Tema 3 - Blotting (II) - Detecció de mutacions en el DNA (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 16
Fecha de subida 26/03/2016
Descargas 20
Subido por

Vista previa del texto

Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 DETECCIÓ DE MUTACIONS I METILACIONS EN EL DNA Southern blot Amb la tècnica del Southern blot podem identificar la presència de seqüències concretes així com determinar la quantitat relativa d’aquestes seqüències (l’abundància, el número de còpies). També ens permet detectar canvis en les seqüències de DNA que afectin la grandària dels fragments de restricció (mutacions, RFLPs). Fins i tot podem detectar canvis epigenètics en aquestes seqüències (metilacions).
Detecció de RFLPs En un Southern blot hem de digerir per tal de tenir el DNA intacte i pur (bona qualitat) per així assegurar que el pas de fragmentar amb enzims de restricció específics de dianes concretes generarà un patró de tall repetitiu correctament.
En aquests casos és més versàtil l’ús del Southern abans que un Northern o un Western; el Southern posa de manifest que s’ha alterat un patró de restricció.
En definitiva; detectem RFLPs, polimorfismes en els fragments de restricció, els quals poden tenir diferents orígens: - - - Substitucions i pèrdues o addicions de nucleòtids que afectin dianes de restricció (RSP, restriction-site polymorphism; SNP, single nucleotide polymorphism). Si aquests nucleòtids afectaven a vies de restricció, el patró de tall pot variar, i passaríem a poder detectar: Guanys i pèrdues de DNA (duplicacions, transposicions, expansions, delecions). Potser no afecten la diana de restricció en sí, però sí que afecten el fragment de restricció, ja que hi ha una nova diana de restricció.
Modificacions químiques de les bases nitrogenades que condueixen a la pèrdua de dianes de restricció (metilacions). Per tant, també podem parlar de canvis epigenètics que afectin les dianes de restricció.
Si detectem algun d’aquests canvis, direm que hi ha un RFLP: una variació en la llargada del fragment de restricció. si la mutació afecta la diana de restricció, les bandes correran més o menys.
RFLPs – Detecció de mutacions en el DNA Les mutacions, els canvis de seqüència, afecten les dianes de restricció, i per tant, el Southern ens servirà per analitzar mutacions puntuals i guanys i pèrdues de material genètic.
71 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Anèmia falciforme – MstII En l’anèmia falciformem hi ha una substitució d’un sol nucleòtid que, a banda de ser una mutació de canvi de sentit, afecta la diana de restricció de dos enzims i té implicacions en la ßglobina. En última instància, aquesta mutació fa que l’hemoglobina formi estructures pseudocristal·lines, cosa que provoca que els eritròcits tinguin forma de falç i no pugui transportar de forma adequada l’oxigen. Tot això deriva en l’acumulació d’aquests eritròcits a la melsa, en què els eritròcits siguin degradats més freqüentment, etc. i es pot arribar a la mort de l’individu per anèmia.
Parlem d’una substitució d’un sol nucleòtid, concretament duna adenina per una timina. Com hem dit, aquesta substitució afecta una diana de restricció, la diana MstII (això es detecta mitjançant softwares). A banda d’aquesta també es veu afectada la diana Ddel.
La ß-globina A reconeix la diana de restricció MstII. Quan aquesta muta (si substituïm l’adenina per la timina), desapareix la diana de restricció del codó 6; l’enzim ja no pot tallar per aquesta regió.
Prèviament a aquesta diana de restricció en trobem una altra, i també en trobem una posteriorment. Aquestes dues altres dianes de restricció (abans i després de la que ha desaparegut) disten uns 200 pb.
Si agafem un fragment de DNA que ens doni un fragment de 1150 pb (que correspondria a la llargada del fragment en condicions normals) i l’aïllem, podem analitzar la mutació usant-lo com a sonda per verificar si hi ha o no diana. La sonda pot reconèixer un fragment de 1150 pb, que correspondrà ß-globina A (sana), o un de 1350, que correspondrà a la ß-globina S (afectada), en funció de la presència o absència de la diana.
