DGM- Tema 2. Hibridació molecular i sondes d'àcids nucleics (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 11
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 5
Subido por

Vista previa del texto

DGM- Tema 2 mfiguls TEMA 2: HIBRIDACIÓ MOLECULAR I SONDES D’ÀCIDS NUCLEICS A. HIBRIDACIÓ MOLECULAR 24/2/15 En el diagnòstic estem fent un genotipat. Hi ha dos models generals per genotipar, aquests es poden fer per: - Amplificació específica (DNA cloning): per clonatje mitjançant cèl·lules o PCR.
- Detecció d’una seqüencia específicaà HIBRIDACIÓ MOLECULAR. En aquesta tècnica utilitzem sondes per detectar una seqüencia concreta en el DNA La HIBRIDACIO MOLECULAR es basa en la possibilitat de formar estructures de doble cadena entre molècules d’àcid nucleics de diferent origen.
Estructures de doble cadena en els àcids nucleics: - DNA - RNA: es dobla una sola cadena amb sí mateixa.
El DNA es pot desnaturalitzar i renaturalitzar.
Aquest és el mecanisme en que es basa la hibridació molecular, en trencar l’estructura de doble cadena del DNA problema, i així separar les dues cadenes.
• La DESNATURALITZACIÓ es basa en trencar els enllaços que la formen mitjançant l’augment de severitat en l’ambient.
• Si tornem a baixar la severitat, podem RENATURALITZAR les molècules. Així doncs, podem aconseguir hibridar una seqüencia e DNA amb una altra, de diferent origen, per complementarietat à aconseguim ESTRUCTURES HÍBRIDES.
Tipus d’estructures híbrides d’àcid nucleic - DNA –DNA: poca força d’unió - DNA- RNA - RNA – RNA: molta força d’unió à Per això utilitzem en molts casos sondes de RNA.
Tipus d’hibridacions - En solució: la desnaturalització i renaturalització es fa en una solució liquida. L’eficàcia depèn de les concentracions (cal una alta concentració de la sonda) - Sobre un suport sòlid: dóna més bons resultats. En aquest cas, la molècula de DNA que es vol analitzar es fixa a un suport sòlid un cop desnaturalitzada, així, té menys opcions de renaturalitzar amb la seva complementària, i facilitem que hibridi amb la sonda. Nivell d’hibridació superior.
Procés de desnaturalització: Absorbància i temperatura de fusió Podem fer el seguiment de la desnaturalització mitjançant l’ABSORBÀNCIA. El DNA té una absorbància major o menor segons si està en doble cadena o no: - DNA doble cadena: té menys absorbància perquè les bases nitrogenades no estan exposades al exterior 1 DGM- Tema 2 - mfiguls DNA cadena senzilla: més absorbància. ABS a 260 nm.
àPer tant en la desnaturalització hi ha un increment de l’absorbància.
Ara bé, hi ha un interval de Tª on va pujant l’absorbància. En aquest interval hi trobem la Tm (temperatura de fusió) que és característica de cada estructura de doble cadena.
Ara bé, la desnaturalització es dona per blocs depenent del contingut amb GC de cada bloc.
Això és perquè en funció de %GC l’estructura de doble cadena és més o menys estable: si n’hi ha menys, serà més fàcil desnaturalitzar (caldrà una temperatura menor) i caldrà més temperatura quan hi hagi un elevat %GC.
• Els primers blocs que es desnaturalitzen, doncs, són els que contenen més AT i els últims els que contenen més GC.
• El punt mig de la desnaturalització correspon a la temperatura de fusió. En aquest moment hi ha el 50% de la molècula parcialment desnaturalitzada (NO! 50 % de molècules desnaturalitzades!).
Factors que afecten a les hibridacions dels àcids nucleics - Característiques de les molècules o Llargada de la molècula: nombre de nucleòtids § Com més llarga, més enllaços i més estable, per tant, més difícil de trencar o Complementarietat: seqüencia § Si hi ha seqüències que no es poden aparellar, menys estable és la doble cadena o Composició: percentatge GC § Com més GC, més estables son els complexes (hi ha més ponts d’H) i per tant, més difícils de separar.
