Tema 9 - Tècniques d'identificació cromosòmica (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Citogenètica
Año del apunte 2014
Páginas 18
Fecha de subida 26/12/2014
Descargas 18
Subido por

Vista previa del texto

CITOGENÈTICA PARCIAL 2 TEMA 9 – Tècniquès d’idèntificació crómósómica TINCIÓ UNIFORME 10/11/14 Consisteix en agafar extensions cromosòmiques i tenyir-les amb un colorant que tenyeixi de forma general els cromosomes. Però només permet la identificació del centròmer i de constriccions secundàries en algunes ocasions. Aprofita la capacitat que presenten determinats colorants d’interaccionar amb la cromatina. Trobem diferents tipus de colorants: - Giemsa – molècules del grup de les tiazines i eosines de càrrega positiva que interaccionen amb el grup fosfat del DNA.
Ocreina acètica – en solució àcida, l’ocreïna actua com un colorant bàsic i es fixa a sobre dels cromosomes que són basofílics.
Taronja d’acridina – interacciona de manera diferent amb molècules de DNA de cadena senzilla o doble.
o Cadena senzilla – polímer  color vermell.
o Cadena doble – monòmer  color verd.
La utilitat des del punt de vista clínic o de recerca recau en quan volem analitzar trencaments i anomalies cromosòmiques i estructurals induïdes per agents genotòxics, perquè és una taxa barata i es troba una relació directa entre la dosi rebuda i el nombre de trencaments. Però no permet dir quin cromosoma és quin (és la gran limitació).
7 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 TÈCNIQUES DE BANDEIG CROMOSÒMICS GENERALITATS DE LES TÈCNIQUES DE BANDEIG Conjunt de bandes transversals de mida i intensitat de tinció diferent que apareixen sobre determinats cromosomes. El nombre de bandes depèn del grau d’estirament del cromosoma i determina la resolució de la tècnica.
Com a norma general s’admet que el patró de bandes és constant per a qualsevol tipus cel·lular d’una espècie determinada i que no varia durant el desenvolupament embrionari – si analitzem cèl·lules d’espermatogònies o del trofoblast, trobem el mateix patró de bandes.
Hi ha una nomenclatura que ens permet classificar les bandes en funció d’uns estàndards – els dividim en dos braços p i q, i dins de cada braç trobem diferents nivells. En primer lloc ho dividim en regions i les regions numerades en ordre ascendent de centròmer a telòmer tant en p com en q. Les regions estan dividides en bandes també ordenades de forma ascendent de centròmer a telòmer tant en p com en q. Què diferencia una regió d’una altra? Una regió és un conjunt de bandes que presenten unes característiques de tinció més o menys homogènies – unes bandes de tendència a ser clares/fosques configuren una regió. Però quan analitzes les diferents regions te n’adones que no és del tot així. Es va aprovar a partir d’un consens acordat i punt, i el motiu te l’inventes tu.
8 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 En una mateixa extensió cromosòmica podem trobar cromosomes de diferent mida – tot depèn del nivell de resolució de bandes – els cromosomes quan més llargs són, més bandes presenten, quant més curts són, menys bandes presenten. Aquest número total de bandes que presenta una determinada extensió de cromosomes s’anomena resolució.
Per exemple: definim un nivell de resolució per sota de 350 a partir d’una observació – tots els cromosomes tindran com a màxim 350 bandes. En citogenètica clínica, el nombre de bandes es situa al voltant de 350. Si els teus cromosomes són més llargs, s’incrementa el nombre de bandes fins a 550 i cada una de les bandes es subdivideix en diferents subbandes. Si incrementem més la llargada dels cromosomes podem assolir resolucions extremes de 1250 bandes. Això s’aconsegueix amb unes altres subsubdivisions.
Per tant, la resolució de les tècniques de bandeig (el nombre de bandes recomptables en una metafase) depèn de l’estirament dels cromosomes. Com més curts són els cromosomes, més t’acostes al nivell de regió; com més llargs, més t’apropes a bandes.
