Temes 15-19 (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 1º curso
Asignatura Microbiologia
Año del apunte 2014
Páginas 25
Fecha de subida 02/11/2014
Descargas 18
Subido por

Vista previa del texto

Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Genètica bacteriana 0. DNA: MATERIAL GENÈTIC Parlem del DNA com a material genètic. Té una cadena de doble hèlix, formada per bases nitrogenades. Aquestes dues hebres patiran una replicació, transcripció i traducció.
Replicació El DNA es duplica (replicació semiconservativa). Hi participa l’ADN-polimerasa (que sempre sintetitza en el sentit 5’-3’) i necessita un encebador (sintetitzat per un ARN polimerasa) on començar la replicació.
1 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana En els bacteris, aquesta replicació bidireccional provoca una gran força torsional. Les topoisomerases (girases) són uns enzims que s’encarreguen d’alliberar aquestes tensions.
Transcripció Quan es transcriu, l’ARN polimerasa fa una copia del ADN a ARN (genera una molècula de RNA complementària) (es diferencia de l’DNA en la BNitrogenada Timina).
2 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Traducció Quan es tradueix en forma de proteïnes ho fa mitjançant els ARN de transferència: l’mRNA s’aparella amb el tRNA (especificitat) i mitjançant el ribosoma es va llegint el mRNA (cada 3 codons es sintetitza un aminoàcid).
1. GENOMA BACTERIÀ El DNA es troba organitzat en gens, una seqüència contínua de nucleòtids amb funció biològica (emmagatzemar informació).
Hi ha diferents tipus de gens: gens estructurals (proteïnes), gens de RNA ribosòmic, i promotors i operadors (lloc de reconeixement d’altres molècules que regulen l’expressió d’aquest gen).
El genoma bacterià és el conjunt total de gens que porta una bactèria, és a dir, que porten les cèl·lules procariotes sense nucli. Es diferencien dels eucariotes en què aquest tenen un únic cromosoma anomenat nucleoide que és circular i que es replica bidireccionalment.
Una cèl·lula procariota és haploide (no té la parella que codifica).
A més, tot el genoma no es redueix al cromosoma, sinó que també trobem els plàsmids, material extra cromosòmic. Són petites molècules de DNA circular bicatenari que codifiquen per algunes propietats fenotípiques del bacteri però no son imprescindibles.
Tenen una replicació autònoma i independent del cromosoma bacterià.
3 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Plasmidis - Autoreplicatius - dsDNA - ≠ nº còpies - origen de replicació: OriV - Grandària 0,7- >100 Kb - Especificitat/promiscuïtat - Prescindibles - Classificació segons: o Propietats o grups incompatibilitat Elements mòbils Són seqüències genètiques amb capacitat de mobilitzar-se dins del genoma.
Aquets elements es troben tant a bacteris com a cèl·lules eucariotes.
S’insereixen amb absència de recombinació homòloga.
Són origen de molts canvis genètics i contribueixen a l’evolució: - Insercions en gens (podes causar mutacions polars) - Insercions en gens o regions reguladores que causen canvis en el patró d’expressió gènica - Origen de mutacions cromosòmiques •Exemples - Seqüències d’inserció (IS) - Transposons - Integrons Recombinació: pot ser homòloga o bé no homòloga (seqüències molt diferents que intercanvien material).
El gen 2 perd el seu sentit, ja que s’ha translocat al mig a un altre gen.
4 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Seqüències d’inserció Tipus més simple d’element mòbil. Només trobem gens que participen de la mobilització. Tenen una grandària de 700 a 5000pb.
Estan formats per extrems repetits i invertits (IR).
Normalment hi ha entre 6 a 10 còpies per cromosomes.
S’aplica a l’enginyera genètica i provoca mutacions.
Transposons Un transposó és semblant a les IS però més complexa estructuralment.
Té una seqüència d’inserció a cada costat i gens al mig (gens addicionals), que poden codificar per característiques sobre la transposició no. Per exemple, el gen de la resistència a la tetraciclina.
Arrosseguen altres gens (no només els de la transposició): cada cop que “salta”, arrossega un gen concret i pot transferir informacions determinades (origen de resistències).
Illot de virulència o patogenicitat.
Transposons que arrosseguen fins a 25 gens de resistència o de virulència que poden fer que un bacteri es torni especialment virulent ja que s’amaguen del sistema immunològic.
