Mòdul 4: Regulació de la Transcripció Gènica (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Medicina - 1º curso
Asignatura Genòmica Humana
Año del apunte 2014
Páginas 10
Fecha de subida 19/02/2015
Descargas 35
Subido por

Vista previa del texto

Mòdul  4:  Regulació  de  la  Transcripció  Gènica     Totes  les  cèl·lules  d’un  organisme  provenen  d’una  mateixa  cèl·lula.     A   partir   de   l’especialització   cel·lular   cada   cèl·lula   adquirirà   una   funció,   una   estructura  i  una  localització  específica.  Aquest  procés  està  regulat  per  la  regulació   gènica.     La  regulació  de  la  expressió  genètica  a  nivell  transcripcional  és  un  mecanisme  de   control   propi   de   molts   processos   biològics   com   el   creixement,   la   diferenciació   cel·lular  i  metabolisme.       “   La   base   molecular   de   la   regulació   transcripcional   de   l’expressió   gènica   consisteix   en  la  unió  de  proteïnes,  que  actuen  en  trans,  a  seqüències  de  DNA,  que  actuen  en   cis.  “   Durant   la   transcripció   es   requereix   la   participació   de   varis   factors   que   inclouen  els   complexos   remodeladors   de   cromatina,   factors   del   complex   pre-­‐iniciació,   el   complex  RNA  polimerasa  II  i,  a  més  a  més,  es  requereix  d’altres  factors.       Tenim  tan  factors  en  cis  com  factors  en  trans.     Els  principals  factors  en  cis  són:   -­‐ Promotors:  situats  en  seqüència  proximals.   Marquen  on  s’uneix  la  polimerasa.  Hi  ha  dos  tipus:     o Basal:  situat  on  s’inicia  la  transcripció,  es  troba  inclòs  al  gen.     o Proximal:   és   la   regió   immediatament   upstream   del   promotor   basal   o   TSS.   Sol   presentar   múltiples   llocs   d’unió   per   a   reguladors.   Es   situa   prop   d’una   illa   CpG,   possibilitat   de   dinucleòtids   units   per   enllaç   fosfat  en  la  mateixa  cadena.  Inlcou  500-­‐2000bp  amb  abundants  C  i  G.   C  tendeix  a  estar  metilada,  però  no  en  les  illes  del  TSS.     -­‐ Potenciadors  o  enhancers:  regions  situades  en  seqüències  distals.   Agrupen   múltiples   elements   de   seqüència   (cluster)   reconeguts   per   reguladors  transcripcionals  (activadors).     Tenen  gairebé  sempre  un  efecte  positiu  sobre  l’expressió  gènica.    Funcionen  independentment  de  la  distància  i  la  orientació.     Interaccionen  amb  els  promotors  mitjançant  la  formació  de  llaços  del  DNA   (looping).     -­‐ Silenciadors  o  silencers:  també  es  situen  en  seqüències  distals.     Actuen   de   manera   similar   als   potenciadors   però   tenen   un   efecte   negatiu   sobre  l’expressió  genètica.     -­‐ Aïlladors  o  insulators:  es  situen  també  en  seqüències  distals.     Limiten  l’acció  dels  reguladors  transcripcionals  a  dominis  espacials  definits.     Impedeixen   la   comunicació   entre   promotors   i   potenciadors   o   silenciadors,   tot   i   que   no   se’n   coneix   el   mecanisme   però   no   els   inhibeix   ni   exerceix   un   efecte  negatiu  sobre  el  gen.     Impedeix   la   propagació   dels   estats   repressius   de   la   cromatina   (heterocromatina).     Sol  consistir  en  regions  de  0,5-­‐3  kb  l’acció  de  les  quals  sí  es  dependent  de  la   posició  però  no  de  l’orientació.       