donarà lloc a un mRNA que pot ser truncat o donar lloc a una proteïna que no correspon.
A banda d’aquests tres mecanismes d’splicing alternatiu en tenim d’altres.
Anteriorment sempre estàvem tallant i enganxant exons en el límit entre d’exó i intró.
Els altres dos mecanismes (2 i 3 de l’esquema) impliquen la presència de connexions donadores o acceptores (4 i 5) dins dels exons. Els termes intró i exó 24 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) es fan ambigus. En aquest cas els quadrats eren exons i les ratlles introns, les ratlles de sota i sobre diferents maneres de processar. La part groga i la part blava.
L’exó 3 té una part groga i blava i es pot processar el transcrit primari agafant el límit de l’exó (connexió donadora) entre el límit entre exó i intró i també presenta una connexió donadora interna (es pot processar agafant aquesta connexió donadora interna). Puc tenir una unió dels 5 quadrats grocs o bé dels exons grocs més un axó central que pot ser més gros o més petit depenent de la connexió donadora que agafem. Si agafo la connexió donadora de dins de l’exó perdo la part blava  processament de la part superior. Si agafo la connexió donadora situada al límit entre exó i intró i obtinc un mRNA madur on aquest exó és més llarg. El mateix passa per connexions acceptores. Puc tenir una connexió donadora ben bé al límit entre exó i intró i puc tenir una connexió acceptora interna. En un cas obtinc els quadrats grocs exclusivament i en l’altre cas s’inclou el blau. Els termes de exó com part codificant i intró no codificant es ambigu. Hi ha casos als quals la connexió donadora és més forta i en algunes circumstàncies es selecciona una de les altres. Hi ha altres casos on la connexió acceptora o donadora feble que es seleccionen.
El cas 6 i 7 estan relacionats amb l’existència de més d’una regió promotora i més d’una regió de finalització de la transcripció i són l’splicing condicionat a l’existència de més d’un promotor o d’un lloc de finalització de la transcripció. En aquest cas tenim un promotor abans del primer exó i un promotor abans del segon exó. Si la transcripció comença en el primer promotor això condiciona a que s’incorporin al mRNA madur els exons 1, 4 i 5. Si comença al segon promotor, s’incorporen els exons 2, 3 i 5. El mateix succeeix en funció de la regió on acabi la transcripció  Depèn on acabi la transcripció el transcrit primari es processarà d’una manera o altre. Si acaba en la primera regió de finalització s’incorporen els exons 1, el 2 i el 3 i si acaba a la segona regió de finalització s’incorporaran els exons 1, 2, 4 i 5. L’splicing alternatiu vindrà condicionat pel punt on s’inicia el procés de transcripció o bé el punt on finalitza aquest procés de transcripció.
Tots aquests mecanismes d’splicing alternatiu es poden donar en un mateix transcrit primari (no és que alguns es donin per constitutius, altres per combinatoris...). Amb la qual cosa, si combinem els diferents mecanismes es poden produir múltiples i diferents mRNA madurs i per tant diferents proteïnes isomorfes. Les proteïnes que procedeixen per splicing alternatiu reben el nom de proteïnes isomorfes.
El significat de tot això és que produïm moltes proteïnes i aquestes, evidentment, tenen diferents funcions. Quan s’estudia l’efecte de l’splicing alternatiu sobre la funció de les proteïnes finals a partir d’aquests gens es veu com es poden classificar en cinc grans grups.
25 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Classificació dels efectes funcionals de tall i unió alternatius 1. Localització cel·lular de les formes proteiques isomorfes. Segons com sigui processat el transcrit primari les proteïnes que procedeixen d’aquest transcrit primari poden tenir una diferent localització cel·lular. Pot haver proteïnes que es quedin a l’interior de la cèl·lula, que vagin a parar a la membrana cel·lular, que vagin a un orgànul concret, que surtin a l’exterior cel·lular (secretades). Decidim el destí de la proteïna en qüestió. En algunes cèl·lules es quedarà a dins i en altres anirà a parar a fora.