Exemple: PI-1 de Salmonella codifica per 25 gens que permeten al bacteri entrar a les cèl·lules no fagocítiques.
Models de transposició.
Transposició no-replicativa: es passa el transposó a un altre bactèria.
Transposició replicativa: les dues cèl·lules tenen una còpia.
5 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Integrons Fragments de DNA (cassets gènics) que aglutinen diferents gens de resistència antibiòtica (sovint diversos gens de resistència són transportats junts en forma de cassets gènics associats amb un element gènic conegut com integró).
Un integró està format per: el gen de la integrasa (permet que s’integri), pel casset gènic (s’integra en els integrons amb la integrasa) i per seqüències de recombinació específiques de lloc (on integrar el material genòmic).
Els cassets gènics poden transportar un o dos gens i un lloc de recombinació.
2. REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ GENÈTICA Capacitat d’adaptació ràpida al canvi de les concentracions dels nutrients.
Es dóna a tres nivells: 1. Producció coordinada dels enzims necessaris en presència del nutrient.
Agrupament de gens que codifiquen els enzims d’una mateixa via metabòlica.
OPERON: promotor (diana de la regulació) + gens codifiquen enzims + seqüència d’acabament de la transcripció.
En condicions normals, no es fa la síntesi d’uns enzims determinants si n hi ha el substrat que degraden al medi (i viceversa).
1.
2.
2. Transcripció regulada directament per unes proteïnes repressores.
3. Regulació a nivell de la síntesi de les proteïnes pel ribosoma.
6 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana 3. MUTACIONS Les mutacions també són un element de diversitat microbiana.
Una mutació és qualsevol canvi a la seqüència de bases del DNA. Les mutacions es produeixen de forma espontània o natural, de manera que en una població natural bacteriana hi ha mutants. Però també hi ha agents que indueixen a les mutacions.
- Agents físics: calor, llum, UV, radiacions ionitzants...
- Agents químics: anàlegs de les bases, mutàgens de canvi d’estructura (bromur d’etidi) i substàncies químiques reactives amb el DNA.
Tipus de mutacions - Transició: substitució d’una purina per una altra purina.
- Transversió: substitució d’una pirimidina (C;T) per una purina (G; A).
- Mutació silent: No hi ha canvis als aà. El canvi d’una base no té cap efecte perquè pot ser que codifiquin pel mateixa aminoàcid.
- Missense mutation: canvis en les seqüències dels aà (en sentit erroni).
o Mutació conservadora: amb propietats similars. La proteïna potser funciona.
o Mutació “sense sentit”: s’insereix un codó d’stop que atura la traducció - Mutació de canvi d’estructura: Petita deleció o inserció que no sigui en múltiples de tres.
- Mutació nul·la: Excessiva inserció o deleció. Es destrueix la funció del gen.
7 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Altres tipus de mutacions - Es pot tornar a la seqüència Wild-Type (la normal).
- Hi ha mutacions reverses (back mutation).
La mutació converteix al mutant en salvatge (una mutació sobre una mutació). Pot esdevenir que: - Aa original que restableix la funció original.
- Aa nou que Restableix parcial o totalment la funció original.
- Mutacions supressores.
Ocorren en un lloc diferent al de la mutació original emmascarant o compensant la mutació inicial sense revertir-la.
Fenotípicament segueixen sent salvatges.
- Supressió intragènica en el mateix gen o codó; p. ex., una addició restableix un deleció.
- Supressió intergènica que es dóna en un gen diferent.
Selecció de mutants Al laboratori, és interessant seleccionar els mutants d’un cultiu. Hi ha dues maneres: - Selecció directa: marcadors seleccionables (sembres i observes els resultats). Ex: resistències.
- Selecció indirecta: Mitjançant rèpliques. Els marcadors no són seleccionables.
L sembra es fa per crivellatge o screening, i s’usa un medi complet (igual que l’inicial) on creixen totes les colònies, i un medi mínim (només hi ha els precursors) on hi creixen les NO mutades (les mutades no troben les substàncies que necessiten. Ex: auxòtrofs.