A  l’altra  banda,  els  factors  en  trans  són  (reguladors  transcripcionals  eucariòtics):     -­‐ GTFs   o   Factors   Generals   de   Transcripció:  implicat  en  la  regulació  de  la   iniciació  de  la  transcripció  per  RNA  polimerasa.  Seleccionen  el  lloc  d’inici  de   la  transcripció.  Són  necessaris  per  a  la  síntesis  de  tots  els  mRNA.     -­‐ FTs   o   Factors   de   Transcripció:  són  proteïnes  que  reconeixen  seqüències   específiques   del   DNA.   Regulen   la   freqüència   de   l’inici   de   la   transcripció   unint-­‐se   generalment   a   promotors   (factors   cis),   tot   i   que   es   poden   unir   a   altres  factors  i  fins  i  tot  directament  a  la  RNA  polimerasa.     Actuen  sobre  diferents  dominis:     • Homeodominis:   alfa   hèlix   que   té   associada   altres   alfa   hèlix.   Interacciona   amb   el   solc   major.     • Hèlix-­‐llaç-­‐hèlix:   comú   entre   bacteris.   Una   cadena   forma   dímers   i   l’altra   interacciona   amb  el  DNA.     • Cremallera   de   leucina:   són   dues   hèlixs   alfa   que   interaccionen   mitjançant   enllaços   entre   leucines,   aminoàcids   hidrofòbics,   cada   7   posicions.     • Dit   de   zinc:   Aquest   últim   és   el   més   comú,   una   estructura   coordinada   formada  per  un  àtom  de  Zn  i  dues  cisteïnes  formant  una  hèlix  alfa.             Factors  de  transcripció   humans  segons  el  seu   domini  d’unió  al  DNA             En  altres  paraules,  els  FTs  activen  o  inhibeixen  l’expressió  i  estabilitzen  el   complex  abans  de  la  transcripció  unint-­‐se  al  DNA.  Fins  i  tot,  poden  reclutar   proteïnes  que  modifiquen  les  histones.         -­‐ Co-­‐activadors/co-­‐repressors:   són   factors   que   no   s’uneixen   directament   al   DNA,   sinó   proteïnes   reclutades   pels   FTs   que   activen   o   inhibeixen   la   transcripció.     Són  els  responsables  de  l’activitat  dels  FTs.     Hi   ha   un   gran   nombre   de   factors   de   diferent   naturalesa   que   poden   actuar   com   activadors     o   repressors   en   funció   sobre   quina   cèl·lula   actua   o   de   les   condicions  ambientals.       Epigenètica   Quan   parlem   d’epigenètica   ens   referim   als   canvis   en   l’expressió   genètica   que   no   comporten   canvis   en   la   seqüència   del   genoma.   Ens   permet   explicar   la   diferència   entre  humans  i  ximpanzés  tot  i  compartir  el  99%  de  gens.     Són   canvis   perdurables   i   que   es   poden   heretar   tot   i   no   comportar   un   canvi   en   la   seqüència  de  DNA.     Es  basa  en  la  modificació  d’histones  i  la  metilació.       Les   cues   N-­‐terminal   de   les   histones   són   regions   llargues   i   desestructurades.   Poden   patir   canvis   per   acetilació,   deacetilació,   metilació,   demetilació,   isomerització,   fosforil·lació   o   ubiquitinització.       Si  acetilem  les  lisines  (K)  neutralitzem  l’aminoàcid  treien   la   càrrega   positiva   a   la   histona.   Aquesta   pèrdua   de   càrrega   (efecte   directe)   fa   que   la   histona   no   interaccioni   tan   fort   facilitant   la   transcripció.   També   té   un   efecte   indirecte,  positiu  o  negatiu  en  funció  de  les  proteïnes  que  si  adhereixen.       La   metilació   del   DNA   es   realitzada   per   la   DNA-­‐metiltransferasa   (DNMT),   que   reconeix   la   modificació   en   la   histona   i   metila   el   DNA   pròxim.   