DGM- Tema 6. Anàlisi dels productes de PCR (2015)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 3º curso
Asignatura Diagnòstic Genètic Molecular
Año del apunte 2015
Páginas 17
Fecha de subida 16/03/2016
Descargas 9
Subido por

Vista previa del texto

DGM- Tema 6 mfiguls TEMA 6: Anàlisi dels productes de PCR En la PCR aconseguim generar milions de copies d’una seqüencia que es vol analitzar. Com s’analitza el producte de la PCR? Com analitzar els productes de PCR? - - Electroforesi en gel d’agarosa convencional: ens dona informació sobre: o Si s’ha amplificat el producte o Grandària del producte, i per tant, si s’ajusta a l’esperat o Si hi ha inespecificitats o És la més utilitzada Electroforesi en gel de poliacrilamida: més precisa que la d’agarosa (en quant a grandària del producte) Electroforesi capil·lar: més precisa que la d’agarosa (en quant a grandària del producte) Blotting: si només ens interessa detectar si la seqüencia s’ha amplificat, no la seva grandària.
Altres: També hi ha altres possibles tècniques com cromatografies, espectrometries de massa...
1. Electroforesi convencional en gel d’agarosa - Determinem presència / absència d’una seqüencia específica en la mostra o Per poder detectar això, necessitem un CONTROL, perquè així ens determina si bé no hi és la seqüencia, o que no s’ha amplificat perquè no s’ha dut a terme bé la PCR o Ens permet la determinació de: § Sexe: es detecta, per exemple, una seqüencia específica del cromosoma Y (que determina el sexe masculí) § Infeccions / paràsits: com per exemple, el virus de l’hepatitis C, un virus de RNA.
En aquest cas, es faria una RT-PCR (s’amplifica una seqüència de 450bp del 5 ́UTR d’un gen propi del VHC) Múltiplex PCR Permet detectar vàries seqüències a la vegada, però requereix un disseny molt precís: - Dissenyar molts encebadors, i, que, a més, no dimeritzin entre ells - La llargada de l’amplicó obtingut de cada seqüencia analitzada (per exemple, cadascuna d’un organisme), ha de ser diferent, per així poder diferenciar els productes per grandària i associar-los, en aquest cas, a un organisme.
També es poden detectar reordenacions cromosòmiques 1 DGM- Tema 6 mfiguls RET/PTC: L’oncogen Ret es troba mutat en diferents tumors del sistema endocrí. Únicament s’han descrit reordenacions cromosòmiques que afecten a ret als tumors dels càncer de tiroides pal·liar (PTC).
En la reordenació (inversió), es forma un gen quimèric que sempre conté la regió corresponent al centre amb activitat tirosina quinasa de ret. El més comú és que es formi un gen RET/PTC1.
En tots els gens de fusió analitzats, s’ha vist que el gen sempre conté l’exó 1 de l’H4 (la regió promotora) i a partir de l’exó 12 de ret. Per tant, el trencament és dona entre l’intró 1 de H4 i l’intró 11 de RET.
Així doncs, podem fer encebadors per l’exó 1 de H4 i 12 del ret, podem veure si s’ha donat la inversió.
Com que la direcció del transcripció dels dos gens és la mateixa, si no s’ha donat la inversió és impossible que s’amplifiqui res utilitzant aquests primers.
Però el gran problema és que l’intró 1 de H4 és molt gran, el que no permet amplificar en una sola reacció tota la regió invertida. No obstant, si analitzem el cDNA quimèric mitjançant RT-PCR, llavors aquest intró ja no hi serà perquè analitzem RNA, per tant, podem detectar si s’ha donat la inversió.
Detecció en gel d’Agarosa Quan s’analitza el producte en gel d’agarosa solem utilitzar colorants amb afinitat pel DNA per que ens donen fluorescència.
- Bromur d’etidi (EtBr): és un agent intercalant del DNA o És un carcinogen conegut, per tant s’han desenvolupat diferents colorants, molts d’ells no són massa tòxics, però tots son tòxics o El bromur d’etidi és molt sensible, permet detectar de 1-5 ng de dsDNA - Taronja d’acridina: menys precís. Té un límit de detecció de 50ng de ds DNA.
