Sesiones problemas 3 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 2º curso
Asignatura Bioquímica II (Biología molecular)
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 19/04/2016
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Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 19/11/2015 PROBLEMAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR SESIÓN 3- Cómo secuenciar DNA por el método tradicional de Sanger y con técnicas de ultrasecuenciación En esta última sesión se estudiarán técnicas de secuenciación de DNA. Se han dividido en dos tipos de técnicas: - Secuenciación de Sanger o dideóxidos § Secuenciación manual § Secuenciación automática *Tanto la secuenciación manual como la automática se basan en el mismo concepto: síntesis de DNA en presencia de 1 dideoxinucleótido (ddNTP). Cuando DNA pol introduzca este nt dejará de producirse la síntesis de DNA.
- Secuenciación masiva o ultrasecuenciación MÉTODO DE SECUENCIACIÓ A PARTIR DE DIDEOXINUCLEÓTIDOS (método de Sanger): § Base: si se incorpora a la cadena de DNA un dideoxinucleótido presenta en su carbono 3 de la pentosa un H unido en la posición que le correspondería al grupo OH --, deja de producirse la síntesis de DNA.
§ En este tipo de secuenciación se sintetiza DNA. Para ello, se necesita un molde de DNA, dNTPs (TTP, ATP. GTP y CTP, marcados radioactivamente), cebadores, DNA pol, Mg2+, etc.
§ Procedimiento: DNA ⇒ (1) En 4 tubos de ensayo de añaden desoxinucleótidos trifosfato marcados 1   radiactivamente (por ejemplo, dATPs*) y, en cada uno de los tubos de ensayo, se añade un tipo diferente de los 4 tipos de dideoxinucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP).
ddATP* ddGTP* ddCTP* ddTTP* Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 19/11/2015 ⇒ (2) Se realiza la síntesis de DNA en cada tubo, con lo cual hay una extensión del fragmento de DNA a partir del cebador hasta que la polimerasa incorpora un dideóxido, momento en que se interrumpe la síntesis (3). Este tercer paso puede suceder al incorporar el primer nucleótido de una cierta base, o al incorporar el segundo nucleótido de la esta base, o el tercero, etc, es una cuestión probabilística.
⇒ (4) Se obtiene un conjunto de todos los fragmentos posibles sintetizados de novo con dNTP* y que se habrán extendido hasta la llegada de un ddNTP. Lo que se ha marcado son todas aquellas posiciones en la cuales hay el mismo nt.
2   3   4   ⇒ (5) Si a continuación se realiza una electroforesis en un gel de acrilamida - con resolución para 1 nucleótido - y se utilizan 4 carriles, uno para cada tubo (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), en la autorradiografía se podrá ver a lo largo de los 4 carriles una escalera de bandas que se podrá leer: a. desde abajo movilidad, (máxima fragmentos más pequeños, primeros nucleótidos de la secuencia, extremo 5’) b. hacia arriba movilidad, más (mínima fragmentos grandes, nucleótidos últimos de secuencia, extremo 3’).
la 4 Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 19/11/2015 ⇒ Cada carril se corresponderá “con una base”, dado que sus fragmentos habrán interrumpido su síntesis al colocar un dideóxido con la base que corresponda según el tubo.
§ Con este método se requieren 4 reacciones para poder secuenciar el DNA.
§ Con este método se pueden leer hasta unos 400 pb.
§ Además: § Los últimos nucleótidos no se pueden ver por pérdida de resolución del gel.
§ Los primeros tampoco pueden verse por radiactividad insuficiente (no han incorporado suficiente radioactividad*).
1º nt = G, 2º nt = C, 3º nt = T à vemos una pequeña seq = G-C-T seq del fragmento seleccionado (5’ a 3’) = A-A-A-T-C-A-A-T-T… MÉTODO DE SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA § También basado en el uso de dideoxinucleótidos.