2. Supressió de l’activitat proteica. Pot passar que el transcrit primari sigui processar de tal manera que doni lloc a un mRNA que quan és traduït a proteïna doni una proteïna que no tingui funció. Té molt sentit, no en cèl·lules somàtiques però sí germinals. Per exemple, el color dels ulls de les Drosophiles poden estar condicionades per un transposó. Els transposons codifiquen per una transposasa.
Les mosques no neixen amb un color d’ulls i quan es tornen adultes passen a tenir un altre color d’ulls però el que sí es dóna és que neixin mosques amb diferent color d’ulls. El que passa aquí és que el gen de la transposasa (enzim responsable del moviment dels transposons) canvia en la cèl·lula embrionària. En les cèl·lules adultes la transposasa perd la seva funció. Pot tenir sentit en cèl·lules en desenvolupament, que s’hagin de diferenciar...
3. Modificació de l’activitat proteica o capacitat d’unir lligands. Tall i unió hi ha més casos i més exemples. En el fons tenim un únic gen, un mateix transcrit primari i estem seleccionant diferents fragments. El més normal és que canviï la funció d’una proteïna en concret. És el cas dels isoenzims, els quals catalitzen exactament la mateixa funció però tenen diferents constants catalítiques. Alteren 26 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) els llocs de determinades proteïnes per unir-se a lligands o factors al·lostèrics.
Canvia fragments de la proteïna i la això canvia seva capacitat de unir-se a lligands, proteïnes, modulant la seva activitat proteica.
4. Creació de noves activitats proteiques. (veurem un exemple més endavant) 5. Estabilitat de m-RNA i eficiència traduccional. Altera l’eficiència en que els mRNA són traduïts. Els mRNA presenten a l’extrem 5’ una part que no és traduïda.
Aquest extrem 5’ pot contenir introns i exons, la qual cosa està subjecte a splicing alternatiu. En aquest cas, la part codificant serà idèntica i donarà lloc a proteïnes exactament iguals però en canvi si que canvia l’extrem 5’, segons com sigui processat aquest extrem 5’. Canviem la longitud d’aquest extrem 5’ i això afecta l’estabilitat del mRNA i la velocitat a la qual pot ser traduït. Si és més llarg o més curt serà més ràpida o més lenta la velocitat de traducció per part dels ribosomes.
Modifiquem l’expressió del gen.
Exemple splicing alternatiu: troponina T La troponina T és una subunitat de la troponina (proteïna que participa en el procés de contracció muscular). La troponina està formada per la troponina C, la troponina I i la 27 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) troponina T. El gen que codifica per la subunitat de troponina T de la troponina està format per 18 exons i d’aquests 18 exons el 1, 2 i 3 són processats de manera constitutiva. Tots tindran un extrem 5’ amb seqüència idèntica. El mateix passa amb els exons que van del 9 al 15, aquesta part també serà idèntica a tots els mRNA.
Els exons que es mouen del 4 al 8 són exons combinatoris i hi ha 5. Puc arribar a tenir 2n mRNA o proteïnes obtingudes diferents (possibilitat, no és que es donin). 5 exons combinats de diferents maneres. Vaig fent totes les combinacions diferents i puc arribar a tenir 32 formes isomorfes (només amb els exons combinatoris).
A més a més els exons 16 i 17 que són processats mitjançant el mecanisme de exons mútuament excloents, si s’incorpora el 16 el 17 no s’incorpora i a l’inrevés. Quan s’incorpora el 16 tinc una forma alfa de la troponina C, present al múscul esquelètic adult. Quan s’incorpora l’exó 17 obtenim la forma beta de la TnT, la qual es presenta al múscul embrionari. D’aquesta manera, en un mateix transcrit primari realitzem diferents mecanismes de processament dels exons  mecanisme que dóna molta variabilitat proteica. Al final pots arribar a formar 64 transcrits madurs i per tant 64 proteïnes isomorfes diferents.
Quin sentit té això?  tenim tres regions principals: - - Un domini sense variabilitat, que pertanyen als exons processats de manera constitutiva, és una part important per la funció de la proteïna perquè no varia. S’ha vist que va de l’aminoàcid 37 al 228 i té capacitat d’unió a tropomiosina i a troponina 1. És un domini crític per la funció de la proteïna.