72 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Per tant el que es fa és aïllar aquest fragment i marcar-lo per obtenir una sonda que s’utilitza per fer anàlisis. La sonda hibrida amb la seqüència de DNA de diferents individus i podem distingir entre: - Al·lels sans. La sonda hibrida amb la seqüència de DNA fins el punt de la diana de restricció (on talla). La banda d’un al·lel sa serà de 1150 pb.
Al·lels afectats. La diana de restricció no hi és, no es pot tallar en aquella regió; la sonda hibridarà amb els primers 1150 pb de la seqüència de DNA (per complementarietat) però el fragment de DNA serà més gran; la banda correrà més i observarem una banda de 1350 pb.
Tot seguit tenim un exemple de Southern blot fet en una família amb anèmia falciforme. Els pares tenen dues bandes, corresponents a 1150 i 1350. Recordem que 1350 pb correspon amb absència de la diana de restricció; 1150 amb presència de la diana.
Tant el pare com la mare presenten dues bandes; tenen un al·lel salvatge i un de mutat (heterozigots). El primer fill és homozigot per l’al·lel salvatge i el segon és homozigot per l’al·lel mutat, per tant estarà afectat d’anèmia. Si ens fixem amb més detall, el fill 1 té una única banda de ß globina de 1150 pb, i la intensitat de la banda és molt elevada comparada amb les bandes de la mostra parental (heterozigots). El fill 2 també té una única banda de ß globina de 1350 pb, i la intensitat de la banda també és molt elevada. Això ens indica que ambdós són homozigots, un per un al·lel i l’altre per l’altre.
73 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 En resum; coneixent la mutació, podem dissenyar una tècnica de diagnòstic senzilla basada en el Southern blot per la detecció de la presencia/absència de la mutació.
Intensitat de les bandes En els dos primers carrils, el DNA queda repartit en unes bandes estretes, mentre que en el tercer el tenim tot concentrat en una sola banda més intensa. En el quart carril encara és més intensa; això vol dir que s’ha carregat més quantitat de DNA en aquest darrer carril.
És a dir; si comparem les mostres parentals i la del primer fill, veiem que hem carregat la mateixa quantitat de material. La banda del primer fill és el doble que la dels seus pares pel fet que és homozigot, i en els seus pares la mateixa quantitat de DNA es reparteix en dues bandes.
Ara bé; la intensitat de la banda del segon fill és més elevada que la del primer, tot i ambdós ser homozigots. Això indica que hem carregat més mostra per la detecció dels al·lels d’aquest segon fill.
Però a més, també veiem una altra cosa; en els heterozigots les bandes de 1350 es veuen més marcades. Com és això? Nosaltres detectem el DNA que hibrida amb la sonda; la quantitat de sonda que hibrida amb el fragment de 1150 és la mateixa que hibrida amb 1350.La sonda és la mateixa per tots els casos; només detectem la quantitat de radioactivitat de la sonda. Per tant la quantitat de sonda que hibrida amb cada al·lel és la mateixa, independentment de la llargada de la seqüència; la radioactivitat no depèn d’això. De què depèn llavors? Si féssim un anàlisi previ en un gel d’agarosa (electroforesi de DNA), veuríem amb més intensitat la banda gran (la de 1350) que la banda petita (1150). Això és perquè el DNA es tenyeix amb colorant; depèn de la quantitat que hi hagi de DNA, ja que són les molècules de DNA les que retenen bromur d’etidi (marcatge del DNA). La quantitat de sonda que hibrida a les bandes 1350 i 1150 és la mateixa, però no la quantitat de bromur d’etidi que retenen les bandes, i les bandes grans retenen més bromur d’etidi. Al cap i a la fi, la quantitat de radioactivitat emesa no depèn de la quantitat de DNA, sinó de la mida del fragment.