Screening: Es busquen soques que tenen alguna deficiència en la síntesi d’algun metabòlit. Es posa en contacte la placa amb el motllo de vellut, i quedaran a sobre impregnades les colònies. Amb altres plaques poden fer diverses rèpliques, una la posem en un medi mínim i l’altre en un de complex. Les del medi mínim que no creixin seran les mutades, perquè no tindran els enzims necessaris per sintetitzar (la soca mutada és la que no creix en el medi mínim).
8 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Difusió vertical Les mutacions tenen una distribució o difusió vertical, de mare a filla.
Mecanismes de separació del DNA Tenim diferents mètodes: - Reparació directa del DNA: Eliminació enzimàtica de les lesions.
- Reparació per escissió: detectar petites lesions del DNA i arreglar-les per escissió del fragment i sintetitzant cadena nova.
- Reparació post-replicació: recuperació de la informació que falta per recombinació genètica (quan estan lesionades les dues cadenes).
- Resposta SOS: inducció de molts gens (uns 15), o bé interrupció de la replicació.
- Reparació propensa a error: últim recurs. Reomplir forats sense plantilla de DNA, per mantenir la integritat del cromosoma.
Test de detecció de mutàgens Mutàgens: són productes que indueixen a les mutacions, molts d’ells cancerígens, per això són necessaris protocols per tal de saber-ho.
Hi ha diferents mètodes, però el més conegut és el test de detecció d’Ames (test de reversió).
1970: Test d’Ames (Resultats en 2 dies) S’utilitzen soques de salmonella (són histidina(-), no poden sintetitzar histidina a partir dels nutrients, defecte que es troba en els gens).
Aplicant la substància mutagènica veiem si s’indueix una reversió.
Totes les soques tenen aquest defecte, i a més, presenten la paret més porosa (la fa més permeable), i també presenten defectes per reparar el DNA.
9 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Es fa un cultiu d’auxòtrofs d’histidina de Salmonella, i ho cultiven en dues plaques: una es sembra en un medi mínim amb una petita quantitat d’histidina, i una altra es sembra en un medi mínim més una petita quantitat d’histidina i el mutagen a estudiar. S’incuba.
Al dia següent: trobem que hi ha poques colònies de soques que hagin mutat, i ja no son histidina(-), és un revertit natural o espontani. En un altre veiem moltes més colònies, les que han revertit de forma natural i les que han mutat induïdes per la substància.
10 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana 4. INTERCANVI DE GENS EN PROCARIOTES Moltes bactèries tenen una relació promiscua amb el seu DNA. Això pot ser un avantatge (conferir resistència als antibiòtics).
Aquest material genètic que es transformat es pot integrar al cromosoma o pot quedar com a material extra-cromosòmic, que són els plàsmids, que conferiran i permetran: resistència a antibiòtics, producció de bacteriocines o toxines, metabolització de certs substractes...
Hi ha tres mètodes de passar-se el material genètic: la transformació, la conjugació i la transducció.
En aquests casos, és una difusió horitzontal dels gens.
Transformació Es va descriure a l’any 28 per Griffith.
Experiment: - Quan inoculem a un animal una soca S amb càpsula de strep. Pneumoniae l’animal moria.
- Quan inoculem a un animal una soca R sense càpsula de strep. Pneumoniae, no moria.
- Quan inoculem a un animal una soca S amb càpsula de strep. Pneumoniae MORTA l’animal NO moria.  REQUEREIX EL VIRUS VIU - Quan inoculem la soca S amb càpsula morta i la soca R viva barrejades l’animal moria.
Al fer l’observació en el microscopi, es van trobar bacteris de la soca S vius!  EL BACTERI NO ERA CAPSULAT PERÒ HO ESDEVENIA 11 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Avery, MacLeod i McCarthy 1944.
Segon experiment: Volien buscar el principi transformant.
Van separar el DNA de les proteïnes.
Quan barrejaven la soca R no capsulada amb la proteïna no passava res, però quan es feia amb el DNA, la soca es transformava en els bacteris de la soca S que tenen la capacitat de produir la càpsula  EL PRINCIPI TRANSFORMANT ÉS EL DNA Amb aquests experiments es va deduir que alguns bacteris tenen la capacitat d’introduir fragments de DNA lliure i, en algun cas, capaços d’integrar-lo en el cromosoma.
Però a l’hora de introduir-se la cadena de DNA, les proteïnes de la paret només permeten que entri una hebra. Després, aquest ADN es pot introduir al cromosoma  COM?: Es fixa per recombinació, s’incorpora una hebra i després fan l’hebra complementària.