Domini codificat per exons combinatoris (pot canviar molt). Té capacitat d’unió a tropomiosina i constitueix una regulació fina de la contracció muscular.
Domini variable format pels exons mútuament excloents té capacitat d’unió a la troponina C i la tropomiosina en funció de la concentració de calci que té el celula muscular. Té propietats reguladores que molt probablement fan falta en moltes etapes del desenvolupament. Ja que dèiem que la forma alfa està present al múscul esquelètic adult i la beta al múscul embrionari.
D’aquesta manera, veiem un exemple de com tot el conjunt de funcions possibles derivades d’aquest splicing alternatiu al qual estem canviant la funció de la proteïna tot i que participi al mateix procés de contracció muscular.
Calcitonina Permet generar proteïnes diferents, el gen de la calcitonina. Aquesta és una hormona que participa en el procés de recaptació dels nivells de calci. El gen que codifica per la calcitonina està format per 6 exons que són els requadres de l’esquema separat pels introns corresponents. El processament del transcrit primari està condicionat a l’existència de dos llocs de finalització de la transcripció (poliA). Després del quart exó i el sisè exó. Aquest gen s’expressa en dos tipus cel·lulars diferents: - A les cèl·lules de tiroïdals i en aquest cas la transcripció acaba al primer lloc de finalització de la transcripció. Això significa que al mRNA madur s’incorporen els quatre primers exons. A cèl·lules de tiroides el mRNA madur és traduït i obtenim el precursor de la calcitonina (hormona). Per obtenir la hormona sencera aquesta proteïna obtinguda ha de ser processades mitjançant la digestió per proteases (enzims que trenquen enllaços peptídics, en aquest cas interns) i sobre aquest 28 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) - precursor de la calcitonina talla l’extrem N-terminal i C-terminal i la part del mig pertany a la hormona activa (modificació post-traduccional).
A les cèl·lules nervioses (cervell) la transcripció termina al segon lloc de terminació. Això implica que els exons incorporats en aquest mRNA madur seran el 1, 2, 3, 5, i 6. El mRNA madur format en aquestes cèl·lules de teixit nerviós és traduït també però dona lloc a una proteïna precursora del pèptid relacionat amb el gen de la calcitonina (no precursor de la hormona calcitonina). De nou necessitem un trencament proteolític i una maduració precursor on es tallin els extrems N i C terminal i s’alliberi el pèptid central. Aquest últim (anomenat relacionat amb el gen de la calcitonina), un cop alliberat no té cap funció lligada amb l’hormona sinó que té una funció neuromoduladura, participa en el sentit del gust. El processament del transcrit primari ve condicionat pel lloc de terminació de la transcripció, exemple on acabem produint dos proteïnes amb activitats completament diferents.
Regulació del tall i unió alternatiu 1- Canvis en les concentracions o activitats dels factors generals o específics que participen en el procés: Exemples: - - Factors generals: heterogeneïtat de seqüència en els gens que codifiquen els RNAs nuclears petits que pot implicar diferent afinitat o capacitat per reconèixer les regions donadores i acceptores Factors específics: Factors 2 de tall i unió 29 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) La pregunta del milió és com es seleccionen uns llocs de tall i unió respecte els altres? És a dir, dins de la cèl·lula si la maquinària que elimina aquests introns dels mRNA dels introns de tipus III és sempre el mateix spliceosoma, com aquesta mateixa maquinaria en un tipus cel·lular o depenent de com estigui la cèl·lula fa un processament o un altre? Com es regula el tall i unió alternatiu?  no es prou ben conegut encara però s’ha vist que participen o estan implicats els canvis de les concentracions de les activitats dels factors generals o específics.
Com s’ensambla la maquinària, a les partícules ribonucleiques nuclears petites participen els RNA petits i participen un conjunt de proteïnes que són les mateixes i unes específiques. A més a més tenim les proteïnes que no formen part de les partícules. Doncs bé, canvis en les concentracions ja sigui dels factors generals (de les partícules) o dels altres factors poden condicionar l’elecció d’un lloc o altre de tall i unió.