Usant una sonda fragmentada, fem que tota la seqüència que sigui complementària hibridi, tot i que siguin fragments. Si la sonda només troba una part complementària, com que la 74 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 sonda està fragmentada, només hibridarà aquella regió de la sonda que sigui complementària.
Si digerim la sonda, tindrem la sonda fragmentada, i el fragment més gran retindrà més quantitat de sonda que el més petit, ja que te un grau de complementació menor amb la sonda.
Pèrdua d’una diana de restricció Variacions per l’ús de diferents sondes Els patrons que ens trobem analitzant DNA depenen de les sondes. Quan perdem una diana de restricció, el fragment que obtenim amb l’enzim de restricció és major; els homozigots per la presència de la diana presenten una banda més petita que els homozigots per absència de diana.
Si usem una sonda que inclou la diana de restricció, ens podran aparèixer: l’homozigot per la presència de la diana amb una sola banda, l’homozigot per l’absència de diana amb una sola banda més llarga, i l’heterozigot que presentarà les dues bandes (la més llarga corresponent a l’absència de la diana).
Anem a veure un exemple que ho il·lustri.
En el fragment, cada línia vertical representa una diana de restricció per l’enzim. La diana “original” és la marcada amb un *.
La sonda de color lila hibrida fins el punt de la diana de restricció.
- Homozigot per presència de diana (+/+). La diana no es perd. Els enzims poden tallar per la regió que toca. Obtenim dos fragments de igual mida, i observem una única banda.
Homozigot per absència de diana (*/*). La diana sí que es perd. Els enzims no poden tallar per la regió que toca. Tallen per un altre punt més allunyat; fragment més llarg.
75 Diagnòstic Genètic Molecular - Parcial 1 Obtenim dos fragments de igual mida, i observem una única banda, però aquesta banda ha corregut més que quan la diana està present.
Heterozigot (+/*). Un al·lel perd la diana i l’altre la conserva. Observem dues bandes corresponents als dos patrons exposats anteriorment i de menor mida cada una.
La sonda de color vermell hibrida una mica més lluny que el punt de la diana de restricció anterior. És a dir, aquesta sonda inclou la diana.
- - - Homozigot per presència de diana (+/+). La diana no es perd. Els enzims poden tallar per la regió que toca. Obtenim dos fragments de igual mida, i observem una única banda. La mida és major que el fragment anterior. Però obtenim dues bandes de DNA diferents; això és perquè la sonda té complementarietat amb qualsevol dels dos fragments tallats, i per tant obtenim dues marques per cada al·lel, una de més curta corresponent a l’altre fragment i una de més llarga.
Homozigot per absència de diana (*/*). La diana original es perd. En aquest cas. Només tenim un fragment possible complementari. Per tant la sonda hibridarà sempre amb fragments de la mateixa mida (no s’ha tallat per l’altre diana de restricció). Observem una única banda, la que corre més que quan la diana està present.
Heterozigot (+/*). Un al·lel perd la diana i l’altre la conserva. En aquest cas obtenim una barreja de les dues situacions anteriors: observarem les 3 bandes possibles; tenim un al·lel que sí que talla per la diana*, per tant es poden obtenir les dues bandes corresponents als dos fragments que hibriden, i tenim un al·lel * que no talla per aquesta diana, cas en que només pot hibridar un fragment amb la sonda.
Com veiem, les dues bandes corresponents a l’al·lel salvatge són la suma de la quantitat de DNA present a l’altra banda. La suma de la llargada de les dues bandes que es digereixen en els heterozigots ha de ser igual a la grandària de la banda més gran (la de l’homozigot). Si no és així, és que hi ha alguna cosa més, com un element transposable amb altres dianes de restricció.