Trobem   diferents   clasees:     -­‐ DNMT1:   de   manteniment.   Detecta   on   està   hemimetilat   i   metila   la   citosina   corresponent.     -­‐ DNMT3:  de  novo.     Té   lloc   sempre   en   les   cistosines,   al   5è   C   del   sucre   del   nucleòtid.   La   metilació   impedeix   la   unió   de   FT,   en   alguns   casos   arribant   a   impedir   la   transcripció.   Les   illes   CpG   no   acostumen   a   estar   metilades.     MECP2  és  la  proteïna  que  reconeix  el  grup  metil  i   recluta   un   co-­‐repressor,   per   la   qual   cosa   la   metilació  acostuma  a  ser  repressora.  També  pot   ser  repressora  perquè  no  es  reconeix  el  domini  d’activació.       La   inactivació   del   cromsoma   X   es   produeix   en   el   cas   de   les   dones   que   tenen   la   dotació  XX  per  evitar  la  duplicació  de  gens,  en  els  homes  no  té  lloc  puix  que  són  XY   (només   tenen   una   còpia   de   X).   El   cromosoma   que   s’inactiva   està   determinat   a   l’atzar  en  cada  cèl·lula.     X  codifica  836  proteïnes  i  Y  56  proteïnes.     XIC  (Centre  Inactivació  X)  codifica  un  RNA  llarg  que  no  codifica  una  proteïna,  és  un   factor   que   anomenem   XIST   que   actua   en   cis.   Interacciona   amb   proteïnes   que   provocaran  una  metilació  del  DNA,  inactivant  el  cromosoma  X.  El  manteniment  no   depèn  de  XIST  sinó  de  les  proteïnes  amb  que  interacciona  XIST.       *Síndrome   de   Rett   és   un   trastorn   en   el   desenvolupament   neural   exclusiu   de   les   dones   i   mortal   en   els   homes.   Provoca   la   detenció   del   desenvolupament   als   6-­‐18   mesos,   la   regressió   de   les   habilitats   adquirides,   la   pèrdua   de   la   parla,   moviments   estereotípics  de  les  mans  i  retard  mental.       Impremta  genètica   Fa   referència   a   la   heretabilitat   de   determinats   estats   d’expressió   mitjançant   mecanismes  que  depenen  de  l’origen,  patern  o  matern,  del  gen  considerat.     En  general,  com  els  humans  som  éssers  diploides,  tenim  dues  còpies  de  cada  gen   (al·lels)   localitzats   en   cromosomes   homòlegs   que   heretem   dels   nostres   progenitors.  En  la  majoria  dels  casos  ambdues  còpies  s’expressen.  Però  existeixen   casos   en   que   un   dels   al·lels   està   silenciat   perquè   es   marca   de   forma   diferencial,   mitjançant  un  mecanisme  epigenètic  en  un  dels  progenitors.     Hi  ha  gens  que  només  s’expressen  del  cromosoma  matern  (pex:TP73)  mentres  que   altres  gens  només  s’expressen  del  patern  (pex:GPR1).  Actualment  es  coneixen  55   gens   que   només   s’expressen   des   de   el   cromosoma   patern   i   28   des   de   el   matern.   Hi   ha   més   de   100   gens   per   als   que   es   postula   que   existeix   aquest   fenomen   de   silenciació  d’un  al·lel,  tot  i  que  no  està  del  tot  demostrat.       *Síndrome   de   Beckwith-­‐Wiedemann:   es   caracteritza   per   un   trastorn   en   el   desenvolupament   amb   una   incidència   de   1:15000.   Els   afectats   tenen   un   sobrecreixement  fetal  provocant  un  naixement  prematur.  Durant  la  infància  tenen   una  major  susceptibilitat  a  determinats  tipus  de  càncer.  S’associa  a  mutacions  del   cromosoma   11   (11p15.5);   en   particular   amb   l’expressió   dels   gens   Igf2   (un   factor   de  creixement)  i  H19  (RNA  regulador  implicat  en  la  supressió  de  tumors).     