Per exemple, s’ha vist que els RNA petits estan presents en múltiples còpies i hi ha petites diferències de seqüència entre ells. Tinc tota una població de RNA nuclears petits tenen petites diferencies de seqüències (heterogeneïtat de seqüència). Com són encarregades de reconèixer les seqüències consens en 3’, 5’ del punt de ramificació si canvia una mínima part de la seqüència això pot afectar a la capacitat de reconeixement de les seqüències consens. Per tant, una manera de poder seleccionar una seqüència consens respecte l’altre pot venir condicionada pel fet que els factors generals de RNA nuclears petits presentin aquesta heterogeneïtat de seqüència. Pot alterar la capacitat de reconeixement de connexions donadores o acceptores.
Un altre factor que pot afectar (en canvis de concentracions o activitats) poden ser els factors específics, per exemple el factor de tall i unió 2. Suposem un exó que presenta dues connexions donadores: Una connexió donadora forta interna i una dèbil que es troba en el límit entre exó i intró. Quan la concentració d’aquest factor d’splicing 30 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) és baixa, predomina la unió entre la connexió donadora forta i la següent acceptora.
En canvi, quan aquesta concentració de factor d’splicing és alta predomina la dèbil.
Processament diferent. Tenim un pre-mRNA que pot ser processat de diferents maneres i quan tenim baixa concentració del factor el pre-mRNA no es processa.
Quan la concentració del factor augmenta el pre-mRNA és processat. Això condiciona la selecció o la manera de com es podran seleccionar les diferents connexions donadores i acceptores.
2. Regulen el procés de tall i unió alternatiu una sèrie d’elements en cis i en trans.
Presència de proteines reguladores específiques.
- Elements en cis: seqüències dins del transcrit primari Tenim seqüències intensificadores d’splicing i seqüències silenciadores de splicing. Aquestes seqüències les puc tenir tant les unes com les altres en regions dels exons o dels introns.
- Trans: proteïnes que reconeixeran aquestes seqüències en cis. S’estan estudiant actualment i no es coneixen gaire. Les més ben estudiades són la família de proteïnes riques en aminoàcids de serina i arginina (SR).
Com funciona tot això?  Suposem que tenim un lloc repressor del procés de splicing, concretament del reconeixement de una determinada connexió donadora. Quan tinc la seqüència però no tinc l’element en trans, la proteïna que reconeix aquest repressor permet que la maquinària de splicing s’enganxi i es reconegui, es digui a terme el procés d’splicing. Si tenim un repressor, es reconeix la sequència i dificulta que la maquinària d’splicing s’uneixi i es dóna un procés d’splicing diferent.
31 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) Proteines activadores: tenim un intensificador d’splicing però no tinc la proteïna que es pot unir al intensificador d’splicing. Això dificulta l’entrada de la maquinària d’splicing.
En canvi, si tenim aquesta proteïna que activa l’splicing o regió intensificadora i reconeix aquesta regió i atrau els components de la maquinària de splicing, la qual cosa permet que es pugui dur a terme aquest processament.
La maquinària de tall i unió sempre es realitza mitjançant unions o interaccions relativament febles, a la que canvio la concentració de qualsevol element afecto la selecció d’una connexió donadora o acceptora.
Fins ara hem comentat el mecanisme d’splicing pel grup 3 d’introns (mRNA eucariota) A banda dels introns del grup 3 hi ha introns del grup 1, 2 i 4: Els introns del grup 1 i els introns del grup 2 són autocatalítics (RIBOZIMS), és a dir, és el propi mRNA el que duu a terme el procés d’eliminació d’introns. Els introns del grup 1 els trobem en pre-rRNA ja siguin nuclears, mitocondrials o de cloroplasts. També en pre-tRNA bacterians i bacteriòfags.
- - - En aquest cas, en els de grup 1 simplement l’estructura del pre-rRNA que sigui participa un factor extern que és un nucleòtid de guanina, el qual ataca nucleofílicament el punt de tall i unió amb l’extrem 5’, allibera el primer exó que tindrà un grup hidroxil lliure i després em quedarà un nucleòtid de guanina unit al segon exó. Es dóna una reacció de transesterificació. Es fusionen els exons.