§ Con respecto al método de Sanger, la sec. automática presenta varias diferencias: - En este método, los dideoxinucleótidos están marcados con fluorescencia de distinto color según el tipo de dideóxido, con lo cual en lugar de 4 reacciones, solo necesitará se una sola reacción.
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB - 19/11/2015 La electroforesis es distinta: electroforesis en capilar. Al salir del gel, hay un láser con detector de picos de fluorescencia y que permite realizar un cromatograma. La intensidad de los picos disminuye a medida se avanza en el cromatograma.
- Mientras que el método de Sanger permitía leer unos 400 nucleótidos en cada electroforesis, en este caso se pueden leer unos 1000 nucleótidos en cada electroforesis. Además, un secuenciador automático admite unos 200 capilares, con lo cual se pueden secuenciar 200.000 nucleótidos a la vez.
§ El primer genoma humano secuenciado tardó unos 10 años a secuenciarse y se secuenció de forma incompleta. Actualmente, en unos 10 días se puede secuenciar la totalidad de un genoma.
§ En la primera secuenciación del genoma humano se usó la secuenciación automática pero con un sistema diferente, modificado (para reducir costes: como los ddNTPS son muy caros, se usaron cebadores fluorescentes). En aquella época el proceso fue el siguiente: ⇒ (1) Fragmentación del DNA con enzimas de restricción del genoma humano.
⇒ (2) A continuación, se introduce en plásmidos, de modo que se pueda utilizar un cebador universal, que se marca con distintos fluoróforos.
⇒ (3) Se aíslan las colonias para posteriormente hacer minipreps (= extracción plásmido de los cultivos).
⇒ (4) En cada caso se usa un dideoxinucleótido distinto. Hay 4 reacciones que se cargan en el gel para hacerse la lectura con el cromatograma. Es, un paso atrás hacia sec. manual para reducir costes, ya que los dideóxidos fluorescentes son muy caros.
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 19/11/2015 SECUENCIACIÓN MASICA O ULTRASECUENCIACIÓN DEL DNA § En la secuenciación del DNA de segunda generación el sistema ya no es enzimático, sino químico.
à Imagen comparativa del sistema de secuenciación automático de Sanger (a) versus el sistema de ultrasecuenciació (b).
§ Proceso ultrasecuenciación de segunda generación: ⇒ Hay una fragmentación del DNA, que a continuación se une in vitro a unos adaptadores.
⇒ Se colocan los fragmentos en placas de polonio y se produce una secuenciación directa, químicamente: o Entra un solo nucleótido (extremo OH- 3’ está bloqueado, no es funcional), con fluorescencia. A continuación se desbloquea su extremo OH- 3’, a la vez que se elimina la fluorescencia.
o Entra el siguiente nucleótido, marcado con fluorescencia, otra vez con el extremo OH- 3’ bloqueado. A continuación se desbloquea su extremo OH- 3’, a la vez que se elimina la fluorescencia.
§ Solexa-Illumina, un aparato que funciona bajo este mecanismo, realizaba inicialmente 36 ciclos, es decir, que podía secuenciar 36 nucleótidos a la vez. Actualmente, ya llega a los 50. A la vez, se secuencian 200 millones de puntos, es decir, de fragmentos de un máximo de 50 nucleótidos que deben unirse con otros 200 millones de fragmentos.
§ En la secuenciación, lo que más tiempo conlleva es el procesamiento informático, ya que el ensamblaje del genoma a partir de 200 millones de tiras de 36 a 50 nucleótidos no es inmediato (unos 10 días, coste de 1000 dólares).
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB § 19/11/2015 Hay distintas máquinas con tecnologías de secuenciación del DNA de segunda generación (454 ya no se usa), con un precio de aproximadamente medio millón de dólares. No es necesario conocer el funcionamiento de Solexa-Illumina con precisión de cara al examen.
§ En la secuenciación del DNA de tercera generación se puede secuenciar DNA en menos de 1 hora un genoma completo, a un coste de unos 100 dólares.