En   condicions   normals   Igf2   només   s’expressa   des   del   cromosoma   11   patern   ja   que   els   activadors   units   a   un   potenciador   localitzat   downstream   activen   la   seva   expressió.  Això  és  possible  perquè  part  de  la  seqüència  del  DNA  intermèdia  entre   el  gen  i  el  potenciador  està  metilada,  el  qual  evita  que  la  proteïna  CTCF  s’uneixe  a   l’aïllador  anomenat  ICR  o  Imprinting  Control  Region.     A  més  a  més,  com  el  gen  H19  també  està  en  la  regió  metilada  la  seva  expressió  es   troba   silenciada,   sent   refractari   a   l’acció   del   potenciador.   Tot   i   que   aquest   gen   s’expressa   al   cromosoma   matern,   puix   que   no   està   metilat   i,   per   tant,   el   potenciador  downstream  activa  la  seva  expressió.  D’altra  banda,  CTCF  pot  unir-­‐se   al   ICR   el   que   comporta   que   els   efectes   activadors   del   potenciador   ara   no   poden   atrapar  al  gen  Igf2  (ja  que  CTCF  interrumpeix  la  comunicació  entre  ambdós).     En   molts   individus   amb   aquest   síndrome   s’ha   trobat   que   ambdós   cromosomes   estan  metilats.  Per  això,  el  gen  Igf2  s’expressa  tan  des  del  cromosoma  patern  com   matern.  Mentrestant,  el  gen  H19  estaria  silenciat  en  ambdós  cromosomes.                     RNA  de  transferència  iRNA   Un   mecanisme   de   regulació   de   la   expressió   gènica,   lloc   de   rellevància   durant   la   última  dècada,    és  la  denominada  interferència  mitjada  per  iRNA.     La   majoria   d’eucariotes   posseeix   una   maquinària   proteica   capaç   de   processar   RNAs  de  doble  cadena  per  a  donar  lloc  a  RNAs  molt  curts  de  21-­‐25  nucleòtids  que   tindran  una  funció  repressora  de  l’expressió  gènica.       En  general,  els  RNAs  precursors  de  doble  cadena,  poden  tenir  dos  orígens.     -­‐ miRNAs  o  microRNAs:  són  RNAs  codificats  en  el  genoma  de  l’organisme.     -­‐ siRNAs   o   small  interfering   RNAs:  són  RNAs  sintètics  creats  al  laboratori,   artificials.     Quan  nosaltres  creem  un  RNA  de  doble  cadena  podem  crear  una  cadena  i  una  altra   perfectament   complementària   a   la   primera.   No   obstant   això,   els   precursors   dels   microRNAs   (codificats   en   el   nostre   genoma)   no   posseeixen   una   estructura   perfectament   de   doble   cadena.   Els   primary   miRNA  o  pri-­‐miRNA  Es  formen  a  partir  d’un  RNA   més   o   menys   llarg   de   cadena   simple   que   es   plega   en   gran   part   de   la   seva   longitud   per   a   formar   regions   de   doble   cadena,   però   també   posseeix   zones  de  cadena  simple  (llaços).  Aquest  precursor   es   processat   en   el   nucli   per   un   enzim   nucleasa   anomenat  Drosha.  Posteriorment,  ja  al  citoplasma   torna   a   ser   processat   per   un   altra   nucleasa   anomenada   Dicer,   responsable   també   del   processament   dels   precursors   dels   siRNAs.   El   resultat   final   és   la   generació   d’un   RNA   de   doble   cadena  de  21-­‐25  nucleòtids.     Ambdues   nucleases   reconeixen   multitud   de   RNAs   la   seqüència   dels   quals   varia.   Per   tant,   aquests   enzims   reconeixen   els   seus   substrats   per   la   seva   estructura   i   no   per   una   seqüència   de  bases  específica.     