L’estructura del pre-rRNA que adopta és crítica, estructura secundària on es situa el nucleòtid de guanina perquè es pugui produir l’eliminació dels introns. Abans qui feia el tall era el OH de la ribosa del punt de ramificació i en aquest cas participa un nucleòtid extern que fa l’atac nucleofílic.
En el cas del grup 2 no participa un nucleòtid extern, simplement l’estructura secundària que adopta en aquest cas el pre-mRNA de mitocondris i cloroplasts.
Participen també alguns de bacterians i d’arqueus. Serveix per processar aquests pre-mRNA (els que trobem dins de mitocondris, cloroplasts, bacteris o arqueus). El processament es duu a terme simplement pel propi mRNA i és un ribozim, no cal la participació de nucleòtid extern. Tot i que diem que els introns són exclusius de eucariotes hi ha alguns bacteris que també en tenen.
Els del grup 3 és el que hem estat veient tota l’estona. Maquinària de tall i unió de l’spliceosoma. Permeten processar pre-mRNA nuclears.
Els del grup 4 funcionen per un mecanisme completament diferent del que hem vist. Serveixen per eliminar introns de pre-tRNA. Participen tot un seguit de proteïnes com endonucleases, lligases...
Addició de la cua de poliA a l’extrem 3’ dels mRNAs Els missatgers s’acaben modificant tant en 5’ i com per eliminació dels introns per l’extrem 3’. En aquest 3’ addicionem una cua de poliA (és a dir, un seguit de nucleòtids d’adenina afegits a l’extrem 3’).
Això es produeix perquè és un procés co-transcripcional (no post transcripcional). En eucariotes podem considerar que totes les modificacions que experimenten els mRNA són co-transcripcionals. Qui juga un paper important en atraure la maquinària d’eliminació d’introns, enzims que introdueixen l’estructura en 5’ i el complex enzimàtic que modifica l’extrem 3’?  és el domini C terminal de la RNA polimerasa 2. Aquest 32 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) domini C terminal de la RNA Pol2 té la capacitat d’atraure tots el complexos proteics responsables de les modificacions que experimenten els mRNA.
En aquest cas, per modificar l’extrem 3’ tenim un motlle de DNA en blau, bombolla de transcripció i la RNApol. Aquest domini C terminal atrau un complex enzimàtic que conté els enzims amb les diferents activitats. Aquest modificarà l’extrem 3’ del mRNA.
En aquest complex trobem un enzim que reconeix una seqüència rica en nucleòtids d’adenina que marca el punt a partir del qual afegim la cua poliA. Concretament indica que la endonucleasa que també forma part d’aquest complex talli entre 10 i 30 nucleòtids més avall de la cua poliA. Hi ha un enzim que permet el reconeixement d’aquesta seqüència. Una proteïna que reconegui aquesta seqüència, una amb activitat endonucleasa i una poliadenilat polimerasa (aquest enzim agafa nucleòtids d’ATP i va afegint entre 80-250 nucleòtids d’adenina, pot ser més o menys llarga) i aconseguim modificar l’extrem 3’ dels mRNA.
a) Complex enzimàtic que reconeix la seqüència senyal que marca el punt de tall després de la seqüència rica en A.
b) Tall per l’endonucleasa en un punt que es troba de 10 a 30 bases més avall de la seqüència rica en A.
c) Poliadenilat polimerasa: sintetitza una cua de poli A de 80 a 250 bases.
Aquesta modificació perquè serveix?  funcions poliadenilació dels mRNAs: 1- Protecció en front de la degradació per nucleases que actuïn sobre l’extrem 3’ 2- Pot actuar com a senyal per exportar els m-RNA cap al citosol 3- Ancoratge de l’extrem 3’ a la maquinària ribosomal pel prcés de traducció El cap protegeix per l’extrem 5’. Si tinc una cua poliA no és codificant i si es mengen unes quantes adenines no perdem informació essencial. Es creu que pot actuar com a senyal de que s’ha processat correctament aquest mRNA i està preparat per ser exportat cap al citosol i pugui ser traduït. Perquè els mRNA hagin de ser traduïts s’han de circularitzar i s’han de reconèixer tant els extrems 5’ com el 3’. Hi ha una proteïna que reconeix l’estructura en CAP 5’ i altre que reconeix la cua de poliA en 3’. Perquè 33 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) aquest missatger es pugui circularitzar i s’enganxi a la subunitat petita del ribosoma s’ha de donar el reconeixement de la cua poliA.