Cal més temperatura per desnaturalitzar § Ex/ En molts casos, als amplicons els afegim una cua de poliG, perquè siguin més estables.
2 mfiguls DGM- Tema 2 à Al dissenyar els cebadors, hem de tenir en compte el nº de nucleòtids i el %GC.
- Característiques de l’ambient o Temperatura: és un agent desnaturalitzant.
o pH: com la Tª, també és un agent desnaturalitzant i igual que en el cas de la Tª, també tenim un pHm.
o Concentració salina: al incrementar la concentració salina, s’estabilitzen les dobles cadenes.
§ Es controla mitjançant els ions monovalents: Na+ § L’efecte estabilitzador dels ions divalents és major, és per això que és més fàcil controlar la desnaturalització i hibridació amb ions monovalents § Si volem incrementar la severitat, disminuïm la concentració salina o Agents desnaturalitzants: desestabilitzen estructures de doble cadena: formamida, formaldehid, urea...
à La desnaturalització es pot fer tant per pH com Tª, però a vegades treballem in situ i necessitem mantenir les estructures. En aquests casos, el que farem és baixar la Tm afegint agents desnaturalitzants a la solució. Així podem mantenir les estructures.
- Baixa astringència (=severitat): alta concentració salina, pH acídic(baix) i baixa temperatura Alta astringència: Baixa concentració salina, pH alcalí (alt) i alta temperatura Factors que afecten a la Tm: - Composició de bases: com més %GC, més alta és la Tm.
- Nombre de nucleòtids: a més llarga l’estructura, més Tm. El nombre de nucleòtids fa referència a la regió que hibrida.
- Força iònica: la Tm incrementa a mesura que la concentració de Na+ ho fa.
- Complementarietat. A menor complementarietat, menor Tm - Concentració de DNA à NO AFECTA! Però és útil per aconseguir més molècules hibridades, tot i que no afecta a Tm - Agents desnaturalitzants: baixen la Tm.
Cada casa comercial calcula la Tm per als seus cebadors.
Llibre: Molecular Biology and Genomics (Capítol 7) RNA Methodologies (Capítol 8) 25/2/15 B. SONDES D’ÀCIDS NUCLEICS Quan volem saber si hem amplificat una seqüencia per PCR fem una hibridació, que ens dona informació sobre l’especificitat de la seqüencia que hem amplificat.
Per fer això utilitzem SONDES.
Sondes d’àcids nucleics 3 DGM- Tema 2 mfiguls Una sonda es una petita molècula que ens permeti localitzar, identificar o quantificar seqüències específiques.
El fet que s’aconsegueixi una hibridació estable, dona informació que la molècula hi és present.
En tots casos també es pot localitzar la seqüencia en un cromosoma. També podem quantificarestimar el nombre de copies de la seqüencia.
Ús de les sondes La sonda però, ha d’estar marcada i hem de tenir un sistema de detecció de la marca.
A més, necessitem que les estructures dels àcids nucleics de la sonda com la mostra que analitzem estiguin DESNATURALITZADES, encara que la molècula sigui d’una sola cadena.
Un cop desnaturalitzades, s’han D’INCUBAR JUNTES, baixant les condicions de severitat. En la incubació, es poden renaturalitzar les sondes o el DNA diana, però també es poden formar ESTRUCTRES HÍBRIDES (sonda-DNA diana). El nostre objectiu és aconseguir el màxim d’híbrids, això ho fem treballant en un suport sòlid i incrementant la concentració de sonda.
Tota la sonda que s’hagi renaturalitzat alterarà el resultat, per tant s’han de fer RENTATS per eliminar la sonda que no hagi hibridat amb el DNA diana.
Tipus de sondes Distingim tres tipus de sonda: - De DNA: o Origen: les obtenim per mecanismes d’amplificació (clonatge in vivo en cèl·lules o amplificació in vitro per PCR).
o Característiques: Aquestes sondes es solen utilitzar en forma de doble cadena, d’un centenar de pb fins a molt centenars de Kb.