12 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Conjugació Consisteix en la transferència de DNA mitjançant el intercanvi directe entre dues cèl·lules vives.
La conjugació mitjançant el factor F (factor de fertilitat) és un dels sistemes de conjugació millor estudiats.
La transferència és unidireccional: Cèl·lula Donadora (F+) x cèl·lula receptora (F-).
Plasmidi F El plasmidi F està format per tres regions.
- Una que codifica per la capacitat de transferència.
- Una altre que codifica per la replicació.
- Una tercera que codifica per la integració.
El que fa és codificar mitjançant un pili sexual; el DNA passa a través del conducte. Quan es passa el factor, converteix a l’altre cèl·lula en portadora, i a la vegada, es fa una còpia d’aquest. Quan les cèl·lules es separen, tenen ja el plàsmid complet.
Hi ha una retracció per a que les cèl·lules estiguin més properes.
El plasmidi sempre comença la transferència des de l’origen de replicació.
Hi ha tres tipus de cèl·lules en funció del plasmidi.
1. El factor F és material extra cromosòmic: PLÀSMID F 2. El factor F està integrat en el cromosoma: HFR 3. El factor F és material extracel·lular (lliure al citoplasma) però té un tros de cromosoma cel·lular: F’ (4. Cèl·lules sense plasmidi = F-) 13 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana CONJUGACIÓ F+  F- El Factor F té un origen de transferència que està a la meitat del gen (extrem Ori).
CONJUGACIÓ Hfr El plasmidi pot iniciar el procés però ara la mida del plasmidi és major (hauria d’entrar tot el cromosoma).
A la cèl·lula receptora li entra el plàsmid i a més un tros de cromosoma/fragment de DNA. En la cèl·lula donadora el fragment que ha entrat el DNA es reconstrueix.
El fragment de DNA de la receptora també es replica. Pot passa a ser HFr (algun dels gens que ha passat s’integra per recombinació) o bé que es degradi aquest factor F.
Utilitat: Quan comença la conjugació va arrossegant gens del cromosoma: això permet l’estudi de quins gens hi ha i en quin ordre estan els cromosomes.
14 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana CONJUGACIÓ FEn el moment de separar-se el factor F del cromosoma ho fa de manera defectuosa i s’endú un tros. Per tant la cèl·lula rebrà a més del plàsmid els gens codificats pel donador.
Resultats de la conjugació Pot ser que obtinguem dues cèl·lules F+ o bé que només una continuï F-, però pot ser que es guanyi algun fragment de DNA que no tenia.
Utilitzant la conjugació s’ha estudiat la disposició dels gens en el cromosoma. Podem veure quantes soques que abans no disposaven d’un gen ara el tenen, i en quin ordre es van posant. Per això, quan veiem la disposició dels gens en el cromosoma, està en minuts (correspon al temps total que triga a passar-se el gen). Exemple: E. Coli: 100 min 15 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Transducció 3r i últim mètode de transferència de material entre les cèl·lules. Aquest està mediat pels bacteriòfags.
Hi ha dos tipus: - Atenuats: fan el cicle lisogènic - Virulents: fan el cicle lític Consisteix en una cèl·lula infectada per un bacteriòfag virulent. Lo normal és que no hi hagi cap error, el DNA que s’encapsida es víric. Però pot passar que un tros del genoma víric i un del cromosòmic s’encapsidin junts.
16 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana 17 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana 5. ENGINYERIA GENÈTICA També rep el nom de tecnologia del DNA recombinat. Ha permès estudiar i conèixer com funciona el genoma bacterià.
La utilització d’aquestes tècniques de clonació ha revolucionat les ciència biomèdiques.
Gràcies al que coneixem del DNA i els gens podem: - Purificar, modificar i expressar seqüències molt específiques.
- Utilitzant enzims de restricció i DNA lligasa crear vectors de clonació.
Enzims de restricció El primer pel treball en enginyeria genètica és tenir enzims de restricció.
Serveixen per tallar el DNA per seqüències molt concretes: reconeix seqüències específiques d’aquest i les talla. Es separa la doble cadena d’una manera determinada i podem tallar el DNA d’un bacteri el d’un altre amb el mateix enzim per tal que es puguin acoblar perquè les seqüències que queden lliures són les mateixes (complementarietat).
