Tema 4 - Cultius Cel·lulars (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Biotecnología - 3º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2016
Páginas 42
Fecha de subida 22/03/2016
Descargas 5
Subido por

Vista previa del texto

Tema 4. Tipus de cultiu i Tècniques Bàsiques: obtenció, manteniment, propagació i conservació Gràfic on tenim la població cel·lular, com es comporta al llarg del temps. De la línia primària on hi ha proliferació fins arribar a una fase de senescència o mort. I una línia secundària que té un creixement infinit.
Per establir un cultiu partim d’un teixit que prové de qualsevol estat de desenvolupament del organisme. Disgregació.
- De manera que podem establir cultius d’òrgans, on es manté l’estructura tissular, i no hi ha reproducció.
Cultiu d’explants Cultiu de cèl·lules disperses, es pot obtenir a partir de l’explant.
A partir de l’aïllament del teixit, hi ha una dissecció, aleshores es fa una dissecció mecànica més fina, forta o disgregació enzimàtica, on acabem fent un cultiu d’explants o cèl·lules disperses, establint cultius primaris. S’han de saber de l’organisme i de quin lloc s’ha obtingut la línia.
Disgregació mecànica: processos que busquen que aquest fragment de teixit amb una mida, el disgreguem en cèl·lules individuals, fent passar per una xeringa per exemple, o a través d’una pipeta llarga, o aixafant amb algun dispositiu estèril.
Moltes vegades no és suficient i per això fem disgregació mecànica amb enzims que tenen com a substrat components de la matriu extracel·lular. Això és el que porta que l’enzim més empleat sigui la col·lagenasa, és una proteasa que degrada col·lagen, proteïna majoritari que secreten les cèl·lules animals.
- La col·lagenasa prové de Clostridium hystoliticum, es creix el bacteri i es lisa, i es fa una precipitació de sulfat amoni, això se l’anomena preparat de col·lagenasa I, si ho tornem a fer s’anomena de tipus II. Doncs els tipus de col·lagenasa no són diferents isoformes de col·lagenasa, sinó que són nivells de purificació. Hidrolitza el col·làgena en la seva conformació de triple hèlix alliberant fragments curts, gelatina. Les preparacions comercials contenen altres proteases, polisacaridases i lipases. Tipus:  Tipus I: tot tipus d’activitats. Recomendada: adrenals, fetge, adipós.
 Tipus II: amb un activitat clostridopeptidasa superior: cor, múscul, cartílag, tiroides i fetge.
 Tipus III: baixa activitat proteolítica. Cèl·lules de mamífer en general.
 Tipus IV: baixa activitat tripsina. Recomanada en aïllament de illots on és crític el manteniment de la integritat dels receptors.
La col·lagenasa és específica de col·làgen, però està contaminada per altres activitats.
- - - - - - - Tripsina: proteasa amb una seqüència de tall molt comú pel que talla molt, s’obté de pàncrees porcí. Serina proteasa pancreàtica, talla enllaços peptídics en que estan implicats els aminoàcids bàsics arginina i lisina. S’utilitza com a nom comercial d’un preparat (Trypsin) de pàncrees porcí (amb activitats proteasa, polisacaridasa, nucleasa i lipasa). En laboratoris de cultiu s’utilitza tripsina purificada.
Elastasa: serina proteasa pancreàtica, talla enllaços peptídics adjacents a aminoàcids neutres. Capacitat de degradar elastina. Utilitzada en la dissolució de teixits connectius, usualment junt a tripsina o col·lagenasa.
Hialuronidasa: no és una proteasa, sinó una hidrolasa de carbohidrats. Polisacaridasa.
Seqüència de tall característica de hialurònic i condriotín sulfat. Utilitzada en dissociació de teixits.
Papaïna: sulfihidril proteasa de Caricia papaya. Amplia especificitat, més activa que tripsina. Recomanada per aïllament de neurones dons aparentment danya menys que el tractament amb tripsina.
Pronasa: Enzim bacterià, de Streptomices frisens. Alternativa a tripsina en la disociació cel·lular en cultiu. Habitualment junt a col·lagenasa.
Dispasa: enzim proteasa amb acció col·lagenàsica però solament degrada de tipus IV, degrada col·làgen IV, va molt bé per separar (no confondre amb col·lagenasa de tipus IV). Enzim bacterià de Bacillus polymixa. Metaloenzim que requereix Ca per la seva activitat. Utilitzada en teixits amb baix contingut d’àcid hialurònic.
EDTA: molècula orgànica de baix pes molecular i té alta activitat de quelant d’ions divalents. Utilitzem els diferents enzims normalment en presència de EDTA. Àcid etilendiaminotetraacètic. A 0’02% en tampó fosfat salí sense calci ni magnesi s’utilitza junt amb la tripsina per augmentar la dissociació cel·lular.