- De RNA (ribosonda): o Origen: s’obtenen per transcripció d’un insert de DNA clonat dins d’uns vectors adequats.
o Característiques: Són de cadena senzilla i un centenar de pb.
- D’Oligonucleòtids: o Origen: S’obtenen per síntesi química. Per la seva síntesi es poden utilitzar ribonucleòtids, Desoxinucleòtids...
o Característiques: Són de cadena senzilla de 15-50 nt.
Les unions més estables són les RNA-RNA, després les RNA-DNA i finalment les DNA-DNA.
4 DGM- Tema 2 mfiguls Marcat de les sondes El marcat de les sondes es pot fer amb diversos mecanismes: - Isòtop radioactiu: 32P, 33P,2H,...
En aquest cas, es detectarà la radioactivitat.
Aquest marcatge, però, implica un risc per la salut del qui manipula.
à El marcat radioactiu és més precís i sensible en termes de quantificar.
- No radioactiu: o Fluorescent: fluoròfors. Molècules amb activitat fluorescent per se.
o Dioxigenina, biotina... Aquests no tenen una activitat per se però es poden detectar mitjançant intermediaris que faciliten la detecció d’aquests compostos químics estranys.
à Aquest marcatge és: § Més segur § Més econòmic § La reacció de margat és més eficaç § Menys temps de detecció En el cas del marcatge no radioactiu, les molècules (tan els fluoròfors com biotina, dioxigenina...) poden estar espaiats per un separador. El separador permet que l’estructura de doble cadena (l’híbrid) es pugui formar correctament.
Marcat de sondes de RNA (Ribosondes) Quan fem sondes de RNA (ribosondes), les obtenim per transcripció in vitro. El més habitual és marcar-les durant aquest procediment.
El que fem és utilitzar vectors comercials que contenen dianes úniques adjacents a un promotor. En aquest lloc s’insereix el DNA que es vol utilitzar com a motlle per fer la ribosonda.
La diana ens serveix per linealitzar la molecular que s’ha copiat. Si no linealitzem, no tenim un punt de finalització de la transcripció i farem molta seqüència marcada que no correspon a la sonda.
En la síntesi cal afegir els 4 ribonucleòtids trifosfat que necessitem per sintetitzar el RNA de novo. Un d’ells és el que portarà la marca (UTP).
La longitud de les sondes variarà però totes començaran en el mateix punt.
A més, tenim dos orígens o promotors orientats en sentit contrari de tal manera que podem transcriure en ambdós sentits per formar sondes complementaries.
5 DGM- Tema 2 mfiguls Per fer les sondes de DNA fem servir diversos mecanismes, però el més utilitzat és la polimerització enzimàtica.
No és freqüent utilitzar els 4 nucleòtids marcats.
Un cop marcada, tindrem dues cadenes que serveixen com a sonda, però també hi ha sistemes que poden marcar només una cadena.
Marcat de sondes de DNA Els mètodes més utilitzats pel marcatge són: - PCR: 1. Al fer les sondes, el primer que fem és clonar la seqüencia que s’utilitza com a sonda en un vector (com un plàsmid) 2. A continuació amplifiquen la seqüencia per PCR.
a. Els encebadors poden ser universals o específics de seqüencia, segons si volem l’amplificació més específica o no.
b. Un dels nucleòtids que s’afegiran en la amplificació estarà marcat i per tant, el producte també. La marca també podria posar-se nomes en l’encebador.
à La PCR en general permet marcar sondes curtes (de pb). Els altres mètodes permeten marcar sondes més grans - Nick translation: 1. Fem una primera incubació amb DNAsa1 pancreàtica i magnesi. En aquestes condicions, l’enzim produeix talls en les molècules de DNA.
2. A continuació, el DNA nickat s’incuba en presència de la Pol1 d’E.coli i 4 nucleòtids, un d’ells marcat. La pol1, a més de l’activitat polimerasa té activitat 5’3’ exonucleasa.
Per tant, trobarà l’extrem 3’OH lliure i iniciarà la síntesi, però alhora durà a terme l’activitat exonucleasa. És a dir, digerirà el que es troba per davant i sintetitzarà el que te darrera, per tant, mitjançant aquest mecanisme substituïm les cadenes inicials per noves cadenes amb la marca.