La unió ve donada per la utilització del DNA ligasa: és un enzim que uneix fragments de DNA.
18 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Vectors de clonació Vector de clonació: és una molècula de DNA circular creada al laboratori.
Aquest vector permet la inserció de DNA forani preservant la seva capacitat normal de replicació en bacteris.
Tenen un punt d’inserció pel DNA forani  Implicació d’enzims de restricció i de enzims de lligació.
Un cop transfereix el vector, mitjançant plasmidis o bacteriòfags, ens interessa saber quines cèl·lules son les que han incorporat el vector. Es pot saber incorporant un gen de resistència a algun antibiòtic.
Utilitat - Per aïllar i expressar gens per obtenir proteïnes útils (insulina, interferó, hormones) en bacteris o llevats.
Per preparar grans quantitats d’un immunogen pur destinat a una vacuna sense necessitat de treballar amb el patogen sencer Plasmidis com vectors o Petit tamany o Seqüència o Autoreplicació o Varies còpies/cèl.
o Mecanismes de selecció o Dianes de restricció Aquest plasmidi es fica dins de les bactèries per transformació.
Bacteriòfags com vectors Estem davant d’una molècula de DNA víric en el que poden treure una regió no essencial i inocular el DNA que ens interessi.
19 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Procés de clonació: 1) Digestió del DNA a clonar amb enzims de restricció Digestió del DNA a clonar amb enzims de restricció: l’enzim de restricció ens trencarà el tros que ens interessa.
2) Digestió del vector de clonació Digestió del vector de clonació amb l’enzim de restricció.
3). Lligació Quan ajuntem el vector i el DNA s’ajuntaran per l’DNA llisa, ja que tenen els extrems complementaris.
20 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana 4). Transformació Transferim aquest plasmidi a una cèl·lula receptora mitjanant la transformació. Hi ha mètodes que afavoreixen l’acceptació  Fem la bactèria receptora competent (fent que tingui una alta capacitat de captar i acceptar DNA).
Un d’aquests mètodes és l’electrotransformació.
5) Selecció de clons recombinants En la suspensió resultat hi haurà: - Bacteris que no hauran incorporat el vector - Bacteris que sí hauran incorporat el vector però no amb els gens que interessen.
- Bacteris que no hauran incorporat el vector i amb els gens que interessen.
Com seleccionar a les cèl·lules que han incorporat el DNA? Tallem el plasmidi i el fragment de DNA forani. El plasmidi porta un marcador que el permetrà seleccionar després, que és un gen de resistència. Aquests dos elements s’uniran, s’introduirà dintre d’una bactèria i aquesta serà sensible al factor que li donaria resistència al gen.
Fem créixer les bactèries en un medi que incorpori el antibiòtic. Moriran les que no hagin incorporat el plasmidi, i creixeran les que sí. Ara hem de seleccionar les que a més d’incorporar el vector, ho han fet amb el DNA que ens interessa.
El vector porta dos seqüències de resistència per la Tetraciclina i per la Ampicil·lina.
L’enzim talla per mig del gen de la resistència a la tetraciclina, de manera que un vector només portarà el de la resistència de la Ampicil·lina, que ha introduir el DNA forani.
Però també pot passar que es torni a ajuntar el vector amb el mateix tros que li hem tallat i que no portarà el DNA forani, només les dues resistències. Per seleccionar-les s’han de realitzar rèpliques.
21 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Fem un medi amb Ampicil·lina sense Tc: creixeran totes les que han incorporat el vector “master plate”. D’aquestes hem de destriar el vector correcte. Mitjançant un motllo de vellut, fem rèpliques en dos medis: una en un medi amb Ampicil·lina sense Tc, i una en un medi amb Tc i Amp (els dos antibiòtics).
Les que tenen DNA que no ens interessa creixeran en el medi dels 2 antibiòtics i en el de 1, perquè els que tenen el DNA forani interromp el gen de la resistència.
Hem de mirar en la master plate on creix una colònia i comparar-ho a l’altra per veure les calbes (és una còpia).
22 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana 6. NORMATIVA I BIOSEGURETAT 23 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Grups de risc dels agents 24 Microbiologia Temes 15, 16, 17, 18, 19 – Genètica bacteriana Mesures de contenció 25 ...