En el tercer i quart cas tenim una sonda de color blau que hibrida fins dos punts més enllà de la diana de restricció inicial. Com veiem, com més gran sigui la sonda (més lluny estigui la diana), més bandes obtenim (més dianes contindrà la sonda).7 En el primer cas de sondes blaves observem un cert soroll; hi ha unes bandes més clares i difuses. En el segon cas de sondes blaves observem fins a 4 marques per l’heterozigot, doncs tindrem 4 fragments complementaris possibles per aquesta sonda. Pels homozigots, són 3 marques perquè n’hi ha dues que són de la mateixa llargada i apareixen en una sola banda més gruixuda. És a dir; en aquestes bandes coincideixen dos fragments d’orígens diferents però de la mateixa grandària, i això la sonda no ho pot discriminar.
76 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 Sigui quina sigui la sonda, només hi ha dues bandes que ens informen de la presència o absència de la diana, totes les altres indueixen a la confusió i no permeten fer un diagnòstic fiable. Aquestes bandes són les que han d’aparèixer amb més claredat.
Variacions en la llargada de la sonda Com hem dit abans, si la suma de la llargada de les dues bandes que es digereixen en els heterozigots no és igual a la banda de l’homozigot, és que hi ha alguna cosa més. Aquestes variacions poden ser degudes a: - - - Inserció d’elements transposables. En aquest cas la suma de les dues bandes serà major a la longitud del fragment original. Obtindrem el nostre fragment i un excés de material corresponent a l’element transposable que conté una diana de restricció.
Hibridació inespecífica de la sonda. En aquest cas la sonda hibrida de forma inespecífica amb altres fragments; soroll de fons. Són casos difícils de discriminar, tot i que elevem l’astringència.
Sondes grans amb altres dianes de restricció dins. Hi haurà dos fragments diferents de la mateixa longitud i no podrem discriminar entre ambdues bandes. És el darrer cas de sondes exposat abans (la blava de 4 marques).
Variacions pel temps d’exposició dels gels Podem trobar diferències en els resultats obtinguts degudes a variacions en el temps d’exposició dels gels.
En la següent imatge tenim un estudi on es du a terme el mateix Southern blot però el gel ha estat exposat més o menys temps en cada imatge.
Sempre ens hem de fixar en les bandes informatives. Si ens passem amb el temps d’exposició aquestes no es veuran suficientment bé. Per exemple, en el tercer carril, la banda superior desapareix a major temps d’exposició. Aquesta banda que desapareix és informativa, i el fet de no detectar-la ens pot portar a diagnòstics erronis.
Hem de buscar un revelat ens que 77 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 permeti saber si el nostre resultat és fiable i així poder dir si la mutació està absent o present.
A vegades hem d’allargar el revelat una mica més per saber si aquests resultats són fiables o no.
Variacions en el repartiment de substrat El repartiment del substrat de forma heterogènia pot induir a variacions, ja que comporta l’aparició d’una taca en mig del gel. Si la taca es troba sobre una banda informativa, tampoc podrem donar diagnòstics fiables.
Deficiència en 21 – hidroxilasa 78 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 La deficiència en 21-hidroxilasa és la causant de la hiperplàsia suprarrenal congènita.
Aquesta deficiència s’origina per una regió duplicada en tàndem adjacent al gen que codifica per la 21-hidroxilasa.
Aquest gen està en una regió que fa temps es va duplicar; la regió promotora de la regió duplicada va saltar, i la duplicació va quedar com a pseudogen (no funcional), i només s’expressava el gen original.
En aquesta regió tenim el gen en qüestió, el 21 – hidroxilasa (CYP21), i un altre gen adjacent, el CYP21P. El gen de CYP21 és de 3,7 Kb, i el pseudogen CYP21P de 3,2 Kb. El fragment que correspon al gen adjacent al CYP21 és de 6 Kb en la regió original (eL C4B) i de 7 Kb en la regió duplicada (el C4A). Per tant, és fàcil distingir si el fragment és de la regió original o de la duplicada per la mida.