- Random primed: 1. Desnaturalització del DNA 2. Incubació en presència d’exonucleòtids (tenen 6 nt) que es disposen sobre la seqüencia desnaturalitzada aleatòriament i quan es baixa la temperatura s’uneixen a diferents punts de la molècula. Aquests exonucleòtids serviran com a encebador 6 DGM- Tema 2 mfiguls 3. S’afegeix la polimerasa Klenow i nucleòtids, un d’ells marcat. Així doncs, es sintetitza l’altra cadena. La polimerasa Klenow ha estat modificada perquè no tingués l’activitat exonucleasa, per tant a partir de 3’ OH sintetitzarà la resta de cadenes. Així doncs aconseguim, com en el cas anterior, substituir les cadenes.
Podem observar diferències entre la primera tècnica i les altres dues pel que fa als productes marcats (sondes) obtinguts: - Per PCR marcarem sondes petites, no més enllà de 3-5 Kb - Nick translation i random primed acaben donant la sonda fragmentada, mentre que PCR dona la molècula junta.
- Nick translation i random primed no incrementen el nombre de molècules de sonda mentre que la PCR sí Marcat de sondes d’oligonucleòtids En el cas dels oligos es solen marcar els extrems 5’ (tot i que també ho poden fer els 3’). Les sondes de DNA i RNA es podem també marcar als extrems.
3/3/15 Marcat de les sondes • • • Si marquem tot el vector que inclou la sonda, no tindrem una referència de la quantitat de sonda marcada, ja que la majoria de marca que s’observa correspondrà a seqüència que no es sonda.
Es poden obtenir sondes específiques de cadena marcant un dels dos encebadors de PCR als extrems.
L’end labeling és el mètode que s’utilitza per marcar oligosondes.
- End labeling 7 DGM- Tema 2 mfiguls Si ens interessa marcar l’extrem 5’ s’empren quinases o transferases/lligases per unir-ho.
El mètode més habitual és marcar l’extrem 5’, tot i que també es pot marcar el 3’.
5’ End labeling En aquest mètode s’utilitza una quinasa que intercanvia grups fosfats dels extrems 5’ entre molècules. Es barreja una quinasa (normalment del bacteriòfag T4) amb la sonda i ATP amb els grups ϒ-32P marcats. De manera que mitjançant la quinasa, un oligo sense marca obté un grup fosfat del ATP marcat i l’ATP s’emporta el que tenia l’oligo, que no estava marcat.
L’ATP està marcat en aquesta posició perquè es el fosfat de l’extrem. Si volguéssim utilitzar una polimerasa, la marca hauria d’estar en el fosfat alfa, perquè aquesta agafa el primer fosfat .
Aquests oligos es podrien utilitzar com a encebadors per PCR per tal d’obtenir producte marcat al seu extrem.
3’ End labeling DNA: Si ens interessa marcar l’extrem 5’, hem d’utilitzar transferases terminals (TdT) de DNA que no necessiten motlle i incorporen nucleòtids al extrem 3’ del DNA. Si volem incorporar sols a un, utilitzarem Desoxinucleòtids.
RNA: Si volem marcar RNA utilitzarem la lligasa d’RNA terminal que és una lligasa especial que incorpora nucleòtids al extrem 3’ dels RNAs.
3’ Fill-in end labeling Hi ha un mètode molt senzill per marcar els extrems.
Hem utilitzat un enzim que ens deixa extrems cohesius i necessitem passar-los a roms.
• És per això que tallem amb un enzim de restricció, com EcoR1 el que dona extrems cohesius.
• A continuació, rentem amb la polimerasa de DNA klenow i nucleòtids marcats. Així doncs aconseguirem extrems roms i a més, marcats.
En aquest cas es marca l’extrem 3’.
Si volem obtenir dues sondes diferents, una de cada cadena, podem tallar amb un enzim de restricció per una diana interna que tingui una posició asimètrica (les dues sondes marcades són la que comença per TTAAG i la que acaba per GAATT).