DNAsa I: no és un enzim que tingui un substrat natural en la matriu extracel·lular, ja que en la matriu no hi ha DNA, però utilitzem DNAsa perquè quan fem una disgregació mecànica o amb enzim, doncs hi ha moltes cèl·lules que es trenquen, i la cromatina s’expandeix, aleshores forma una xarxa que atrapen cèl·lules, que augmenta la - viscositat, dificultant la manipulació, i per aquesta raó posem DNAsa per alliberar les cèl·lules.
Inhibidor de tripsina (soja): inactiva l’activitat proteolítica de la tripsina, però no la esterolítica ni tampoc afecta a la elastasa.
Separació cel·lular Utilitzant tot aquest tipus d’enzims, aconseguirem passar d’una estructura orgànica. Acabarem amb un tub amb moltíssimes cèl·lules, però no totes elles són de la mateixa població o tipus cel·lular. Per exemple si fem una disgregació d’un fetge, quins tipus cel·lulars hi haurà dins del tub? Hepatòcits, endoteli, cèl·lules de kuppfer, cèl·lules sanguínies, adipòcits, fibroblasts...
doncs en el tub no hi ha un sol tipus, sí que hi ha un majoritari, i nosaltres intentarem purificar solament un. Hem disgregat l’òrgan i ara volem seleccionar la població d’interès. Volem aplicar diverses metodologies de separació cel·lular.
- - Sedimentació: posem les cèl·lules en una placa, i les que primer s’enganxin seran les que ens quedem, la densitat d’una cèl·lules és major que la solució aquosa, per això es s’enganxen. Per exemple: si volem hepatòcits, i posem en la placa cel·lular col·làgen, aquestes cèl·lules seran les primeres en enganxar-se. Per exemple podem fer-ho també afegint receptors específics en la placa. Doncs no només tenim en conte la velocitat de sedimentació, però també posem una proteïna a la placa de petri. Si el medi té la mateixa densitat que les cèl·lules no sedimentarà, però normalment fem que tingui més densitat les cèl·lules. Però hi ha cèl·lules que tenen una densitat molt baixa, menor que l’aigua, no sedimenta, com ho solucionem? CENTRIFUGA. Densitat cel·lular aprox. 1’06g/cm3. Equip econòmic, molt temps durant el qual pot tenir lloc la mort cel·lular  propi de l’adhesió cel·lular.
Centrifugació: la força de sedimentació fa que sigui més gran, tot i que no se superen els 1000 grams perquè sinó estrallen les cèl·lules. A més es pot utilitzar la centrifugació per resoldre entre poblacions que tinguin petites diferències de densitat: suposem que tenim una població de cèl·lules, un tipus té 1’5 una altre de 1’3 i una altre de 1’1 i les volem separar  es construeix un gradient de densitat en el tub amb 3 substàncies amb diferents densitats. Si centrifuguem la mostra, la de 1’5 baixarà del tot, el de 1’3 baixarà fins la seva interfase, i la de 1’1 també baixarà fins la seva, que es troba per sobre del de 1’3.
a. Com faríem un gradient continu, col·loquem clorur de cesi (amb bromur d’etidi i el plasmidi) en un tub segellat, i el deixem centrifugant 2.000.000xg unes 18 hores.
Es genera un gradient. Per separar cèl·lules es fa un gradient preformat. Se separen 2’5 ml de la solució del 10% i una altre solució de també 2’5 ml amb 40% de sacarosa. Es connecta amb un altre tub, vasos comunicants. Es treu un tub passant gotes consecutives amb diferents densitats, que comencen en 40 i acaben en 10, aconseguint un gradient continu de densitat.
b. Suposem que acabem la centrifugació i tenim les diferents bandes de cèl·lules, com se separa? Amb pipeta, amb una agulla clavada en el tub, o tenir el tub perforat per a baix separant per gotes.
Accelera la separació per centrifugació: mètode gradient (Ficoll, Lymphoprepr, Nycodenz... Metrizamida, Percoll, .. En general basats en dextrà (o silicà) o isopínic (flotaicó). La centrifugació es fa en el rang 100-1000xg. Limitacions causades per la superposició de perfils de densitat entre diferents tipus cel·lulars i el número de cèl·lules que poden ser processada alhora.
Suposem que la població que volem aïllar no té receptors cel·lulars, ni tampoc densitat diferents, però si que tenen diferent mida. Doncs ho podem separar per un citòmetre de flux.
- Citòmetre de flux FACS (Fluorescence activated cell sorter), un classificador cel·lular.