§ El coste de las máquinas de secuenciación de tercera generación es de unos 4-5 millones de dólares.
§ Estas máquinas ya no están pensadas para la investigación biomédica, sino para su aplicación en hospitales, por ejemplo de cara a pruebas, que verán reducido su coste económico y serán más eficaces. Habrá aplicaciones en prevención, diagnóstico y mejora de la terapia.
Un ejemplo se encuentra en el cáncer: se podrá conocer la secuencia de DNA y las mutaciones de las células tumorales para mejorar la terapia.
§ Un potencial problema ético contra el que debe lucharse es la utilización indiscriminada de la secuenciación del genoma de las personas, que puede tener implicaciones éticas, por ejemplo en el caso de las aseguradoras.
§ Proceso ultrasecuanciación de tercera generación (SMRT): ⇒ En este tipo de secuenciación, se utilizan micropocillos de 70 nm que pueden contener 0, 1 o 2 DNA polimerasas - lo más probable es que contengan 1-. En cualquier caso, según los resultados de síntesis de DNA, se seleccionan los micropocillos que contienen una sola DNA polimerasa(1).
⇒ Se incorporan nucleótidos trifosfato con fluorescencia en el fosfato más exterior, el gamma (2).
⇒ En el momento de incorporarse, los nucleótidos están quietos. Un detector ve como hay temporalmente una de las 4 fluorescencias en pico (excitación de fluorescencia al incorporarse el nucleótido) (2).
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 19/11/2015 ⇒ Así se secuencia el DNA mientras se van creando secuencias de pico de fluorescencia a medida que se añade cada nt (2 y 3).
1 2 3 4 5 6 7 § En cada pocillo, se añaden unos 600 nucleótidos por minuto hasta un máximo de 10000 a 20000 nucleótidos por pocillo, con lo cual el proceso de secuenciación dura entre 10 y 20 minutos, a los que se tiene que añadir el tiempo necesario para realizar el procesamiento informático, en el que se tienen que ensamblar unas 100.000 secuencias, muchas menos que en la secuenciación de segunda generación. Todo el proceso, pues, es más rápido.
§ El nucleótido está marcado con el fosfato fluorescente en la posición gamma con la finalidad de que el nucleótido añadido sea natural y, de esta forma, la polimerasa tenga una actividad más eficiente y rápida. Hay, así, una ganancia en procesividad y velocidad de polimerización. El pico de fluorescencia, además, es puntual, ya que el fosfato gamma se escapa del lugar de polimerización al añadir el nucleótido correspondiente a la secuencia que se está sintetizando.
§ Hay una utilidad de la ultrasecuenciación aplicada al RNA para la ultracuantificación de la expresión génica de la misma forma que se hace con microarrays (ésta es información obtenida a partir de la discusión del artículo de esta sesión).
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 19/11/2015 PREGUNTAS TIPO EXAMEN § El método de la secuenciación automática se basa en el método de Sanger o de los dideoxinucleótidos, pero mejorado, pues consigue lecturas más largas.
§ En la mezcla de reacción para la secuenciación automática, se añaden hasta 4 nucleótidos trifosfato diferentes.
§ En la secuenciación automática, el DNA se puede visualizar tanto por marcaje radiactivo en el extremo 5’ como por marcaje fluorescente.
§ Los ddNTPs (marcados con distintos fluoróforos) se utilizan en la secuenciación automática de DNA.
§ La gran revolución de los sistemas de segunda generación (454, Solexa-Illumina, etc.) consiste en que con estas técnicas se secuencian millones de clones a la vez, aunque la longitud de las secuencias individuales sea menor que por Sanger.
§ Respecto a la Third Generation, Pacific Biosciences, utilizando la técnica SMART y debido a la alta procesividad de la DNA polimerasa, consigue en pocos minutos secuencias de e3-e3 nucleótidos en cada pocillo (con miles de pocillos por placa).
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