Tècniques per ordre cronològic: BANDES Q TRACTAMENT Quan tenyim amb fluorocroms quinacrina o DAPI PER QUÈ APAREIXEN LES BANDES Observem un patró de bandes sobre els cromosomes de mamífers.
Per què? Per la unió preferent dels fluorocroms a les regions riques en AT – aquesta unió provoca un increment del senyal fluorescent i l’aparició de bandes transversals. En alguns casos la unió està condicionada pel component proteic de la cromatina.
En humans, trobem l’aparició de polimorfismes cromosòmics en: - Heterocromatina 1, 9, 16 Centròmers 3, 4 i 13 Satèl·lits Regió heterocromàtica Y Això es va aplicar en la determinació de l’origen parental.
9 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 BANDES G/R TRACTAMENT S’utilitzen en recerca i en citogenètica clínica – és el mètode més utilitzat per l’estudi citogènetic dels cromosomes en mamífers.
S’utilitza com a colorant el Giemsa (G de Giemsa).
La primera extensió data de l’any tal. Presenten avantatges – enlloc d’un fluorocrom, giemsa, no cal un microscopi de fluorescència.
S’usen per cariotipar a tot arreu excepte a França. Els gavatxos van desenvolupar una variant de les bandes G que es diu R. Com són més agressius amb els cromosomes, serà un bandeig invers als G – tot el blanc és negre i tot lo negre és blanc. Això és un problema pels citogenetistes.
G R PER QUÈ APAREIXEN LES BANDES Per què apareixen les bandes G o R? Podem digerir els cromosomes incubant-los amb tripsina i al cap d’un temps si fem una tinció observem un patró de bandes, o bé podem sotmetre els cromosomes a desnaturalitzacions moderades amb una solució de sals i temperatures elevades. Amb això, apareixen les bandes G. Si en comptes de fer tractaments moderats els fas extrems, apareixen les R.
Teories d’aparició de bandes: 1. En funció de la càrrega del DNA que quedava exposada; el components proteic modifica el component proteic dels cromosomes i la seva interacció amb regions del DNA (queden més o menys exposades).
10 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 2. Basada en els cromòmers (graus de compactació variables de la cromatina). Es proposa que els tractaments reestructuren els cromòmers, i els que estan allunyats en un cromosoma no tractat queden més agrupats, i això, en diferents nivells, es manifesta en bandes positives (han agrupat molts cromòmers) o negatives (no han agrupat els cromòmers).
3. La organització de la fibra de cromatina en el cromosoma metafàsic en forma de nanses dóna diferents graus de compactació. Les condensines agrupen segments de DNA de forma ordenada. Es demostra que hi ha regions on aquestes nanses de cromatina agrupades a través de les condensines estan formant regions de grau de compactació gran i regions de menor grau de compactació. Les regions més compactades corresponen a les bandes G positives o les bandes Q (són equivalents). Aquesta teoria té dades experimentals que li donen suport.
El patró G/R és un reflex de l’organització dels segments en el cromosoma metafàsic (és un patró conservat).
Recordem que les seqüències de DNA unides a l’esquelet s’anomenen SAR (Scaffold Attachment Regions), i són regions riques en AT.
11 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 BANDES C Són bandes que permeten observar la cromatina constitutiva (independent de les característiques cel·lulars, tant si estem en interfase com en metafase).
El colorant utilitzat també és Giemsa.
TRACTAMENT Els tractament amb una solució àcida molt intensa (baixa molaritat) i després els tractem amb una solució bàsica molt intensa (baixa molaritat). Després els tenyim amb Giemsa.
PER QUÈ APAREIXEN LES BANDES C Aconseguim bandes C – l’únic que resisteix aquest tractament és l’heterocromatina constitutiva – regions altament condensades en les regions heterocromàtiques en cromosomes en metafase. Es dóna la digestió de tota la cromatina – eliminem la cromatina menys les regions resistents per el seu alt grau de compactació.
Es va usar per identificar polimorfismes o variants centromèriques però és difícils d’ajustar el temps i evitar que es digereixi tot.