- Blau de metilè: No és tòxic però és menys precís. Té un límit de detecció en torn a 50-200 ng de dsDNA.
Però hi ha més colorants, menys tòxics que bromur d’etidi i gairebé amb la mateixa precisió 2 DGM- Tema 6 - mfiguls SYBR Green I: Molt mes sensible que els colorants anteriors (a excepció de EtBr). Pot detectar fins a 20pg de dsDNA. A més, és menys tòxic.
2. Blotting Una altra alternativa és transferir a una membrana i hibridar amb una sonda especñifica el producte de PCR; així doncs, augmentem la sensibilitat. Si, a més, detectem amb radioactivitat, podem arribar a detectar fins a 10 ng.
Dot o Slot blotting Si no necessitem separar electroforèticament els productes de la PCR el podem transferir directament (desnaturalitzat) al filtre per a la posterior anàlisi per hibridació. Això ens permet: - treballar amb poca mostra - molta més sensibilitat - ideal per a analitzar múltiples mostres: cada gota, en aquest cas, correspon a una mostra analitzada. El sistema de transferència, conté el filtre i uns pouets per on es posa la mostra.
o Si utilitzem plaques que tenen múltiples pouets, parlem de dot blot o Si utilitzem plaques que tenen ranures allargades, parlem de slot blot 3 DGM- Tema 6 mfiguls També es poden detectar variacions en la llargada de la seqüencia.
Distròfia muscular de Duchenne Imaginem el següent exemple, en el que tenim dos bessons sense antecedents familiars amb distròfia.
La distròfia està causada en la majoria de casos per delecions, que es poden analitzar per Southern, però és molt complicat perquè les bandes són molt grans.
El que podríem fer també es una PCR múltiple on s’amplifiquen els diferents exons. La absència d’exons indica que l’exó no està present.
En l’exemple, es va trobar que apareixien totes les bandes que havien d’aparèixer però hi havia un cas on la banda amplificada era més gran (a l’exó 44). Llavors, es va repetir l’anàlisi únicament a aquest exó, el que va indicar que els nens no presentaven l’amplificació de l’exó 44 però si d’una seqüencia més gran., mentre que la mare era heterozigota i el pare normal.
Per tant, es va identificar una mutació de novo que va aparèixer en la línia germinal.
La PCR però, no és la tècnica més usual per detectar una mutació.
Amplificació de microsatèl·lits: Quan ens interessen els canvis de grandària, és quan analitzem microsatèl·lits. Els microsatèl·lits es poden analitzar per: Southern: digerint el DNA a partir de dianes de restricció. Per tant el que variarà es la llargada del fragment de restricció - PCR: la grandària del producte que amplificarem dependrà del nombre de repeticions (la llargada del fragment de restricció no varia, sinó que varial a llargada del fragment amplificat). En aquests casos, s’utilitzen gels de poliacrilamida (o seqüenciació) (ja que té més capacitat de discriminació). En aquests casos, com que el gel és molt resolutiu (fins i tot ens pot detectar diferències d’un nucleòtid) , apareixeran múltiples bandes. Això és degut al “TARTAMUDEIG”: quan amplifiquem seqüències repetitives, la polimerasa pot generar errors.
- 3. Electroforesi capil·lar Ens permet treballar amb molt petites quantitats de mostra (1-10nl), és ràpida (1 a 45 min) i té una resolució molt elevada (ens permet discriminar un sol nucleòtid de diferència). Permet la automatització, quantificació i reproductibilitat.
4 DGM- Tema 6 mfiguls En l’electroforesi capil·lar tenim un buffer en el qual hem posat la mostra que analitzem i el desplaçament va en funció de les càrregues. Quan més gran es la molècula, més carregues te i més ràpid es desplaça.
Quan hem de fer una electroforesi capil·lar, utilitzem encebadors marcats amb fluorocrom ja que tenim un detector de fluorescència, el qual detecta el pas de pics de fluorescència per unitat de temps. En aquests casos també apareix el tartamudeig.