Tenim un tub de cèl·lules i un tub sense cèl·lules, i es barreja, i doncs hi ha molt poca possibilitat de que una gota tingui cèl·lules, i si en té, com a màxim tindrà una sola cèl·lula, doncs passen gotes d’una en una, quan la cèl·lula distorsiona la llum del làser, hi ha un fotomultiplicador que mesura quanta llum s’ha distorsionat. Hi ha un segon fotomultiplicador que està a 90º de l’altre detecta la llum que reflexa en la interfase, si la gota té la cèl·lula té més d’una interfase, la de la gota i les zones de la membrana de les cèl·lules, com més complexa sigui la cèl·lules, més reflex hi ha. Separació de cèl·lules en funció de propietats de mida, complexitat cel·lular o marcadors.
Habitualment mitjançant marcatge fluorescent.
Resultats experimentals: es representa cada cèl·lula individualment per punts. Molts queden en la mateixa zona del gràfic, això diu que poden haver dos poblacions cel·lulars. Al classificador se li demana: quan la gota caigui i travessa la llum làser, l’aparell mesura i segons la característica de selecció, el instrument mitjançant plaques reflectores canvien la polaritat dirigint la cèl·lula a un tub en concret, classificant entre 40 i 60.000 cèl·lules. Però si volem separa una població molt gran és útil perquè tarda molt i la cèl·lula en suspensió moren. Per veure si ho hem fet bé, es trona a passar el tub una altre vegada pel citòmetre. Obtenim una segona gràfica amb moltes cèl·lules que coincideixin amb el que hem dit però no purificada al 100% (molt car).
- Magnetic beads: unes boletes magnètiques unides a anticossos primaris. Si passem per una columna que té un imant, doncs la que té l’anticòs amb el iman queda unida, però les altres no. Si després canviem la polaritat podem alliberar-la. Podem fer-ho amb anticòs primari o secundari. Aïlla cèl·lules marcades amb un anticòs mitjançant un segon anticòs unit a una bola magnètica que es reté mitjançant un camp magnètic.
Elevada eficiència. El número màxim de cèl·lules a separar és de l’ordre de 108 . Es poden utilitzar diverses estratègies, positiu o negatiu.... hi ha proteases que tallen el domini d’unió...
Això permet fer coses com el que veiem en el gràfic, que també és de citometria de flux, ho marquem amb CD14, és un marcador de limfòcits, CD són noms que es donen per acord internacional a una sèrie d’antígens que estan acordats com a marcadors comuns en una població cel·lular. CD llistes d’antígens que marquen/identifiquen poblacions cel·lulars, utilitzo un anticòs de CD14 unit a fluorescència, si tenim cèl·lules respecte fluorescència, observem que tenim dues poblacions, gràfic logarítmic, tenim una població que té una florescència a 5 i a 500, els de 5 no tenen l’antigen (background), el de 500 és positiu té antigen. Background interessa per saber número de cèl·lules, doncs depèn de la corba.
Ara agafem les cèl·lules barrejades i utilitzem un anticòs contra CD14 que té una bola magnètica: en columna que té imant, en el líquid que surt són cèl·lules CD14 negatives, fem un citòmetre d’aquests, i tenim les negatives, fem el mateix per les positives, veiem que ha separat molt bé a partir de un anticòs. Doncs permet molt bé l’escalat, en un mateix temps sense que les cèl·lules morin (mentre passin pel citometre).
Protocol per purificar cèl·lules amb boles magnètiques. Procés molt ràpid i molt eficient, per tant molt útil, però bastant car perquè solament hi ha una casa que els proporciona i els té patentat.
- - Concepte de mort selectiva: posem una placa cultiu, i ens interessa aquells que no es divideixi, doncs posem reactiu que mati totes aquelles que proliferin. Anticossos contra marcadors de superfície de la població no desitjada, seguits de complement..
Tenim una població mixta, realitzem clonatge, per aconseguir una població homogènia... aïllament mitjançant dilució.
Filtració: per exemple “cromatografia de cèl·lules”.
o Filtració en gel, per separar proteïnes, s’utilitza per exemple cefaleix, que té diverses boles, algunes petites i d’altres grans, separació per mida, el problema és que no s’aconseguien formar estructures amb calibres determinats per que les cèl·lules puguin passar per el seu interior. Es van fer ?.
o Basada en la velocitat en la que corren les cèl·lules, les posem totes alineades i donem estímul perquè corrin, i a partir d’aquí, després d’un temps tallem. Han de fer canvis de trajectòria, cada vegada ocupen més malla, i separem els que corren més respecte les que no, gràcies a un estímul quimiotàctic.
Metodologies de complicació creixent per veure com ho fem a la pràctica.
Exemple 1: aïllament de fibroblasts esclerals humans (teixit conjuntiu ocular) Una de les estratègies és per aïllar aquests fibroblasts, del globus ocular, es pot obtenir amb certa facilitat (molt controlada), ja que no s’utilitza per el trasplantament. Es trosseja un fragment d’esclera, obtenint trossos molt petits que posem en placa que són capaços a la llum del microscopi, però si ens fixem en el plàstic al cap d’uns dies, es veuen unes cèl·lules .......