Anem a veure l’estudi Southern blot dut a terme en una família afectada. Aquesta família té els dos pares heterozigots (tenen en un al·lel el gen funcional i en l’altre el pseudogen), un fill homozigot pel pseudogen i un control poblacional sa.
En l’esquema anterior, tenim també representades les dianes de l’enzim TaqI, corresponents als Kb exposats (3,7 pel gen funcional i 3,2 pel pseudogen). Fem servir una sonda específica del gen que interessa (CYP21). Veiem que al fill li falta la banda que correspon al gen funcional.
El control poblacional s’utilitza per comparar les intensitats de les bandes obtingudes.
Comparant el control i el fill, veiem que la intensitat de les bandes és més o menys semblant.
En canvi, en el pare i en la mare, les bandes del gen funcional són menys intenses que les que corresponen al pseudogen comparades amb el control. Això indica que els dos pares tenen una 79 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 deleció que afecta el gen de la CYP21. Per tant, tenen en un cromosoma el gen i en l’altre el tenen delecionat; són heterozigots tant per la presència del gen com per l’absència del mateix.
El fill ha heretat els dos al·lels que porten la deleció del gen funcional de la 21 – hidroxilasa.
Fem servir una altra sonda específica pel gen adjacent al CYP21, i fem el mateix però amb bandes de 7 Kb i 6 Kb. Si comparem les bandes de 6 Kb i 7 Kb, veiem que els pares tenen una menor quantitat de seqüències repetitives: la deleció avarca el gen i la regió adjacent; la deleció afecta al CYP21 i al gen adjacent, ja que el fill també manca de la banda de 6 Kb.
Per tant, podem obtenir informació a partir de la posició de la banda i de la intensitat. Si no miréssim la intensitat, nomes podríem dir si tenim una banda o dues; no sabríem si s’ha produït una mutació de novo o si els pares ja eren portadors de la mutació. La intensitat, juntament amb la presència i/o absència de les bandes, i la seva posició, ens proprocionen informació de cara al diagnòstic.
Malalties causades per una deleció Una deleció no implica que el fragment a analitzar sigui més gran o més petit; simplement canvia de grandària.
Veiem un exemple tot analitzant el següent pedigrí. Ens hem de fixar en l’expressió de la banda i en la seva intensitat. Aquest pedigrí correspon a una malaltia causada per una deleció que afecta un determinat fragment de restricció.
Les mutacions que afecten a les dianes, com ja hem estat veient, fan que modifiqui el patró de tall i per tant obtenim dos patrons de tall de llargada diferent.
La mutació en qüestió del nostre cas afecta al fragment de restricció però no a la diana. Dóna lloc a un fragment de restricció més petit ja que la regió original ha desaparegut. En casos de deleció interna, obtindrem un fragment més petit que el salvatge, per tant una banda més petita (que corre menys). En casos en que la deleció sí inclou la diana de restricció, els enzims 80 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 no podran tallar-la, i el fragment que queda en les dues dianes serà més gran, i per tant la banda serà més gran.
Si observem l’esquema següent: tenim una sonda amb 3 possibles dianes. La sonda reconeix el fragment entre la 2a i la 3a diana. Si es deleciona un tros que inclou la 2a diana de restricció, obtindrem un fragment major que l’original que reconeixia la sonda, perquè anirà de la 1a diana a la 3a.
Per tant; si es deleciona el fragment de restricció però no la diana, el fragment mutat serà més petit, però si la deleció inclou la diana de restricció el fragment que ara queda entre les dues dianes correlatives serà major que el que esperaríem detectar en la sonda.
Un patró es pot explicar de moltes maneres. Ara, quan fem diagnòstic, si coneixem la mutació, sabrem quins patrons esperem, i és més fàcil d’interpretar el patró obtingut amb un Southern. En cas de ser una nova mutació desconeguda, el patró pot tenir múltiples interpretacions; mutació puntual, deleció... múltiples variacions poden donar un mateix patró.