Ex/ Malaltia de Huntington Si l’extensió del microsatèl·lit és molt gran, és molt difícil de detectar-lo per PCR i l’absència d’amplificació ens pot donar un resultat erroni. Si el resultat ens diu que un individu és homozigot per l’al·lel normal, fem igualment un Southern per comprovar que el resultat és fiable i no hi ha hagut un problema d’extensió.
Normalment, al fer una PCR múltiple on amplifiquen diferents amplicons de microsatèl·lit, els pics corresponents als microsatèl·lits més grans, són més baixos, perquè costa més amplificar-los (al ser més gans).
Tipus d’encebadors per amplificar regions repetitives (microsatèl·lits) - Encebadors on l’extrem 3’ reconegui les seqüències dels microsatèl·litsà aquests, com que poden caure en qualsevol punt, ens donaran un conjunt de seqüències amplificades i llavors 5 DGM- Tema 6 mfiguls ens apareixeran diferents pics. (Utilitzant aquests encebadors, en el cas de C (21 repeticions), havíem diagnosticat que l’individu era homozigot, però darrere d’aquest es veuen més pics, per tant, hi ha un al·lel més gran, el que podria indicar que no és homozigot. Això però, s’ha de confirmar per Southern.
Pèrdua d’heterozigosi: La pèrdua d’heterozigosi sovint s’analitza en mostres de tumors i es pot avaluar per Southern però és millor per PCR. Els productes es podran analitzar per electroforesi normal (agarosa o acrilamida) o bé capil·lar (llavors avaluarem pics enlloc de bandesàà si hi ha dos pics, no hi ha pèrdua d’heterozigosi, però si n’hi ha un si).
Ara bé, si el que caracteritza el tumor es la inestabilitat genòmica (que afecta a la mida dels microsatèl·lits) observem que en la mostra tumoral (T), el pic no desapareix (no hi ha LOH) sinó que varia el numero de repeticions, de manera que el pic canvia de posició.
6 DGM- Tema 6 mfiguls Per tant: - LOHà pèrdua d’un pic - Inestabilitat genòmicaà canvi de posició del pic Hi ha variants a la PCR, podem analitzar dues mostres de DNA (de teixit normal i tumoral) i analitzar un gen amb encebadors verds per la mostra tumoral i vermells. Els productes s’analitzaran per electroforesi capil·lar.
Si els pics (verds i vermells) coincideixen entre les dues mostres, es que no hi ha inestabilitat genòmica (exemples esquerra) però si n’hi ha, ens apareixen múltiples pics nous en vermell (exemples dreta).
A PARTIR D’AQUI NO PASSAT NI IMPRÈS 7 DGM- Tema 6 mfiguls 26/3/15 DETECCIÓ DE MUTACIONS I METILACIONS De manera semblant, al Southern seqüencia estudiada (amplificada) blot també podem analitzar mutacions que afecten a la Per Southern, podríem posar de manifest la presència d'una mutació que alterés una diana de restricció.
Per tal de fer això, cadascun dels productes de la segona reacció de PCR es tractat amb enzim de restric ció per comprovar si el fragment s’ha digerit o no. Així podem distingir si l’individu es homozigot per absènc ia de digestió, presencia de digestió o es heterozigot (dues bandes).
PCR-RFLP Fem un anàlisi per PCR. En alguns casos també es pot fer un anàlisi múltiple de diversos punts que estigui n a la diana de restricció.
Aquesta és una PCR on s'amplifica una seqüència que conté les possibles mutacions (polimorfismes), a la segona PCR només la seqüència concreta on hi és la mutació.
Llavors tractem els amplicons amb enzims per veure si els fragments s’han digerit.
• En aquest cas NO UTILITZEM SONDES, el que observem es la quantitat de DNA marcat amb un colorant fluorescent. Els fragments més petits retindran menys colorant i donen menor intensitat, igualment que hi hagi més còpies. Això ho fem per cada seqüència concreta.