Estàtiques, no de poden aïllar per aquest sistema ja que no es mouen, retirem els fragments d’esclera i ens quedem amb les cèl·lules: molt allargades.
Exemple 2: aïllament de epiteli de la conjuntiva humana Recobreix superfícies, fem explantaments, els retirem i tenim una monocapa, en aquest es veu un desgarrament en un punt i es forma una colònia que creix al cap dels dies, ens quedem amb la monocapa, que són morfològicament diferents a les anteriors, ja que no són tant gran i estirades com les altres, aquí totes les cèl·lules estan en contacte una amb l’altre, contactes estrets cèl·lula a cèl·lula. Es produeix una migració ja que són relativament indiferenciades, però mobilitat molt més limitada, solament en llocs on hi hagut un desgarrament, doncs tocaran el plàstic. El desgarrament s’ha fet a l’atzar, la manipulació mecànica ho fa en diversos llocs.
Exemple 3: aïllament de fibroblast de pell de primats mitjançant “explantaments” Tranquem l’explant en trossets i els aixafem una mica perquè quedin units a la placa. S’afegeix el medi de cultiu amb molt de compte, i aleshores passen a l’incubador durant aproximadament una setmana. I acaben obtenint una cosa semblant, cèl·lules que migren.
Exemple 4: aïllament de cèl·lules de l’epiteli pigmentari de la retina humana Cèl·lules que es troben sota els fotoreceptors de la retina. Fem una secció histològica, sota dels cons i bastons, estan recolzats en cèl·lules de l’epiteli pigmentari de la retina, cèl·lules fosques que ens interessen. En aquell moment estudiaven cèl·lules de barrera, els vasos sanguinis són els punts de baix, similar a la barrera hematoencefàlica, però molt més accessible ja que està en l’ull. Es treu el cristal·lí i queda buit en forma de copa. S’omple amb solució de tripsinaEDTA, i doncs penetra a la paret i va alliberant les cèl·lules. Recollim tota la papilla cel·lular, i el cultivem en plàstic, un medi amb sèrum, i tenim la sort de que les cèl·lules que s’adhereixen són les que volem. En laca són les cèl·lules que volíem, que s’enganxen molt bé, les cèl·lules que volíem proliferen, aquestes sinteritzen melanina, un pigment. Doncs per demostrar que les cèl·lules són les que són, s’han de caracteritzar.
Exemple 5: aïllament de cèl·lules endotelials de aorta bovina: BAEC Aorta molt gran. Van al matadero, i directament posen l’aorta en un cubell amb antibiòtics, però 9/10 vegades no aconsegueixen que no es contamini. La aorta és un vas que té artèries intercostals, per poder aconseguir el mateix efecte per omplir-los amb tripsina (igual que l’ull).
La aorta es pina per la part inferior, es tanquen els intercostals, s’omple de col·lagenasa i s’incuba, volem que la col·lagenasa penetri però no massa, si penetra massa salten cèl·lules musculars a part de les endotelials, és a dir volem que l’enzim passi darrera de la primera capa i caigui la primera capa, per això deixem l’enzim molt poc temps, i piquem perquè saltin. Doncs acabem tenint una monocapa, però 9/10 vegades acabem amb un cultiu ve llevat ja que ha s’ha contaminat per l’ambient on s’ha extret.
Exemple 6: aïllament cèl·lules del lecho vascular d’una vena de cordó umbilical humà Es tanca per un extrem, es neteja la sang i s’omple amb col·lagenasa, s’incuba un temps que depèn del lot, ja que la col·lagenasa no està pura, es recull en un medi amb gran quantitat de sèrum i es sembra. Per què serveixen aquestes cèl·lules? Per demostrar que són endotelials s’utilitza un marcador de bon bilchrand es veu un marcatge en el citosol de les cèl·lules.
Solament existeixen models de línies primàries, doncs és difícil d’estudiar. Tenim una sola línia que s’ha treballat durant 15 anys, ECV, que es pensava que era estable endotelial, però s’havien equivocat, ja que és de colon.
Veiem la formació de vasos sanguinis in vitro. Posem VGF, al posar-li, les cèl·lules comencen a agrupar-se en fila (després d’unes 3 hores), i aleshores amb el citosol formen un tub. Són estructures protovasclars, vasos sanguinis in vitro. Podem fer experiments d’aquest tipus, tenim un cultiu control que amb el llarg del temps no forma les estructures, però després tenim un equip que al posar-li VGF forma l’estructura de baix. Volem veure si hi ha una substància amb acció antiangiogenica veiem que si és així al posar-li VGF que no es formen les estructures. Doncs podem saber quines tenen molècules antiangogenica i quines tenen molècules proangogènica.