Per tant s’ha de complementar. És a dir; a partir d’un patró, nosaltres podrem donar diferents hipòtesis, per tant hem d’usar informació complementària. Si només treballéssim amb Southern blot, doncs hauríem de buscar altres enzims de restricció per poder tenir més informació sobre els patrons de restricció. Però el més fàcil en cas de dubte és seqüenciar, ja que llavors veiem clarament la causa de l’alteració del patró de restricció.
Detecció de la distròfia miotònica També analitzem un pedigrí. En aquest, podem veure un pare afectat per la distròfia que té una filla afectada, la qual ha tingut 2 fills, un malalt i un no.
Analitzem el Southern blot i veiem el següent: - La dona no afectada (I2) és homozigota per l’al·lel salvatge.
El pare (I1) és homozigot per l’al·lel mutat.
81 Diagnòstic Genètic Molecular - Parcial 1 La filla (II1) és heterozigota, ha heretat l’al·lel mutat del pare.
El fill malalt (III3) ha heretat l’al·lel afectat del pare però cap al·lel de la mare.
Si això passés en el pare, simplement pensaríem que el pare biològic no està aquí, butanero.
Però és la mare; això indica mutacions dinàmiques, una anomalia associada a inestabilitat a la línia germinal, una expansió d’una repetició, en aquest cas (CTG)n. A partir d’un número determinat de repeticions, apareix un al·lel expandit, més gran, el qual és molt inestable i s’expandeix. Això en Southern blot es detecta amb un sonda que ens permet veure que l’al·lel de la mare ha incrementat la grandària, i per això veiem una banda més gran. Es fa servir un enzim de restricció que inclou la regió del triplet. En funció del número de còpies presents apareixeran bandes de major o menor recorregut.
Moltes malalties es poden detectar a partir de PCRs, però d’altres requereixen de Southern blot donat que els fragments massa grans no són gaire fàcils d’amplificar per PCR.
El microsatèl·lit pot canviar de còpies; si augmenta, el fragment resultant serà molt més gran.
A part de l’expansió, en aquesta família s’ha donat el fenomen d’anticipació, ja que el fill presenta símptomes més greus i a una edat més primerenca que la seva mare. Com més repeticions més severitat i més abans es manifesta la malaltia. La distròfia miotònica és la distròfia més freqüent en adults.
Anàlisi de pèrdua d’heterozigosi (LOH) Els Southerns blot també ens serveixen per detectar LOH, loss of heterozygosity. La LOH es dóna quan en la mostra analitzada d’un individu (una mostra tumoral per exemple) observem que un marcador passa a estar d’heterozigosi a homozigosi (o hemizigosi). És un element de pronòstic usat en càncer. Es basa en comparar el teixit normal amb el tumoral i s’analitzen múltiples marcadors polimòrfics (SNPs, macrosatèl·lits...).
Aquest fenomen acostuma a agreujar el pronòstic del càncer, ja que si en la regió on es perd l’heterozigositat hi havia gens supressors de tumors, probablement el creixement tumoral passi a ser molt més agressiu.
Un exemple molt clar d’aquest fenomen és el gen RB, causant del retinoblastoma.
1. Mecanismes que poden produir LOH en el RB 82 Diagnòstic Genètic Molecular - - Parcial 1 No disjunció (pèrdua del cromosoma normal). Si es perd el cromosoma de l’al·lel salvatge perds la funció del gen RB normal; si es perd el cromosoma mutant no passaria res.
No disjunció i duplicació del cromosoma mutat. Hi ha pèrdua del cromosoma normal i duplicació del restant. Per tant tenim dos cromosomes però un és la còpia d’un altre.
Recombinació mitòtica.
Conversió gènica.
Deleció de l’al·lel normal.
Mutació puntual.