Edició del mRNA  participen els mRNA guia. En un d’aquests mecanismes d’edició dels mRNA és el que participen els RNA guia. L’edició dels mRNA es realitza quan ja s’ha acabat la maduració i de vegades canvia tant la seqüència del mRNA que sembla impossible que hagi estat codificat per un determinat gen.
Si intentem hibridar la seqüència del mRNA amb la del gen que l’ha originat no hi ha manera. Hi ha de diferents tipus de mecanismes d’edició del mRNA i en veurem 2: - - Edició del mRNA que provoca desaminacions, concretament participen en aquest procés un enzim anomenat citidina desaminasa  aquest catalitza pas de base nitrogenada de citosina de la cadena de mRNA, elimina el grup NH2 i el converteix en un grup carbonil (pèrdua de grup NH2) i es transforma la citosina en un uracil. canvio una base nitrogenada que es podia aparellar amb una guanina per una base nitrogenada que s’aparella amb una timina.
Altre enzim anomenat ADAR (adenosina desaminasa) actua sobre RNA i canvia el NH2 per un grup carbonil. Desaminació i passem d’adenina a inosina (les podem trobar als tRNA) i aquesta té facilitat per aparellar-se amb una citosina per ponts d’hidrogen. Canviem una adenina que es pot aparellar amb una timina per 34 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) una guanina que es pot aparellar amb una citosina. Això es dona en regions concretes del mRNA, no es dóna completament a l’atzar però el mecanisme pel qual es dona aquesta especificitat es desconeix actualment.
Té implicacions funcionals igual que el que és el mecanisme d’splicing, les desaminacions permeten que a partir d’un únic gen puguem tenir un mRNA que donarà lloc a diferents proteïnes segons si s’ha editat o no. No tenim diferents mRNA però sí diferents proteïnes.
D’altra banda, tenim per exemple al gen de la alipoliproteina B tenim 29 exons, concretament al triplet situat a la posició 2153 que codifica per la glutamina (aminoàcid) és CAA. El gen s’expressa de tal manera que el mRNA en cèl·lules hepàtiques el triplet es queda tal qual i en el fetge el mRNA es tradueix i dóna lloc a una proteïna amb 4563 aminoàcids. Aquesta apoliproteina que es produiex al fetge forma part de les proteïnes de baixa densitat, les quals participen al procés de transport, metabolisme de diferents tipuis de greixos i tipus de colesterol. En aquest cas aquesta proteïna formarà part de les LDL. Al budell s’expressa exactament el mateix gen i tinc exactament el mateix mRNA però al budell aquest triplet és editat i concretament la citosina és desaminada (canviada) i passa a uracil. Del triplet CAA que codificava per glutamina passem a UAA (codó de stop). A l’intestí el mRNA serà traduit però quan arribem a aquest triplet es pararà. La proteïna és molt més curta, sí te funció però en comptes de formar part de LDL forma part dels quilomicrons i és una altre lipoproteïna que emulsiona els greixos provinents de la ingesta. Al budell on arriben més greixos es formen aquests quilomicrons.
A partir d’un únic gen obtinc dues proteïnes diferents, en unes cèl·lules un mateix mRNA és editat i en altres cèl·lules no. No passa en tots els mRNA. Sobretot es va trobar en mRNA de mitocondris de tripanosomes.
A banda d’aquest mecanisme de desaminació, als altres processos d’addició participen els RNA guia o gRNAs.
Edició del RNA amb el gRNA  la informació genètica continguda en un RNA corregit deriva de dos “gens”: el que codifica el mRNA i el que codifica el gRNA En aquest cas, aquests gRNAs tenen una estructura concreta.