El   RNA   curt   de   doble   cadena   generat   per   Dicer   es   reconegut   i   incorporat   en   un   complex  multiproteic  anomenat  RISC  o  RNA  induced  silencing  complex.  Aquí  una   cadena   del   RNA   es   descartada,   i   l’altra   cadena   es   manté   com   part   del   complex.   A   aquesta   cadena   se   la   denomina   RNA   guia.   Aquest   RNA   confereix   especificitat   al   complex   RISC   per   a   operar   sobre   unes   dianes   o   unes   altres.   Això   es   duu   a   terme   mitjançant   hibridació   d’aquest   RNA   amb   una   seqüència   complementària   de   DNA   o   RNA  diana.     En   alguns   casos   RISC   carregat   amb   el   RNA   guia   pot   viatjar   al   nucli   i   silenciar   directament  un  gen  o  regió  cromosòmica.  No  obstant,  el  mes  comú  és  que  RISC  no   actui   a   nivell   transcripcional   sinó   que   provoqui   el   silenciament   de   la   expressió   gènica  succeeixi  a  nivell  post-­‐transcripcional,  degradant    un  determinat  mRNA  (ja   que   un   altre   component   de   RISC   és   una   nucleasa)   o   inhibint   la   traducció.   Quin   dels   dos   es   dugui   a   terme   sol   dependre   de   lo   perfecta   que   sigui   la   complementarietat   amb   el   RNA   guia:   com   més   complementarietat   hi   hagi   més   probable   és   que   es   degradi.     El   silenciament   gènic   mitjançant   iRNA   és   un   procés   molt   eficaç.   Això   es   deu   a   dues   característiques  del  mecanisme.     1. La   cèl·lula   conté   RNA   polimerases   capaces   d’amplificar   els   miRNAs   o   siRNAs   formats   per   Dicer.   Per   tant,   tenim   una   amplificació   de   la   senyal   degradadora.     2. RISC  actua  de  manera  catalítica,  és  a  dir,  no  es  consumeix  en  el  procés.  Així   un   únic   complex   RISC   carregat   amb   el   seu   RNA   guia   serà   capaç   de   degradar   molts  mRNAs  diana.       Apart   del   paper   regulador   fonamental   que   el   iRNA   té   en   els   processos   fisiològics   normals   de   les   nostres   cèl·lules,   els   si   RNAs   constitueixen   una   de   les   eines   més   potents  en  el  laboratori  d’investigació  biomèdica.  Amb  el  ús  de  siRNAs  podem  de   manera  relativament  fàcil  eliminar  l’expressió  d’un  determinat  gen  i  estudiar  que   succeeix  a  la  cèl·lula  davant  la  seva  absència.     Eliminar  un  gen  a  nivell  del  DNA,  és  a  dir  crear  un  organisme  o  cèl·lula  mutant,  és   una  feina  senzilla  en  bactèries  o  fongs    però  és  més  complicat  en  cèl  de  mamífer.       Regulació  traduccional  de  ferritina  i  transferrina   Els   nivells   de   Fe   del   nostre   cos   han   de   mantenir-­‐se   dins   uns   marges   estrets,   ja   que   tant  un  excés  com  un  defecte  de    ferro  condueixen  a  condicions  patològiques.  El  Fe   forma   part   de   molts   cofactors   com   són   el   grup   hemo   (transport   d’oxigen)   o   els   clusters  Fe-­‐S  (implicats  en  la  producció  d’energia  dins  la  cadena  respiratòria).     També   és   essencial   en   el   funcionament   de   l’enzim   ribonucleòtid   reductasa,   que   s’encarrega  de  generar  desoxiribonucleòtids  a  partir  de  ribonucleòtids  i,  per  tant,   essencial  per  a  la  síntesis  de  DNA.     