12 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 BANDES T TRACTAMENT Variant de les bandes R, s’aconsegueix quan encara portes més a l’extrem la desnaturalització.
PER QUÈ APAREIXEN LES BANDES Marquen els telòmers – quan els processos de desnaturalització són portats a l’extrem, eliminen tot el cromosoma i obtens unes marques específiques de les regions AT que marquen els telòmers. Són bandes d’alt contingut en GC.
BANDES DE REPLICACIÓ TRACTAMENT Està basat en el cultiu de cèl·lules en presència de 5-BrdU – anàleg que fa que les condicions de tinció de les molècules que han incorporat l’anàleg siguin diferents de les que no l’han incorporat. Si tu analitzes cromosomes aconseguits a través de cultius amb l’anàleg observes diferents graus de tinció.
PER QUÈ APAREIXEN LES BANDES C Dividim la fase S en diferents intervals i incorporem l’anàleg en un període diferent cada cop (per exemple dividim S en 3 fases). Observant els cromosomes quan l’incorpores a la fase 1, veus bandes que posen de manifest les regions que han incorporat l’anàleg que són les de replicació primerenca. Si poses l’anàleg a temps 3 i analitzes, veus en fase M un patró de bandes diferent com a resultat de les regions que repliquen al final de la fase S – replicació tardana. Per tant amb extraccions de cultiu seriades et permet saber quins cromosomes repliquen en cada interval de la fase S.
Les bandes G positives acostumen a coincidir amb bandes de replicació tardanes.
13 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 BANDES NOR (como los caldos) 12/11/14 Permeten, després del tractament (variant de les bandes C), identificar de forma diferencial els cromosomes amb regions organitzadores del nuclèol (els acrocèntrics en cas d’humans).
Metodològicament s’aconsegueix amb una variant de la metodologia de bandes C (tractament àcid base dràstic que elimina la majoria de la cromatina que es tenyeixen amb nitrat de plata perquè reconeix proteïnes del rRNA (ribonucleoproteïnes) associades a les regions NOR – obtenim bandes Ag-NOR).
És una tècnica de bandeig però estrictament identifica els cromosomes amb regions NOR.
ALTRES – Nomenclatura Hi ha un conveni que permet amb un codi de tres lletres que permet identificar el tipus de bandeig aplicat.
- La 1a lletra indica el tipus de banda (Q de banda Q, etc.).
La 2a lletra indica el tractament utilitzat (B de Bromodesoxiuridina).
La 3a lletra indica el colorant (G de Giemsa).
14 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 ALTRES – Aplicació seqüencial Les tècniques de bandeig cromosòmic que hem descrit sovint es poden aplicar seqüencialment. Per exemple, hi ha tècniques que permeten identificar un mateix cromosoma amb diferents bandeigs aplicant en una metodologia variacions seqüencials.
ALTRES – Expressió de l’organització del genoma Les bandes apareixen en resposta a una conformació concreta dels cromosomes. Les dades que ho suporten són les següents: BANDES QUE TENYEIXEN REGIONS EUCROMÀTIQUES (concepte citològic) – BANDES G, Q, R Les bandes eucromàtiques són les Q, G i R. Les G positives són Q positives i són R negatives.
Només apareixen en cromosomes de mamífers i en alguns cromosomes d’ocells (concretament en els macrocromosomes; els ocells tenen aquests i també microcromosomes).
COMPOSICIÓ DE BASES i CONTINGUT GÈNIC De 1771 gens humans, en un ideograma s’observa que un 80% dels gens es localitzen en bandes G negatives (bandes G clares), mentre que el 20% restant es localitzen en bandes G positives (bandes G fosques). Per tant el contingut gènic entre G + i G - és diferent, ja que la majoria es concentren en les negatives – característiques del DNA diferents relacionades a l’aparició de bandes.