Experiment 7: isolation of mouse lung endothelial Cells (MLEC) Neonatal Revista JOVE, el procés consisteix en aïllar els pulmons, els disgreguem enzimàticament i mecànicament, i aleshores fem dues purificacions seqüencials amb anticossos amb boletes magnètiques contra PECAM i ICAM. WEB: PROTOCOL!!! Que diu el que diu el vídeo! SHA DE VEURE!!! Se sembren en placa, esperen 3 dies i fan una segona separació utilitzant un segon anticòs, les poblacions que superen les dues separacions són les que volen. Això ho fan per aïllar, aquestes cèl·lules precursores de endoteli vascular pulmonar.
Per tractar un tumor, podem eliminar-lo del cos, intentem matar les cèl·lules que es divideixen, el problema és que maten les cèl·lules de la regeneració de la pell: cau el cabell, envelleix més ràpidament (quimioteràpia). Una altre estratègia és que inhibim el procés de formació de vasos, procés normal en l’organisme, identifiquem molècules que provoquen que es formi un vas nou, ja que aquestes cèl·lules tumorals diuen que no arriba oxigen, fa que la cèl·lula endotelial es divideixi formant una gemma cap a la senyal de falta d’oxigen. Doncs intentem evitar que la senyal es produeixi. Per tant hem d’entendre els mecanismes moleculars.
Veiem un mecanisme experimental on fan primer l’anticòs: PECAM 1, aquesta la tenen certes cèl·lules que volem aïllar, on no tenen unida una bola magnètica, i formen un complex amb un secundari que sí que la tenen unida. La segona part de l’experiment és aplicar aquest complex a la cèl·lula i aïllar-la. MPC: on es posa el tub, és l’imant, doncs les partícules queden enganxades a la paret. Es resuspenen les boletes. I formen el complex.
Ara purifiquem les cèl·lules: s’han de triturar les cèl·lules. S’agafa teixit pulmonar i es talla amb tisores. Tallen primer mecànicament amb les tisores, i obtenen una papilla tissular, ... malla (70micres), tela de mosquitera, passa perquè els restes no passin i quedin les cèl·lules, s’incuben amb anticossos, quedant-se amb les cèl·lules tetanina amb imant. Se sembra una placa amb gelatina.
Exemple 8: fully differentiated white adipocytes isolation Cèl·lula en que més del 80% és una gota de triacilglicèrids i glicerol sense cap mena de capa, i si es mou una mica, la membrana cel·lular s’unirà, i alliberarà l’adipòcit (no pot barrejar-se), quedarà buit. Tenen una densitat menor al medi de cultiu: es fa un medi en sostre. Omplim l’ampolla amb medi, i deixem que les cèl·lules flotin i quedin unides al sostre, fem que quedin ben unides i al cap d’unes setmanes les girem. Al cap de poc temps d’estar amb poc temps de unir-se, la gota segueix escapant. Volem la gota de greix, ja que el metabolisme de la cèl·lula dependrà molt de si la cèl·lula està carregada o no.
Exemple 9: aïllament de cèl·lules de la pell i de diferents mucoses En la mostra de pell que partim és pell humana, de mitjana edat o de nen, separem les dues capes (epidermis de la dermis) i per això fem servir una solució de col·lagenasa o dispasa. I tractarem les dues capes amb tripsina. Obtenim un cultiu de fibroblasts (estructures allargades) i cultiu de queratinocits: cèl·lules més boles que són fibroblasts, en realitat el que fem durant la sembra d’aquests és dos cultius en paral·lel, comencem el cultiu d’una línia cel·lular que s’anomena 3T3, després de 48hores tractem aquestes cèl·lules amb mitomicina C, que les bloqueja perquè no puguin fer síntesi, paren cicle cel·lular, tenim una població de cèl·lules vives però que no poden proliferar. Sobre aquesta població sembro els queratinocits, tenim fibroblasts i sobre sembro els queratinocits. Els fibroblasts d’aquesta capa actuen com a feeder layer (superfície d’alimentació), ja que secreten factors perquè puguin créixer els queratinocits. Bloquegem el creixement de fibroblasts, ja que sinó creixen més ràpid que els queratinocits. Un cop obtinguda la població, separem l’epidermis de la dermis. Els fibroblasts els mantenim en cultiu.