Quan   la   concentració   de   Fe   corporal   és   baixa   la   funció   de   les   proteïnes   que   depenen  del  Fe  es  veu  ressentida.  A  nivell  patològic,  és  la  principal  causa  d’anèmia.   Pel  contrari,  a  nivells  elevats  de  Fe  estan  associats  a  problemes  hepàtics  i  cardíacs.       El   Fe   de   la   dieta   és   absorbit   pel   nostre   cos   i   passa   a   la   sang,   medi   pel   qual   serà   transportat   per   una   proteïna,   un   transportador   conegut   com   transferrina.   Les   nostres   cèl·lules   regulen   la   captació   de   Fe   mitjançant   l’expressió   del   receptor   transferrina.   A   més   a   més,   també   regulen   la   concentració   citosòlica   de   Fe   lliure   mitjançant  la  producció  de  ferritina,  una  proteïna  que  té  la  capacitat  de  capturar-­‐ lo.     En   ambdós   casos,   la   regulació   dels   nivells   de   ferritina   i   de   transferrina,   es   duu   a   terme  a  nivell  traduccional  mitjançant  un  mecanisme  que  implica  el  reconeixement   d’estructures   secundàries   de   mRNA   per   una   proteïna   reguladora   que   canvia   la   seva  conformació  quan  interacciona  amb  Fe.       En   el   cas   de   la   ferritina,   el   mRNA   de   ferritina   conté   una   estructura  secundària  en  la  regió  5’UTR  que  es  denomina  IRE   o   iron   responsive   element.   Quan   els   nivells   de   Fe   són   baixos   la   proteïna   reguladora   dominada   IRP   o   iron   regulatory  protein    posseeix  una  conformació  que  li  permet   interaccionar  amb  IRE.  Com  a  conseqüència,  aquesta  proteïna   impedeix  al  ribosoma  començar  la  traducció  del  mRNA.     Quna  els  nivells  de  Fe  augmenten,  la  proteïna  IRP  s’uneix  al  Fe  el  que  canvia  la  seva   conformació  i  és  incapaç  d’unir-­‐se  a  IRE.  En  aquest  cas,  el  ribosoma  pot  traduir  el   mRNA  i  generar  nivells  més  elevats  de  ferritina  que  segrestarà  l’excés  de  Fe  lliure   en  la  cèl·lula.         La  regulació  del  receptor  de  transferrina  (TfR)  és  similar   a   la   de   ferritina   però   amb   efectes   finals   contraris.   El   mRNA   del   TfR   conté   cinc   IREs   en   la   seva   regió   3’UTR.   Aquests  no  afecten  la  traducció  del  mRNA  com  era  el  cas   de   la   ferritina   sinó   que   en   aquest   cas   la   unió   de   la   proteïna   IRP,   que   també   succeeix   en   absència   de   Fe,   protegeix   al   mRNA   de   la   degradació   per   part   d’una   endonucleasa   cel·lular.   Així   en   absència   de   Fe,   el   mRNA   és   més   estable   i   la   traducció   molt   més   eficaç   generant   nivells   més   elevats   de   TfR   que   captaran   més   transferrina  (associada  al  ferro)  a  la  sang.  Si  la  concentració  de  Fe  augmenta,  la  IRP   interaccionarà  amb  el  Fe  lliure,  canviarà  la  seva  conformació  i  no  podrà  unir-­‐se  als   IREs.  El  resultat  final  serà  que  el  mRNA  de  TfR  quedarà  desprotegit  i  serà  degradat   ràpidament,  no  es  formarà  TfR.       Aquesta   regulació   implica   augmentar   o   disminuir   els   nivells   de   proteïna   sense   afectar  la  síntesis  de  RNA  i  permet  generar  una  resposta  ràpida  a  les  fluctuacions   en  els  nivells  de  Fe  en  sang  i  intracel·lular.     Es  coneixen  mutacions  que  afecten  a  la  formació  de  IRE  en  el  5’UTR  que  donen  llco   a  hiperferritinemia.         ...