Tema 8. Clonaje (2017)

Resumen Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Nanociencia y Nanotecnología - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2017
Páginas 4
Fecha de subida 13/06/2017
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2017 Tema 8. Clonaje BIOLOGÍA MOLECULAR. 2º NANOCIENCIA SARA ARIAS BLANCO 1 1.
VECTORES DE CLONAJE Origen de replicación (replicación del vector independiente de la del genoma para que se pueda regular) Inicio: AUG Sitios de restricción (para cortar el vector de forma específica) Requisitos básicos Final de traducción: TGA Marcador de selección, para poder diferenciarlas.
Elevado número de copias.
Polilinker complejo; MCS con muchos puntos de restricción diferentes.
Primers específicos para la secuenciación.
Características deseadas 𝐏𝐫𝐨𝐦𝐨𝐭𝐨𝐫 𝐩𝐚𝐫𝐚 𝐥𝐚 𝐬í𝐧𝐭𝐞𝐬𝐢𝐬 proteica o de mRNA; tiene que haber RBS y un promotor fuerte y regulable antes del polilinker.
Marcador para la 𝐬𝐞𝐥𝐞𝐜𝐜𝐢ó𝐧 𝐝𝐞 𝐥𝐨𝐬 𝐫𝐞𝐜𝐨𝐦𝐛𝐢𝐧𝐚𝐧𝐭𝐞𝐬: añadiendo secuencia de aminoácidos en extremo C o N para aislar una proteína.
𝐎𝐫𝐢𝐠𝐞𝐧 𝐝𝐞 𝐫𝐞𝐩𝐥𝐢𝐜𝐚𝐜𝐢ó𝐧 𝐩𝐚𝐫𝐚 𝐬𝐬𝐃𝐍𝐀: importante en los fagémidos. El origen de M13 dará lugar a ssDNA.
2. INTRODUCCIÓN DEL DNA EN LA CÉLULA HUÉSPED Para seleccionar vectores y amplificarlos, hace falta pasarlos por un mecanismo celular (hospedero) que te permita expresarlos, como E. Coli. Crece muy rápido en medios baratos. Además es muy fácil de transformar (alta permeabilidad de membrana). Además no hace modificaciones postraduccionales, y genera agregados de proteínas. Método Descripción Ventajas y desventajas Transformación Controles: Se pueden conservar y se reutilizan No siempre sirve para células vegetales. • Viabilidad (comprobar que las células están vivas) • Contaminación (comprobar que las células son competentes). 1. Permeabilización de la membrana con sales, o ↓ T. 2. Incubar en agua fría con los plásmidos 3. Obtenemos las células transformadas y aplicamos un choque térmico ↑ T y luego hielo. 4. Incubar en medio selectivo y selección de las células en fase logarítmica. Conjugación Depende de la presencia del factor F. No es útil en el lab. Se crea un puente interbacteriano que permite el paso del DNA. Transducción Transferencia de DNA de una bacteria a otra mediante un virus. Los cósmidos se introducen de esta 1. El fago inserta su DNA forma. 2. Los enzimas del fago degradan el DNA huésped. 3. La célula sintetiza nuevos fagos, que tendrán el DNA deseado. 4. Estos fagos podrán insertar DNA en otras células Electroporación Se introduce el DNA en una célula a través de la membrana aplicando un pulso eléctrico. Se usa solo en el lab. Usamos ↓ 𝑠𝑎𝑙 para evitar peligros. Se puede usar en TODAS las células Se usa cuando es difícil insertar el material genético. Transfección Introducimos DNA exógeno en célula eucariota por método no viral; fosfato de calcio, dendrímeros, liposomas, electroporación, gen.gun, microinyección. Ilustración 1. Introducción del DNA en la célula huésped. 2 Nombre del vector Características principales • • Plásmido • • • • • Bacteriófagos Cósmido Fagémido BAC YAC • • • • • • • • • • • • • • • • • <15kb Circular bacteriano con duplicación independiente de cromosoma. Ejemplos, bacteriófago T7, vector de expresión con promotor fuerte, y regulable. Copias plásmido>copias cromosoma. Conjugación bacteriana. Plásmidos con origen de replicación independiente (para ser compatibles) Marcador de selección <50kb Virus con DNA lineal que atacan a bacterias. Pueden usarse enteros o solo un fragmento 30-45kb Plásmidos sintéticos derivados del bac 𝜆 3 sitios de restricción Consigo mayor amplificación que con el fago 𝜆. Se replica como un plásmido normal <12kb Híbrido plásmido (dsDNA circular) + fagoM13 (ssDNA) Todas las utilidades de los plásmidos, pero además puede producir ssDNA. Bajo número de copias 100-300kb (menor capacidad que YACs). Vector plasmídico, con factor F activado. Secuencias que regulan específicamente el número de copias Bajo número de copias >150kb, si es menor es inestable. Cromosoma artificial de levadura. Es pequeño y necesita insertos grandes Cuando está linealizado tiene estructura centromérica y telómeros del cromosoma. Tipos VECTORES DE CLONAJE→ MCS con muchos sitios de restricció𝑛. Se comercializan con T linealizados. Subclonación (no enzimas de restricción) VECTORES DE EXPRESIÓN→ secuencias organizadas en casettes: promotor+RBS+MCS+3’UTR (región terminadora). Promotor regulable VECTORES LANZADERA→ dos orígenes para 2 especies