8 DGM- Tema 2 mfiguls Detecció de les sondes En funció del marcatge que utilitzem, la detecció serà diferent.
Els tipus de detecció són: • Directa: amb qualsevol sensor o càmeres de detecció. Les molècules utilitzades per marcar tenen activitat per si mateixes.
o Radioactivitat o Fluorescència o Avantatges § Major sensibilitat (especialment radioactivitat): molt important si necessitem quantificar .
o Inconvenients § Pèrdua d’activitat § Major cost § Major preparació del personal (major risc). Aquest és un exemple clar de la radioactivitat.
Normalment s’utilitza la fluorescència, que també te una alta sensibilitat i no és tant perillosa per l’ésser humà.
• Indirecta o Anticossos o Molècules afins (biotina, modificacions al DNA...) o Avantatges § Major duració § Menor cost § Menor preparació del personal (menor risc) o Inconvenients § Menor sensibilitat Si no necessitem la sensibilitat que ens donen els mètodes directes és més recomanable utilitzar els indirectes. De la mateixa manera, si necessitem quantificar tan sols podem utilitzar radioactivitat o fluorescència.
Mètodes indirectes En el marcatge indirecte, com hem marcat la sonda utilitzarem un intermediari amb activitat que reconegui la molècula utilitzada per marcar • Per exemple, si utilitzem anticossos, que no tenen en sí cap activitat, necessiten estar conjugats amb un grup químic (amb acivitat) que es el que genera la marca a la sonda.
L’ Intermediari sempre ha d’estar unit a un grup químic que permeti la detecció, és a dir, que presenti activitat.
- Incubacions de detecció: Després de la hibridació amb la sonda i els rentats haurem d’incubar en presència dels intermediaris per tal de que aquests s’uneixin al grup químic de la sonda. Generalment es fan vàries incubacions fent diferents capes (anticòs-antigenanticòs-grup químic amb activitat...). El fet d’utilitzar diversos intermediaris, fa la detecció més fàcil - Rentats: Més tard, caldrà rentats per eliminar els intermediaris que no s’hagen unit a la sonda.
9 mfiguls DGM- Tema 2 Si es vol detectar activitat enzimàtica, fa falta afegir el substrat adient que sigui sensible a l’activitat del grup químic que permet la detecció. Els substrat conté un fosfat que s’elimina mitjançant la fosfatasa alcalina.
El substrat al que se li elimina el grup fosfat permet diferents tipus de detecció (la detecció no depèn tant de l’enzim, sinó del substrat).
La detecció indirecta de les sondes pot ser: - Cromogènia (precipitat de color).
o Avantatge: És la més econòmica perquè es fa la detecció directa (hibridacions in situ, southerns) o Inconvenient: el precipitat no es pot treure, a aquesta preparació no se li pot fer res més (no es poden analitzar diferents sondes a una mateixa mostra).
§ - Exemple: sonda marcada amb anticòs fosfatasa alcalina. El substrat es transforma gracies a la fosfatasa alcalina i hi ha una detecció cromosaica (precipitat de color) Quimioluminiscència (precipitat de color): en alliberar el compost aquest emet fotons de llum. És una alternativa bastant bona.
o o o o o Avantatge: el material que s’està analitzant no s’ha alterat, de manera que es poden analitzar diferents sondes a la mateixa mostra.
Sensibilitat molt bona (tot i que no tant com la del marcatge radioactiu).
La resolució pot arribar a ser més bona que la del marcatge radioactiu.
Temps d’exposició més curt que el de marcatge radioactiu (on pot arribar a durar setmanes) Perill potencial per la salut molt inferior al del marcatge radioactiu.
10 DGM- Tema 2 - mfiguls Fluorolescència; el substrat allibera un foto fluorescent (quimiofluorescència).
Sensibilitat, exposure time i potential Health hazards: son les tres característiques que ens fan decantar-nos per una o altra tècnica.
Article: Chemiluminiscence as diagnostic tool. A review Llibre RNA metodologies (Capítol 12) Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing (Capítol 2) 11 ...