Podem combinar els dos sistemes per reconstruir una pell humana, tenim una dermis on tenim fibroblasts i una epidermis que formen un epiteli queratenitzat. Això és fa: agafem fibroblasts humans, col·lagen en solució i amb DMEM ho posem en la placa. Posem gotes d’hidròxid de sòdic (alcalinitza el pH), fa que el col·lagen gelifiqui, reduint la mida. Estructura que té en l’interior els fibroblasts vius, fa que estructura baixi, i aprofitant l’espai que deixa l’anell posem queratinocits. Tenim monocapa de queratinocits, si la dermis esta a baix es divideixen de costat, perquè s’enterin que a dalt està fóra, aixequem això així els queratinocits toquen l’aire, doncs s’enteren de que hi ha un dins i un fora, així es divideixen cap amunt, formant un epiteli estratificat. Aquesta estructura que formem és una pell humana reconstituïda, no és pell, ja que perquè ho fos faltarien vasos sanguinis, glàndules sebàcies, glàndules sudorípares... és una estructura bàsica.
Això permet estudiar processos de diferenciació, permeabilitat, resposta de fàrmacs, s’utilitzen com a vendes vives.
Exemple 10: aïllament de hepatòcits de rata Es realitzen mitjançant una ____ i una solució primer de SPS?... quan queda netejat completament de sang, té un color clar, un cop netejat es confon amb la dissolució de col·lagenasa, tres canals, de manera que utilitzant els canals de dins de l’òrgan podem enviar la solució enzimàtica i es pot assegurar una disgregació molt potent. Se obté una papilla de cèl·lula hepatòcites. La mostra animal es pot obtenir el òrgan sencer, però si es tracta d’un fetge humà, per fer un aïllament és difícil perquè solament es té fragments molt petits, quan es fa una biòpsia, per possible tumor hepàtic, rodejat per teixit sa que s’utilitza per fer un aïllament. Aprofitant aquest sistema és fa un dissolució de col·lagenasa....  sistema per obtenir micromostres.
Tenen lloc coses molt indesitjables. Xenobiòtic, molècula que no correspon al nostre organisme, i que el nostre cos du a terme un procés d’eliminació, normalment per el ronyó, normalment molt hidrosoluble i hiposoluble, per passar primer a través de la membrana, i després per poder eliminar-ho per ronyó. Enzims molt polimòrific, conjunt que cadascun de nosaltres té un patró diferent a la persona del costat. Doncs quan apliquem un fàrmac, a vegades obtenim respostes molt diferents a les esperades. Predir aquestes reaccions és molt important pels antibiòtics, l’única manera de poder predir les respostes és a través dels hepatòcits. Ex: dia 4 han deixat d’expressar, en els hepatomes moltes activitats no s’expressen.
Doncs s’agafen col·leccions d’adenovirus, i controlem .....? Perquè utilitzem tot aquest tipus de tecnologia? Exemple 11: cultiu de neurones neonatals de ratolí Procés on agafem embrions a una fase avançada (dia 21), li agafen el cap i el cervell, i disgreguen el cervell amb papaïna, i es posen en una placa on s’adhereixen les neurones, les cèl·lules endotelials i grials. Aquest complex es manté diversos dies fins el dia 4 s’afegeix un agent citostàtic que s’utilitza en la quimioteràpia del càncer, i el que té lloc és que les cèl·lules que proliferen com les griales moren, però les neurones no perquè no proliferen, i es mantenen una setmana perquè després moren. Cultiu primari, mort selectiva (moren les que proliferen).
Exemple 12: aïllament de precursors mesenquimals de teixits adipós humà L’únic aïllament que parlem de cèl·lules mare. Disposem de 3 grans teixits de cèl·lules mare: precursors condicionats, com els queratinòcits de la pell, cèl·lules abundants en un teixit adipòs blanc i té capacitat de diferenciar-se a tots els tipus cel·lulars mesenquimàtics. Per tant s’aïlla teixit adipós blanc humà, .....
Tallem les cèl·lules, les teixíem en medi DMEM, volem que es mantinguin indiferenciades.
Tenen forma de fibroblast allargats. (DIA 5 baix, cos embrioide un cúmul de cèl·lules).
Diferenciació: canviem medi i al cap d’uns 7 dies es converteixen en adipòcits. Però si en comptes d’això li posem a la població uns altres factors, podem convertir-les en miòcits, condròcits, osteòcits. Normalment són hormones, factors de creixement, factors de diferenciació.
El procés que es du a terme in vitro, és que començaran a acumular greix per fer aquestes estructures. Pot servir-nos per estudiar moltes coses, per fer estratègies industrialment, caracteritzant un producte es buscava que tingues un efecte anticel·lulítics, aquests productes mouen molts diners a Europa l’any. El que es busca és que faci idealment dues coses: degradi la carrega de greix en el teixit adipós (exercici o amb molt cafè, que fa beta-oxidació), recuperar-la és molt ràpida al tenir glucosa, doncs el que necessitem és que la població de cèl·lules disminueixi i evitar que es formin de noves, doncs matem-les i impedir que es formin de noves. El que es volia era impedir que es formin noves, doncs el que s’indueix és el procés de diferenciació lipogèniques amb absència o presència a diferents concentracions del fàrmac.