Aquestes pèrdues poden tenir causes diverses. En l’anàlisi de marcadors polimòrfics, no sempre es detecta la pèrdua d’heterozigosi; de tots els casos mencionats, no la detectaríem en conversió gènica i en mutació puntual, ja que passarien desapercebudes (en el primer cas perquè es tracta d’una regió molt petita).
A més, una LOH no assegura que es perdi la funció. Ara bé, que no s’hagi perdut l’heterozigositat tampoc implica que no hagis perdut la funció. Hi ha casos on es perd l’heterozigositat a causa d’alguna mutació del gen RB o per conversió gènica. Aquests casos són de diagnòstic indirecte, ja que els marcadors de les regions ens informen dels propis marcadors però no del gen en concret.
Hi ha moltes regions gèniques implicades en processos tumorals, i tan pot ser que hi hagi molts gens implicats com que només hi hagi únic gen implicat i encara no s’hagi determinat.
83 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 2. Marcadors polimòrfics de la regió 17p. Carcinoma de colon – recte.
Basar-nos en un marcador proporciona informació indirecta, ja que no assegurem el que passa en la regió afectada.
En la següent imatge comparem el teixit salvatge amb el tumoral per diversos marcadors.
La regió 17p és especialment interessant donat que conté el gen que codifica per la p53. Pot ser que analitzem una regió i trobem que hi ha hagut pèrdua d’heterozigositat per tots els marcadors, o per uns marcadors sí i per uns altres no, etc.
Ara bé, en quins casos trobarem LOH per un marcador però no per d’altres en la mateixa regió analitzada? Això podria passar quan s’ha donat una deleció. La deleció només afectarà una part concreta de la regió que analitzes. Només detectarem informació significativa derivada dels marcadors que estiguin continguts en aquesta regió delecionada.
Passa sovint que la pèrdua d’heterozigosi afecti uns marcadors però no tots.
84 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 3. Confusions dels casos LOH Sovint, en els tumors sòlids es troben cèl·lules normals que poden donar bandes de menor intensitat que poden confondre els casos de LOH.
La posició de la banda ens informa; si usem marcatge radioactiu, la intensitat també ens informa.
Anem a veure un exemple corresponent a cèl·lules sanes i tumorals de la bufeta urinària.
Veiem i comparem dues bandes (estem comparant cèl·lules tumorals amb cèl·lules sanes).
Ambdues bandes estan presents en totes les imatges, per tant en teoria no hi ha pèrdua d’heterozigositat en cap cas. En la gran majoria de casos de càncer s’observaria una pèrdua d’heterozigositat. Aquest no és el cas.
Si ens fixem millor, en el primer gel les bandes de les cèl·lules tumorals són més intenses que les de les cèl·lules sanes. En el segon gel és al contrari; les bandes de les cèl·lules sanes són més intenses que les bandes de les cèl·lules tumorals. Pel que fa al tercer cas, és com el primer; les bandes de les cèl·lules tumorals són més intenses que les sanes.
Per què aquest canvi d’intensitat? En l’anàlisi de cèl·lules tumorals pot ser que també haguem analitzat algunes cèl·lules sanes; els teixits per estudiar els tumors no sempre són homogenis. Llavors tindríem teixit normal i teixit tumoral junts, per tant tindríem els dos al·lels presents, i per tant apareixeran les dues bandes, unes més intenses que altres.
Això pot conduir a error: com sabem si hi ha hagut LOH en el teixit tumoral si també apareixen bandes perquè hi ha cèl·lules sanes? Només basant-nos en els canvis d’intensitat és bastant pobre... només hi ha una part del material analitzat on trobem pèrdua d’heterozigositat; els resultats són fruit d’una mostra heterogènia on hi ha barrejat tant teixit tumoral com sa.
En aquests casos, hauríem de donar l’informe per no vàlid, ja que probablement sí que hi ha pèrdua d’heterozigositat tot i que observem les dues bandes en totes les imatges.
85 Diagnòstic Genètic Molecular Parcial 1 86 ...