Cultius Cel·lulars T4 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2015
Páginas 4
Fecha de subida 12/03/2015
Descargas 7

Vista previa del texto

1 TEMA 1. INTRODUCCIÓ, HISTÒRIA I EQUIPAMENT BÀSIC.
2 TEMA 2. PRINCIPIS BÀSICS DE CULTIUS CEL·LULARS.
3 TEMA 3. MEDIS, SÈRUM, ADDITIUS 4 TEMA 4. SUPERFÍCIES I ESCALAT Cultivar moltes cèl·lules en flascons és inviable. Per això s’han desenvolupat mètodes que permeten el cultiu a gran escala i ens asseguren el més bàsic per a la seva supervivència: disponibilitat d’oxigen, nutrients i eliminació dels productes de rebuig.
4.1 CULTIUS DE CÈL·LULES EN SUSPENSIÓ. BIOREACTORS.
Les estratègies varien segons si són cèl·lules adherents o en suspensió. Les cèl·lules cultivables en suspensió les podem tenir en bioreactors. El principal problema és que mantenir un gran volum en un tanc que té molt poca relació superfície/volum fa que tingui un intercanvi de gasos poc eficient. Per solucionar-ho hem d’insuflar els gasos que permetin el correcte tamponament d’aquest medi. Quan en un medi líquid hi posem un gas, aquest fa bombolles. Si les cèl·lules toquen les bombolles rebenten, perquè la seva tensió superficial és molt gran. En els bioreactors hi ha una entrada de gas que va a la paret de manera que les bombolles pugen per aquesta i no toquen les cèl·lules. A més d’això, cal tenir un sistema de rotació suau per evitar que les cèl·lules es dipositin. Amb els bioreactors grans el sistema d’injecció d’aire és diferent. Els bioreactors són grans cilindres amb un cilindre més petit al mig, per on s’injecta el gas. Les bombolles es formen a dins del cilindre, on no hi ha cèl·lules, doncs estan al cilindre gran. Un filtre impedeix el seu pas cap al cilindre petit. Les bombolles pujaran pel cilindre petit i tamponaran el medi.
Hi ha cèl·lules que en suspensió necessiten contacte amb la superfície i després es despenen altre cop. El fet de trobar cèl·lules formant “grumolls” posa en evidència aquest fet.
4.2 CULTIUS DE CÈL·LULES ADHERENTS.
En el cas de les cèl·lules adherents hem de tenir present la superfície on creixen. Les hem de fer créixer en vidre, plàstic o poliestirè. Són econòmics i fàcils d’utiltitzar i esterilitzar, resistents a l’activitat cel·lular i els podem modificar per millorar-ne la capacitat d’adhesió cel·lular. El poliestirè és un polímer plàstic hidrofòbic, si li apliquem una descàrrega elèctrica en presència de gasos, aquests es dissocien i part d’ells s’enganxen a la superfície, dotant-la de càrrega i millorant-ne l’adhesivitat. També és possible fer biomatrius, va bé sobretot per cèl·lules que tenen dificultat per adherir-se. Cal no confondre-les amb les feeder layer.
Per incrementar la superfície de cultiu podem augmentar el diàmetre de la placa de Petri, però només fins a un cert punt. Necessitem mètodes per expandir la línia i fer stocks. Com que tenir molts flascons és inviable, tenim un sistema anomenat Multitray, de manera que augmentem la superfície de cultiu fins a 10 vegades.
S’utilitzen en producció.
El sistema Opticell permet emmagatzemar en un volum petit moltes làmines de cultiu. La part central té dues làmines que impedeixen la contaminació però permeten l’intercanvi gasós. Entre els dos filtres es pot injectar medi de cultiu, de manera que les cèl·lules s’adheriran a sobre i a sota. A més té propietats òptiques molt bones.
Sistema d’ampolles rodants. Es tenen ampolles de vide o plàstic, amb medi a dins, en un sistema que va rodant. A mesura que vagi rodant les cèl·lules s’aniran adherint a la superfície. Com més cèl·lules hi hagi adherides, més ràpid podrem fer anar l’ampolla. Les cèl·lules aniran rodant i cada 1 minut aproximadament quedaran submergides en medi, seguidament en acabar de completar la volta estaran intercanviant gasos. Cada 5 dies traiem el medi i en posem de fresc; ens permet un mètode de producció contínua. En aquestes condicions les cèl·lules fan una monocapa, no proliferen sols produeixen.