diferentes. Manipulació𝑛 en bacterias(rápido) y expresión en eucariotas. Aplicaciones Clonaje y librerías de cDNA BACTERIÓFAGO 𝜆 (dsDNA lineal de 49kb que se empaqueta en forma circular). Entra en la célula cuando ↓ 𝐠𝐥𝐮𝐜𝐨𝐬𝐚 y ↑ maltosa; dentro escogerá vía lisogénica o vía lítica. Contiene secuencias no esenciales entre Lcos y Rcos(20-35kb), donde irá el inserto. Cuando se ha insertado, el genemoa se vuelve a ciclar pos los extremos cohesivos para poder entrar en la cápside. Una colonia infectada estará en ciclo lítico. Identificación por blancas y azules con X-gal. M13 (ssDNA circular 6,4kb). En librerías genómicas y de cDNA. Contiene gen GAM, inhibe ciclo lisogénico. Las bacterias que lo hayan aceptado estarán en ciclo lítico. Contiene sitio COS, que permite empaquetado in vitro de hasta 45kb. Podemos lograr uniones de cósmidos recombinantes; infectan nuevas células y vuelven a circularizar. Clonar librerías grandes. Se manejan como plásmidos, creciendo como dsDNA, y cuando deseas obtener ssDNA se infecta el cultivo con M13 auxiliar. La proteínas II del fago, reconocen el origen de replicación, corta la hebra +, y replica en forma de ssDNA. Aplicaciones ssDNA à sondas (northern blot) y ensayos de mutagénesis. cDNA y librerías genómicas, sondas y mutagénesis OriS (origen de replicación del factor F) + repE (control de la replicación del plásmido) + parA, B, C (control de la replicación)+CMr (gen de resistencia al cloranfenicol) + LacZ’ (cloning site sustituído, se usa para la alfa complementación). Librerías genómicas. Marcadores de selección; X e Y en cada brazo. Primero se replica y purifica como un plásmido. Luego se digiere con BamH1 por sitios Tel, se elimina un fragmento y se pasa a tener DNA lineal con estructura de cromosoma. Cortas e insertas tu gen (no hay remplazamiento, único corte) entre el gen X y e l Y. Crece bien si tienes dos brazos diferentes + inserto Librerías genómicas Ilustración 2 3 3.
IDENTIFICACIÓN DE LOS RECOMBINANTES Para saber si nuestro gen se ha recombinado correctamente y se han generado nuevas copias. Siempre se puede hace tanto análisis por electroforesis como PCR. Dependiendo del vector podemos hacer una inactivación insercional o una alfa-complementación. Dependiendo de la proteína sintetizada, podemos diferenciar por función proteica o por anticuerpo específico. Después de estos métodos, habrá que secuenciar para ver si tu inserto ha mutado. Inactivación insercional Selección e inactivación de dos genes de resistencia a dos antibióticos. Dependiente del Alfa-complementación Basado en operón Lac. Recombinante blanco, y no recombinante azul. vector (blancas o azules) Puede haber falsos negativos Cortamos con los enzimas usados para clonar, amplificamos los fragmentos correspondientes con el inserto. Siempre Restricción y electroforesis Se hacen mezclas de diferentes colonias y después una electroforesis conjunta. Se escoge la banda más intensa. Haces restricción y electroforesis de esta mezcla, vuelves a usar la más intensa y secuencias. Ilustración 3. Identificación de los recombinantes. 4. LIBRERÍAS GENÓMICAS Una genoteca es una colección de genes que incluyen todo el DNA genómico de una especie. El número de clones necesarios para obtener una probabilidad P de clonar una secuencia en particular es; 𝑁 = qr (stu) x y vw(st ) , donde i es el tamaño del inserto y g el del genoma. Usos: • Identificación y clonaje de secuencias específicas • High-throughput La fragmentación: digestión parcial que se lleva a cabo para conseguir el tamaño adecuado. • Enzima de restricción que reconoce 4 pb. • Tamaño de los fragmentos resultantes ~265𝑝𝑏 Se hace electroforesis el genoma fragmentado; se selecciona la zona entre las bandas del tamaño que tendrá el genoma entero y se liga a un vector cortado (diferente dependiendo del tamaño del fragmento). Ejemplo: librería con fago 𝜆. El vector mide 50pb y acepta un máximo de 35pb. DNA humano 10• pb 1) Por una parte el inserto Digestión parcial con Sau3A en fragmentos de 20kb con extremos cohesivos 𝐶𝑜𝑟𝑡𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛 𝐵𝑎𝑚𝐻1 𝑒𝑙 𝑙𝑢𝑔𝑎𝑟 𝑑𝑜𝑛𝑑𝑒 𝑖𝑟á 𝑒𝑙 𝑖𝑛𝑠𝑒𝑟𝑡𝑜 2) Por otra parte el vector 𝑇𝑒𝑛𝑒𝑚𝑜𝑠 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑒𝑚𝑜𝑠 𝑐𝑜ℎ𝑒𝑠𝑖𝑣𝑜𝑠 𝑦 𝑑𝑒𝑠𝑒𝑐ℎ𝑎𝑚𝑜𝑠 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑔𝑖ó𝑛 𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑙 3) Mezclamos ambos y unimos con la DNA ligasa. 4) Se empaqueta in vitro y obtenemos un virión recombinante con DNA humano genómico. 4 ...