Presenten en 5’ una seqüència d’ancoratge que és complementària del mRNA que serà editat i posiciona aquest gRNA perquè es pugui produir el procés d’edició. La seqüència central presenta un cert nombre de desaparellaments i fa de motlle per dir en quins punts es modifica el mRNA. Per últim té una cua de oligoU i podria ser complementària a la cua de poli-A però no es coneix. La cua poli-A es creu que serveix per poder realitzar la cua poli-U.
Seqüència d’ancoratge complementària de la regió de mRNA editada i es forma aparellament de bases amb el gRNA. Seqüència central complementària que presenta 35 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) alguns desaparellaments i cua poli-U. Al punt on no hi ha aparellament entre bases de gRNA i mRNA, el mRNA queda tallat mitjançant una endonucleasa i es genera un extrem 3’ amb 5’ lliures. L’enzim transferasa terminal especifica de residus d’uracil (TUTasa) s’addiciona a l’extrem 3’ nucleòtids d’uracil. un cop addicionats, tants com missmatch hi havia, es tanca la cadena de RNA amb una RNA lligasa.
La informació que quedarà al mRNA editat provindrà dels gens que inicialment el codifica i el gen que codifica pel gRNA, aquest gRNA condiciona els canvis que es produeixen a partir de la seqüència central que té complementarietat parcial amb el mRNA que s’edita.
El procés de canvi és tan dràstic que el mRNA editat és gairebé impossible que es pugui aparellar amb DNA genòmic que el codificava.
Edició d’un mRNA amb gRNA i correspon pel mRNA que codifica per un enzim COX3 de tripanosoma. Aquest procés d’edició es dóna moltíssim. Tenim un gen codificat al 36 Natalia Mingorance García 3r Biologia – UdG UNYBOOK: nattymg23 BIOLOGIA MOLECULAR (GM) genoma per la ciclooxigenasa. RNA corresponent s’uneix al gRNA per complementarietat de bases i a la part central hi ha alguns punts que no tenen complementarietat de bases. A cada punt on no hi ha complementarietat s’uneixen uracils. La seqüència queda alterada substancialment. Quan s’acaba el procés d’edició es separa el gRNA. Tot un procés d’insercions de residus d’U i pot ser que hi hagi delecions de T. Tot lo vermell i lo blau son canvis en la seqüència respecte del gen inicial i no es pot aparellar amb el gen inicial. De vegades canvia tant que el mRNA obtingut finalment no es pot aparellar amb el seu gen original.
Possibles funcions del procés d’edició (conseqüències funcionals d’aquest gen d’edició) - - - - - 1- Produir més d’una proteïna a partir d’un únic gen o mRNA inicial  obtenir més d’una proteïna a partir d’un mateix mRNA inicial. Tinc un gen que dóna un mRNA i en un tipus cel·lular o un altre donarà una proteïna diferent perquè s’editarà diferent 2- Afectar l’expressió del gen  El procés d’edició afecta l’expressió dels gens: Traducció mRNA: substitució d’aminoàcids i introducció de codons inici/STOP  canvi de la pauta de lectura i seqüència d’aminoàcids diferents o inserció de codons d’stop Estructura mRNA: alteració unió proteïnes-RNA  alteració de l’estructura secundària del mRNA (responsable de la interacció amb determinades proteïnes).
Si són proteïnes que ajuden al procés de traducció no afecto l’expressió gènica.
Splicing pre-mRNA: creació de llocs de splicing alternatius  Pot ser un mRNA editat i que li canviï els llocs d’splicing. Si té la edició abans de l’splicing creo llocs d’splicing alternatiu.
Estabilitat mRNA: creació de dianes d’eliminació del RNA  puc alterar l’estabilitat del propi mRNA, com canvio tant la seqüència el temps de vida mitja pot tornar-se més baix, etiquetar cap a degradació, creació de dianes d’eliminació.
Interacció amb RNAi: canvis susceptibilitat unió del mRNA a un RNAi particular  puc afectar també la interacció amb microRNA que intenten silenciar l’expressió.
Tots aquests aspectes que estic alterant perquè canvio molt la seqüència del mRNA i s’afecta a qualsevol procés l’expressió gènica.
37 ...

Tags:
Comprar Previsualizar