Sistema de perfusió amb fibres buides –hollow fiber. Consisteix en un seguit de polímers que per dins estan buits. És el mateix que s’utilitza per fer diàlisi: treure la sang del cos, passar-la per un sistema de perfusió per eliminar-ne els elements tòxics i retornar-la de nou al cos. Consisteix en un cilindre recobert per l’interior de milers de fibres formades per un polímer permeable a molècules de determinat MW. Les cèl·lules estan adherides a la part externa. Per l’interior de les fibres passa medi fresc.
Així tenim un sistema permanent de funcionament i producció. Les cèl·lules perceben que estan en una estructura 3D. Amb això podem fer un co-cultiu amb varis tipus cel·lulars simulant, per exemple, una medul·la òssia.
Sistema membroferm. Les cèl·lules es cultiven entre dos filtres, amb diàmetres de porus diferents. A la part superior hi ha perfusió del medi, de manera que les cèl·lules (a la regió verda) es nodreixen d’aquest i secreten els seus productes a la part inferior. Els filtres formen làmines; és més car i sofisticat que les fibres buides.
Els microcarriers són petites boles de vidre o de polímer. Han estat tenyides per visualitzar cèl·lules. Si en una ampolla rodant hi afegim microcarriers, augmentem molt més la superfície d’adhesió de les cèl·lules.
Amb això obtenim un sistema de cèl·lules no recuperables però permeten una alta producció. N’hi ha que fins i tot tenen canals i poden simular cultius 3D. El problema és que com que les perles estan en xoc constant necessitem cèl·lules altament resistents.
Feeder layers. Consisteix en fabricar monocapes de cèl·lules que perden la capacitat de proliferar. Poden produïr factors, pèptids, hormones, que podem utilitzar per fer créixer altres cèl·lules. Per aturar la seva proliferació els apliquem agents mutagènics, de manera que en tenir moltes mutacions la pròpia cèl·lula inhibeix la seva pròpia replicació. Els mètodes emprats són radiacions ionitzants o mitomicina c. Ambdós indueixen ruptures de doble cadena. Quan això passa els extrems són reconeguts i s’activa la maquinària de reparació. L’histona H2 es fosforil·la quan es trenca el DNA. El resultat és un bloqueig del cicle cel·lular. Després de tot això s’entra en apoptosi. El què interessa és que les cèl·lules continuin vivint, per tant hem de mantenirles actives intentant reparar el DNA i mentrestant produeixin els productes que ens interessen.
Només podran reproduïr-se sobre les feeder layer les cèl·lules mare, transformades, o d’epiteli estratificat, que no pateixin la inhibició per contacte. Si volem fer-hi créixer cèl·lules normals hem de trencar la feeder layer en bocins i posar-hi les cèl·lules normals entremig.
Les feeder layer ens permeten mantenir l’estat de diferenciació de les cèl·lules. Les cèl·lules indiferenciades es mantindran així, i les diferenciades igual. Si agafem cèl·lules diferenciades i les posem en cultiu es desdiferencien. Quan les volem diferenciar les traiem de la feeder i les posem en un cultiu específic. Podem distingir les cèl·lules diferenciades de les no diferenciades pel tipus de molècules que secreten, per la seva morfologia, i també perquè les cèl·lules no diferenciades secreten “factors d’indiferenciació”.
Quan cultivem cèl·lules tumorals sobre les feeder layer les podem fer créixer indefinifament, la qual cosa ens proporciona un avantatge a l’hora de provar fàrmacs sobre aquestes. L’experimentació és molt més fiable que sobre cèl·lules tumorals diferenciades.
Les cèl·lules que estan molt diferenciades no es reprodueixen. Els limfòcits de la sang, per exemple, no es divideixen. Quan arriba un antígen nou, els limfòcits es desdiferencien a limfoblasts i a partir d’aquests poden dividir-se i fer moltes còpies d’ells mateixos per atacar aquell antígen, llavors cadascun d’ells tornarà a diferenciar-se a limfòcit i esdevindran cèl·lules de memòria del sistema immunitari.
La plasticitat d’una cèl·lula determina la capacitat que té per diferenciar-se en un ampli ventall de possibilitats.
Les cèl·lules del moll de l’os, en funció de les condicions, poden esdevenir una cèl·lula o una altra a través del procés de diferenciació. Les cèl·lules mare tenen una gran capacitat plàstica.
A vegades hi ha cèl·lules que són molt sensibles a la tripsina i no la podem utilitzar per fer subcultius. Per això tenim altres mecanismes: un d’ells és una superfície que modifica les propietats d’adhesió de la cèl·lula en funció de la temperatura (SurfCell). Quan les cèl·lules estan dins de l’incubador estan adherides a la SurfCell, i quan les traiem se’n desenganxen.
...