Cultius cel·lulars tema 10 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2015
Páginas 2
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 13

Vista previa del texto

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 TEMA 10. CONGELACIÓ.
10.1.1 Introducció Per què ens interessa tenir cèl·lules congelades? Com més temps tinguem les cèl·lules en cultiu més inestabilització genètica patiran, més incrementarà la probabilitat de transformació, de contaminació, etc. A més, les línies cel·lulars no immortalitzades quan hagin arribat al seu nombre màxim de divisions entraran en senescència i finalment moriran. Per tant, és important cultivar les cèl·lules només quan les necessitem: la resta del temps cal mantenir-les congelades.
Quan tenim una línia cel·lular caracteritzada, les empreses productores solen tenir un stock de sembra i un altre stock congelat, que és el que distribuïran als laboratoris que el necessitin. L’stock d’usuari és el que nosaltres rebem.
Un com hem fet els experiments hem d’eliminar la línia cel·lular per evitar contaminacions creuades.
Tanmateix, com que s’assumeix que comprar noves línies és econòmicament poc viable, moltes vegades congelem les cèl·lules i les utilitzem per a posteriors experiments. Això sí, cal vigilar sempre les contaminacions i tenir-les sempre ben caracteritzades.
Com s’han de congelar les cèl·lules? →A concentracions elevades, per tal de maximitzar el nombre de cèl·lules viables després de la congelació, doncs en el procés sempre se’n perden unes quantes.
→Disminuïnt la temperatura gradualment, a una velocitat de 1 grau per minut.
Primer baixar la temperatura fins a -70 o -80ºC i després sotmetre la mostra a nitrogen líquid. Si ho fessim directament les cèl·lules petarien per la formació de cristalls d’aigua intracel·lulars. -50ºC és el que anomenem punt crític.
→Utilitzar crioprotectors (DMSO, polietilenglicol) a la concentració necessària.
→Mantenir les cèl·lules congelades a una temperatura constant, submergides en nitrogen líquid o gas.
10.1.2 Protocol de congelació 1 Utilitzem un medi al 5-10% de DMSO o glicerol i un 10% de sèrum. S’ha vist que treballant amb un percentatge més alt de sèrum augmenta la viabilitat cel·lular, doncs actua com un crioprotector.
2 Distribuïr les cèl·lules en criotubs. Són tubs envoltats d’escuma de manera que quan els posem en nitrogen aquest difon lentament i així permet baixar la temperatura més a poc a poc. Els podem mantenir en containers amb isopropanol a -80ºC, submergint només la part inferior del tub per minimitzar el risc de contaminacions. Després d’una nit es poden passar al nitrogen líquid.
3 Transferència a nitrogen líquid. Els posem en uns recipients que poden tenir la boca més o menys ample: en funció d’això cabran més o menys mostres. Com més ample més n’hi cabran; però la taxa d’evaporació del nitrogen serà més alta i per tant el consum també. S’arriba funs als -190ºC 10.1.3 Protocol de descongelació.
4 Descongelació. Es pot fer ràpidament a 37ºC. Alterta! Només sucar la part inferior.
2-3 minuts.
5 Transferim les cèl·lules a un flascó i els afegim el medi molt lentament, perquè el canvi d’osmolaritat no sigui tan brusc i no pateixin un xoc osmòtic.
6 Si ens interessa molt eliminar DMSO, un cop resuspès amb medi centrifuguem, l’eliminem i li apliquem de nou medi fresc. Si treballem amb cèl·lules adherents només cal rentar el medi i canviar-lo.
...