És una eina molt senzilla i molt més ràpida que el Southern perquè amplifiques la seqüència que t'interessa a partir de mostres més petites.
Limitació: Si la mutació no afecta al fragment de restricció no podem detectar-ho per Southern, perquè si és una mutació puntual que no afecta la diana no ho veurem.
Per PCR si que podem detectar mutacions que no afecten a dianes de restricció. Per això utilitzem PCR específiques d’al·lel, on s’utilitzen encebadors específics de l’al·lel.
PCR específica d’al·lel (ASO) En aquesta, NO FEM SERVIR ENZIMS DE RESTRICCIÓ. Per tant serveixen per DETECTAR VARIACIO NS / MUTACIONS, encara que no afectin a la diana de restricció.
8 DGM- Tema 6 - mfiguls Base: estabilitat de l’extrem hidroxil 3’ que necessita encebar la polimerasa.
o Si aparella de manera estable, la polimerasa podrà sintetitzar a partir d’aquest encebador.
o Si no aparella, no pot sintetitzar i no hi ha amplificació.
Per tant, es tracta de dissenyar 2 encebadors que el seu extrem 3’ coincideixi amb un nucleòtid, un per a la forma SALVATGE, I un altre per la forma MUTADA. També tindrem un tercer encebador comú (per als dos al·lels) - L’encebador específic per la forma salvatge aparellarà per l’extrem 3’ i la polimerasa sintetitzarà.
Però si hi ha la mutació no podrà aparellar i la polimerasa no sintetitzarà.
- S’observa la presència o absència d’amplificació.
- Útil en sistemes DIALELICS Dels encebadors, un d’ell es comú i l’altre es específic per un dels dos al·lels (hi ha un específic per cada al·lel).
Per exemple, podem analitzar el DNA per dues PCR: - 1: Utilitzem l’encebador específic per l’al·lel 1 (P1) + R (reverse, encebador comú) - 2: Utilitzem l’encebador específic per l’al·lel 2 (P2) + R.
- Si només amplifica amb un dels encebadors podem suposar que es homozigot per un dels al·lels.
Si amplifica pels dos casos, serà heterozigot.
Com hem dit, la ASO va molt be per el cas de sistemes bial·lèlics. La majoria de polimorfismes son bial·lèli cs.
Podem tenir un fals positiu en el cas que l'encebador s'uneixi de manera no específica a l'al·lel que no és.
Si el nucleòtid està a l'extrem 3' i no desestabilitza suficientment la polimerasa i ens pot donar un fals positi u, per això, en el penúltim/últim nucleòtid introduïm un error d'aparellament expressament per incrementar les desestabilitzacions al 3' en el cas que no sigui el seu al·lel. Per tant en l’encebador específic , l’extrem 3 aparella encara que hi hagi un mismatch del nucleòtid final. Si no està present el seu al·lel no és un nucleò tid que no aparella sinó que són dos i això despararella totalment l'extrem 3'.
- Grau de desestabilització nul à G-C, A-T - G-T, A-C à aparellament prou fort per a que no hi hagi una desestabilització que impedeixi la síntesi 9 DGM- Tema 6 mfiguls Control d’amplificació? En l’ASO, esperem amplificació/no amplificació.
Sempre que un dels resultats sigui no amplificació cal afegir un control per estar segurs de que la no amplificació es conseqüència de que no està present l’al·lel que preteníem detectar. Això ens demostra que les condicions en les quals hem fet la PCR son correctes.
Si el control ja no ens amplifica, hem de tirar la PCR.
El control el podria afegir fent una PCR dúplex en la qual introduïm un nou parell d’encebadors per una REGIÓ CONSERVADA DEL GENOMA (mirant que la grandària del amplicó generat sigui diferent que la del amplicó de la seqüencia problema).
Ex/ Identificació hemacromatosi d’una mutació que confereix susceptibilitat a la Els dos encebadors específics no tenen perquè estar dissenyats per la mateixa cadena i de igual llargada.