15 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 POSICIÓ BANDES (ESTRUCTURA DE LA CROMATINA) Les G+ corresponen a cromòmers de paquitè i les G- a zones intercromàtiques – tenyint amb tinció uniforme tenim diferents intensitats. Si compares el patró cromomèric d’un cromòmer paquitè amb un cromosoma metafàsic mitòtic, trobes una correspondència en el patró de bandes G; les G+ estan localitzades als mateixos segments, cosa que posa de manifest que les bandes G no apareixen de forma aleatòria, són un reflex de la conformació de la cromatina.
PROCESSOS DE REPLICACIÓ DEL DNA (TIMING) En els cromosomes marquem amb números romans el temps de replicació (I, II....VI és replicació primerenca, del VI en endavant és replicació tardana). Si comparem el patró de bandes de replicació tardana i primerenca amb el patró bandes G trobem una correspondència – les regions que repliquen al final de la fase S són regions corresponents a G+, mentre que les regions de replicació primerenca corresponen a bandes G-. Això posa de manifest que l’aparició de les bandes té a veure amb el contingut de la cromatina.
PRESÈNCIA DE SEQÜÈNCIES DE DNA REPETITIVES En G+ trobem seqüències llargues (LINES), i en G- trobem seqüències curtes (SINES). Per tant les bandes eucromàtiques G, Q i R clarament apareixen a determinades regions del cromosoma perquè aquests presenten unes característiques de seqüències determinades.
BANDES QUE TENYEIXEN REGIONS HETEROCROMÀTIQUES (concepte citològic) La heterocromatina constitutiva correspon a les bandes C – apareix en els centròmers (1, 9 , 16 i Y en humans). Les bandes T – telòmers; les bandes NOR – regions NOR.
Clarament les bandes estan relacionades amb un tipus determinat de cromatina.
16 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 TÈCNIQUES BASADES EN LA FISH D’ÀCIDS NUCLEICS GENERALITATS La hibridació in situ fluorescent (FISH) permet observar de forma específica seqüències de DNA i la gran avantatge que tenen és que ho fan en qualsevol etapa del cicle cel·lular (abans havíem de treballar amb cromosomes metafàsics preferentment) – podem analitzar nuclis interfàsics.
Es basa en la capacitat de la molècula de DNA de realitzar cicles de desnaturalització (obrir la doble cadena) i renaturalització. Aquesta capacitat és aprofitada per observar seqüències d’àcids nucleics.
Esquema: 1. Necessitem un DNA diana que volem identificar. Aquest DNA diana el desnaturalitzem bàsicament amb temperatures altes i productes químics varis. Aconseguim obrir la doble cadena i exposem el DNA diana en forma de monocadena.
2. Necessitem una sonda de DNA, un fragment de DNA complementari del DNA diana.
Aquesta sonda la marquem amb un fluorocrom que marquen en el color que vulguem.
Un cop tenim la sonda marcada, la desnaturalitzem i exposem el DNA sonda en forma de monocadena.
3. Llavors, els posem en contacte perquè hibridin posant sonda en excés per assegurar la hibridació – en les condicions de renaturalitzacions, les sondes competeixen amb la molècula de DNA per formar la doble cadena. Però si tenim mes sonda s’unirà la sonda a la monocadena.
4. El resultat final són molècules diana hibridades amb sondes marcades amb fluorocroms.
5. Observes al microscopi de fluorescència.
17 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 TIPUS DE SONDES Tenim diversos tipus de sondes. Podem trobar fins a 6-7 tipus en relació a les seqüències que reconeixen: trobem seqüències que identifiquen gens i permeten visualitzar si un gen està o no present. N’hi ha que identifiquen regions centromèriques. N’hi ha que són específiques de telòmers. N’hi ha que són específiques de tot un cromosoma – painting. N’hi ha que reconeixen tot el genoma, tots els centròmers o tots els telòmers...
Pepe Colubi ens posa webs que tenen informació sobre totes les sondes existents per si en algun moment de la teva miserable vida vols comprar-ne una.
Cases comercials: - www.abbottmolecular.com/technologies/fish.html www.qbiogene.com www.cellayinc.com Tenim vàries derivacions de les tècniques FISH. Les més significatives són les següents.