Si la concentració augmenta es pot veure la diferenciació disminueix.
Ens saltem el 13 Exemple 14: aïllament de monòcits de sang perifèrica Dues poblacions diferents que representa un procés d’aïllament on no hi ha disgregació enzimàtica ni mecànica. Mecanisme d’aïllament on diluïm la població de cèl·lules mononuclears sanguínies, posteriorment fem una incubació amb immunobeeds? Exemple 15: cultiu de línies continues El cultiu de cèl·lules continues en principi és molt més senzill que el de les línies primàries, ja que el sèrum és més fàcil... font d’informació: instruccions o en la base de dades  American Type Culture Collection (ATCC) (USA), European Collection of Cell Lines (ECACC). Per tant utilitzant aquestes dues fonts d’informació sabrem les condicions en les que hem de mantenir el cultiu. Al final del procés tenim una població que creix i que ocupa tota la placa, doncs hem d’agafar algunes cèl·lules d’aquella placa i posar-la en una altre. Aquestes cèl·lules tindran un creixement determinat, el traiem al final de la fase exponencial, així la fase de latència serà més curta que si les traiem en la fase final.
Les cèl·lules s’enganxen a les proteïnes de matriu extracel·lular que estan alhora unides al plàstic. Per passar d’una placa a una altre, doncs, les farem passar per un cicle: POWER. Hi ha moltes altres estratègies, per exemple: shake-off i scraping, dues estratègies basades en la brutalitat.
Shake-off: botella en que les cèl·lules estan creixent i el que fan per agafar unes cèl·lules d’allà, és donar un cop a la taula perquè les cèl·lules que estan mig lliures, s’acaben de desunir. Quan es divideix necessita atraure el citoplasma, es fa rodona, està poc adherida, en aquesta fase es molt sensible a l’agitació mecànica. Doncs obtenim cèl·lules i a més en el estat de mitosi, el rendiment, però, és molt baix, per sota del 1%. Doncs es fa en situacions molt excepcionals.
Scraping: tècnica en la qual agafem una espàtula plana i rasquem la superfície, això no serveix per agafar les cèl·lules i plantar-les en la següent placa, degut a que les rebentem. Si que serveix però per purificar molècules específiques, per exemple un receptor de membrana.
Les altres estratègies es basen en tripsina sola, una prenateja i després tripsina, .. diferents concentracions de tripsina. El més comú és la prenateja, protocol de pràctiques.
Un cop traiem les cèl·lules, hem de saber quantes cèl·lules hi ha presents, hem de contar, no només quantes cèl·lules estan, sinó que a més quantes estan vives. Amb la tècnica del Tripan Blue, permet estimar la població de cèl·lules que estan molt danyades. Tenim cèl·lules OK, KO i compromeses (amb poca viabilitat però no mortes). OK: fan filles en la següent generació. KO i compromeses en la següent generació no fa filles. Doncs el blau de tripà, entra per porus de la membrana mortes, i veiem com a blaves les cèl·lules KO. No dona molt bon comptatge, ja que estimem per sota, perquè veiem les cèl·lules compromeses com a blanques, igual que les OK.
Hi ha una estimació que si que permet veure les cèl·lules OK solament: tècnica del rojo neutró.
Les cèl·lules s’exposen a un agent col·loïdal vermell, que entrarà solament a cèl·lules per endocitosi, i doncs les cèl·lules tenyides seran les que estan OK, les que fan endocitosi activament. Les altres es veuran blanques. Rojo neutró és molt millor que tripan blue. Com que casi sempre en biologia, s’intenta buscar equilibris. Perquè es vegi endocitosi, les cèl·lules han d’estar amb rojo neutó unes 5 hores, i aquestes cèl·lules en suspensió moren, no aguanten massa temps. Doncs tot i ser millor, no s’aplica.
Un cop realitzat el comptatge i determinada la viabilitat, decidim l’split ratio que fem la següent fase. Serà baixa quan es tracti d’una línia primària i alta quan sigui una línia secundaria continua. Quin valor necessitem per determinar la Split ratio? Les cèl·lules vives (no interessen les mortes). Sempre utilitzarem la fracció de la població de cèl·lules vives.
Mantenim el cultiu, sabem com establir-lo i mantenir-lo. Podem trobar una situació en la que vulguem aïllar una subpoblació cel·lular, pot ser perquè ens interessi més o volem seleccionar aquelles cèl·lules que hagin incorporat el marcador genètic. Per exemple cèl·lules que volem introduir un plasmidi, per transfecció, volem buscar dos sistemes de expressió: temporal (incorpora en el genoma i .....) o per ? (posem en el plasmidi un marcador de selecció, plasmidi d’expressió en una població cel·lular, no totes les cèl3lules es modifiquen, sinó solament una petita fracció, solament les de color lila). Posem un cilindre sobre les cèl·lules vives, i per tant permet posar tripsina allà i recollir solament les cèl·lules d’aquell clon i podem aïllar-les en una població determinada.