18 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 TÈCNIQUES FISH MULTICOLOR És la més utilitzada. Combinem fluorocroms – podem identificar més d’una seqüència a la vegada.
Avantatges: ràpida i específica (complementarietat de bases); no requereix de cultius cel·lulars ni cèl·lules en divisió (pots observar interfases); a més els resultats són fàcils d’interpretar.
Limitacions: només tens informació dels cromosomes o segments cromosòmics que reconeixen les sondes. Si uses sondes per 5 cromosomes concrets i estàs fent un diagnòstic preimplantacional o un diagnòstic prenatal, et manca informació de la resta del cariotip i no pots dir si és viable amb 100% seguretat. Pots assegurar que no hi ha trisomia en el 21 si un dels 5 és el 21, però potser hi ha alteracions en els que no has observat. En canvi les tècniques de bandeig analitzen tot el complement cromosòmic.
TÈCNIQUES M-FISH/SKY-FISH Per fer FISH normalment cal saber cariotipar molt bé, cosa que és difícil. Aquesta tècnica MFISH permet analitzar cromosomes metafàsics amb un patró de colorines –marques cada cromosoma d’un color diferent.
S’aconsegueix amb una barreja de 5 fluorocroms que, combinats en diferents proporcions (es fa una sonda per cada cromosoma amb una combinació específica per cada un), et permet observar-los de forma diferencial.
19 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 Tot això va associat a un software per si no saps distingir dos verds semblants. Aquesta tècnica també presenta avantatges i limitacions.
Avantatges: permet l’anàlisi de tot el complement; no requereix metafases de bona qualitat; permet detectar recombinacions cromosòmiques en equilibri (translocació reciproca que amb bandes costa de veure). Imatge: Translocació 3-6.
Limitacions: poca resolució per petites duplicacions o delecions (si afecten a regions petites són difícils d’identificar); requereix mans expertes (el software s’equivoca i el citogenetista ha de fer cosillas complicades). A més són cares de collons.
S’usen per recerca però no en clínica.
20 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 HIBRIDACIÓ GENÒMICA COMPARADA (CGH) Són tècniques molt resolutives. No partim de cromosomes sinó d’una extracció de DNA genòmic de la mostra control (DNA normal). Paral·lelament, n’obtenim de la mostra problema (on sospitem que hi ha problemes). El control el marquem amb un fluorocrom d’espectre vermell (rhodamine) i el problema el marquem amb un fluorocrom d’espectre verd (FITC). Un cop els tenim marcats, els dos DNAs genòmics els barregem en un tub i els desnaturalitzem per tal que tan el control com el problema passin a ssDNA.
Llavors, aquest DNA control barrejat amb el problema l’hibridem sobre un suport (portaobjectes) que té metafases control cromosòmicament normals. Llavors, portem la barreja a condicions de renaturalització de manera que el DNA hibrida amb les metafases que hi ha al portaobjectes que també estaven desnaturalitzades. Llavors què passa? Les parts iguals del cromosoma tindran un 50% de DNA provinent del problema i un 50% provinent del control (50% aproximadament), i sortirà un color barreja entre el fluorocrom vermell i verd – segment groc. Si hi ha una amplificació en el DNA problema, tindrem el doble de DNA problema, per tant un % superior provindrà del DNA problema i sortirà el color del problema (fragment verd). Si hi ha una deleció en el DNA problema, no tindrem aquella part de DNA i per tant el 100% provindrà només del DNA control i sortirà només el color del DNA control (fragment vermell).
Parlem doncs d’una hibridació genòmica comparada.
21 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 Observem imatges com aquesta. En les imatges A,B i C tindríem un filtre de fluorescència diferent i en D observem les imatges superposades.
En aquesta imatge observem les línies de lectura del software – si se supera la línia verda, indica una amplificació, i si se supera la línia vermella una deleció.
22 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 Avantatges: Aplicacions de les CGH – es tracta d’una tècnica útil per determinar reorganitzacions complexes (sospites que en un teixit hi ha múltiples alteracions cel·lular de diferents tipus).