Un cop tenim les colònies ben aïllades, mirem a través d’un microscopi de fases i d’alguna manera marquem la colònia. Agafava un anell metàl·lic, i la col·locava al voltant de la colònia (banyat primer de silicona), i afegia tripsina just allà, per separar-les. Aïlla la colònia i la posa en una ampolla diferent, que la incubem de peu per tenir menys superfície d’adhesió.
Clonatge en agar, en comptes d fer colònies d’adhesió, fem colònies en un medi semi-sòlid. Les que creixen fan una espècie de bola.
Estratègia que permet fer un clonatge, que és l’estratègia per anticossos monoclonals. Quan volem obtenir un anticòs monoclonal, què és un anticòs monoclonal? Anticòs produït, cada animal per un antigen produeix anticossos diferents, poblacions d’anticossos diferents, degut a que cadascun de nosaltres tenim recombinacions genètiques molt diferents, això és el policlonal, in vivo el policlonal no existeix, in vitro si. Quan disgreguem, tenim un cultiu primari que mor, però si agafem cèl·lules de melsa de ratolí, per créixer necessita una substància (és immortal), aconseguim que es produeixin fusions a l’atzar, la fusió entre una cèl·lula immortal i una de les cèl·lules primàries, és una cèl·lula immortal que fa anticossos. Les úniques que creixeran en un medi .... només creixen la fusió, això se l’anomena hibridoma, tenim una barreja molt gran on solament la cèl·lula vermella és la que volem, fem una pesca, com ho fem? Un milió de cèl·lules en 10 plaques, i fem que produeixin anticossos. Posem antigen, sobre el medi, solament en els que hi ha anticòs, formaran un complex i donarà positiu.
Aquesta placa la divideixo en 10 plaques, primer a mil cèl·lules per placa, i anem diluint fins a 1 cèl·lula per placa, però la cèl·lula que obtenim serà la cèl·lula que volem. En aquest procés podem aïllar diferents monoclonals.  clonatge per dilució Cell storage: freezing (-80/-135 to -196ºC) Arriba un moment, en el que el cultiu ja no la necessitem més, i doncs parem la línia, on deixem la línia en un estat metabòlic de aturació, on el metabolisme en si existeix però és extremadament lent, doncs pot viure uns milions d’anys. La temperatura es d’uns -200ºC, i és un procés molt lent (procés de congelació). I es realitza en presència del dimetil sulfòxid.
Aquest procés es basa en un agent perquè té dos efectes: es deshidratant i impedeix que es formin cristalls de gel (que trenquen la cèl·lula). El que es faran són cristalls pseudomòrfics. En aquestes condicions es congelen i recuperen cultius amb una viabilitat del 99%.
Hi ha altres casos que es fan servir la nitrificació en la que a mostra es crioprotegeix amb solucions de sacarosa i es congela bruscament en nitrogen, i es fixa per mostres de mida gran com per exemple un embrió.
El agent criopreservant més potent és el DMSO però hi ha altres com el glicerol, però gairebé sempre fem servir DMSO al 10%. La millor dilució de congelació és DMSO i sèrum boví fetal (la millor i més cara).
Finalment aquesta mostra que hem obtingut...
Hi ha una sèrie de requeriments que s’han de fer abans de la congelació, ho veiem a la taula.
Quan es congela una línia en situació d’adquisició, si és una línia continua, s’intenta congelar en els passos més baixos. Línia contínua  clonar, seleccionar i amplificar.
El procés de congelació es realitza de manera gradual.
Es produeix un fenomen curiós que és la presència d’un punt de eutètic  formació dels cristalls d’aigua. Hi ha una pujada de temperatura  es baixa molt la temperatura per evitar aquesta pujada.
Sempre ho congelem en criotubs els quals tenen una paret molt gruixuda i una goma que impedeix que entri el nitrogen líquid a dins.
El procés de congelació es fa seguint un protocol i hem d’entendre el perquè de cada pas.
Medis: - DMSO: al 10% amb diferents solvents. El millor és el primer ja que aconseguim la màxima viabilitat.
Altres Descongelació Es un bany d’aigua a 37ºC, si sabem que no ha estat en contacte amb nitrogen.
Si tenim la sospita de que hi ha entrat nitrogen  contenidor tancat.
DMSO és tòxic a 37ºC, per tant, s’ha de diluir quan encara queda una mica de gel, per tal de que la concentració de DMSO baixi, i així no sigui tòxic.
...