Un cas de les aplicacions citogenètiques és l’estudi de les cèl·lules tumorals ja que es tracta d’una tècnica que permet l’anàlisi de tot el complement cromosòmic en un sol experiment amb molta resolució i senzillesa. A diferència de les bandes G no requereix de metafases de bona qualitat (l’anàlisi el fa una màquina o software). A més, amb poques cèl·lules i poca quantitat de DNA ja s’obtenen resultats.
Limitacions: amb aquesta tècnica tu contraposes dos DNAs i detectes anomalies en funció de si la unió és diferencial. Ara bé, quan es donen situacions sense pèrdua o duplicació de DNA, quan hi ha intercanvis de DNA, no s’identifiquen ja que la quantitat de DNA és la mateixa – no permet detectar reorganitzacions cromosòmiques en equilibri. Tampoc permet detectar petites duplicacions o delecions degut a la poca resolució. A més requereix de mans expertes.
Array-CGH – Derivació de les CGH Tenim un DNA problema, un DNA normal i l’hibridem sobre extensions cromosòmiques i determines si una regió determinada presenta duplicacions o amplificacions. Però amb CGH convencionals, aquestes anomalies només es detecten per sobre de les 10pb. Com superem aquest límit de resolució? Amb aquesta tècnica d’Array-CGH s’usa una superfície on tens BACs (DNA circular que conté un tros d’un cromosoma). Cada un d’aquests BACs (Cromosoma Artificial de Bacteri) els posem en un suport de vidre que té diferents pous i a cada pou tens un BAC.
L’essència de la tècnica és exactament la mateixa que en una CGH, només canvia el fet que aquí tenim trossos més petits. El que observarem seran pouets de diferents colors – verds si hi ha més DNA problema (duplicació), vermell si hi ha més DNA control (deleció). El que fem és acotar la duplicació o deleció a una regió en concret – quant més petit sigui el DNA, més resolució.
Però en el fons tot es redueix a la tècnica de FISH – DNA desnaturalitzat, DNA diana, DNA renaturalitzat, DNA marcat amb fluorocroms.
23 CITOGENÈTICA PARCIAL 2 TÈCNIQUES D’ANÀLISI ESPECIALS Es tracta de tècniques que s’han utilitzat per fer recerca citogenètica.
ESTUDI DEL COMPLEX SINAPTINEMAL Inferim en el comportament dels cromosomes (com aparellen) en profase I – aquestes tècniques s’han usat per verificar el correcte aparellament dels cromosomes al llarg de profase I.
El tractament consisteix en sotmetre a un medi hipotònic, eliminar la cromatina amb formaldehid i tenyir el complex proteic, cinetocor i centròmer amb Nitrat de plata.
Obtenim imatges en que observem estructures filamentoses proteiques que formen els bivalents. Les imatges més electrodenses serien les vesícules sexuals (X i Y aparellats).
Una de les aplicacions és la determinació e l comportament meiòtic de les variants i anomalies cromosòmiques a meiosi I per la detecció d’anomalies en l’aparellament.
ESTUDI DE L’ESPERMATOZOIDE Fins l’aparició de FISH, l’estructura de l’espermatozoide, en ser un DNA altament compactat i interfàsic, era desconeguda. La única alternativa era un test que consistia en fecundacions interespecífiques entre espermatozoides humans i oòcits de hàmster, als quals eliminàvem la zona pel·lúcida. Utilitzant la maquinària de l’oòcit del hàmster de descondensació de la cromatina de l’espermatozoide, en la primera placa metafàsica de l’embrió on tens els cromosomes d’humans i hàmsters ben ubicats, s’aturava i s’observava.
Fins el 1995 només sabien fer això. La tècnica que s’ha d’utilitzar en cada cas depèn de l’anomalia que vols identificar.
24 ...



Comentario de mjorqueravinyals52 en 2015-01-06 00:07:17
Uns apunts molt bons!