Podíem fer un més llarg que l’altre. Però hauríem de poder distingir les llargades de l’amplicó.
Tenim el punt polimòrfic: Podem dissenyar un encebador específic per una cadena on el seu extrem 3’ coincideixi amb la mutació i un altre encebador en l’altra cadena on l’extrem 3’ també coincideix amb la mutació. Amb això, necessitem dissenyar un reverse per cadascun d’ells per poder amplificar una seqüencia determinada.
- Cal procurar que la grandària dels dos amplicons sigui diferent per poder distingir-los.
Fem una reacció amb 4 encebadors i com estan presents els dos encebadors reverse, es donarà un tercer amplicó més llarg, que ens serveix com a CONTROL. à SEMPRE HI HA D’HAVER AMPLIFICACIÓ Surt més econòmic perquè si ho féssim amb diferents PCR caldria fer molts encebadors.
A la PCR podem utilitzar OLIGOS ESPECÍFICS D’AL·LEL per determinar la presència de mutacions, aquests els podem utilitzar - ASA Com a SONDES à ASO Com a ENCEBADORSà 10 DGM- Tema 6 mfiguls A la PCR podem utilitzar oligont específics d'al·lel com a encebador (ASA) però també els podem utilitzar com a sondes, així que una PCR convencional hauríem de transferir el producte convencional i hibridar-lo amb l’oligo per després fer un anàlisi per blotting. Com que no necessitem separar per grandària faríem un dot-blot i després hibridaríem amb l’oligonucleòtid específic d’al·lel (ASO).
Amplifiquem per PCR la seqüència que ens interessa analitzar, a on possiblement estigui present la mutació, desnaturalitzem el producte amplificat i ho transferim a un filtre. Afegim solució alcalina, dipositem sobre el filtre, i fixem.
Una sonda gran hibrida de manera estable, si hi hagués un error, hibridarà (perquè l’error és un nt i la sonda és gran), fins i tot pot suportar un cert grau de no complementarietat i encara es manté estable la sonda. Però si utilitzem sondes d’oligos el major grau d’estabilització el tenim a la part central. Al llarg de la sonda trobem diferents dominis amb diferent composició de bases, l’estabilitat d’aquests blocs és diferent (la Tm és diferent). Per desestabilitzar un bloc el punt crític és el punt central, si està a l’extrem no desestabilitzarem gaire. A l’extrem la variació de la Tm és molt baixa, i a la part central desestabilitza tot i això es desnaturalitza amb molta facilitat. Per tant, si utilitzem oligos com a sondes tals que la mutació estigui al punt central, podrem discriminar molt bé la hibridació perfecta de la imperfecta (missmatch). Si incrementes molt la severitat desnaturalitzes tant si l’aparellament és perfecte com imperfecte, però hi ha un rang de severitat on es mantindrà unit si està perfectament aparellat i on es desnaturalitzarà si hi ha un missmatch.
Si hi ha un sol error, un nt que no hibrida igualment que estigui a la part central i la sonda és gran no es nota i pot suportar un cert grau de no complementarietat i seguir estan estable.
Al llarg de la molècula de DNA trobem dominis amb diferents % bases, l'estabilitat dels blocs és diferent en Tm, per desestabilitzar un bloc el punt crític és la part central no l'extrem. A l'extrem la variació de la Tm és despreciable. Al estar al mig es desnaturalitza amb més facilitat.
Si utilitzem oligos, si dissenyem l'oligo perquè hibridi amb el DNA motlle i el possible nt mutat estigui al centre poden discriminar les dues hibridacions pel mismatch. Podem variar la severitat i hi ha un rang on puc aconseguir que si l'aparellament és perfecte l'oligo es quedi unit però si no és perfecte la hibridació no aguanta. La especificitat de l'oligo ve donada pel punt central.
Utilitzarem oligos però si tens una sonda gran hibrida molt establement encara que hi hagi uns petits errors intermedis que comprometin la complementarietat no ho notaràs. Al llarg de la molècula de DNA trobem dominis amb diferent % de bases. L’estabilitat dels blocs és diferent em Tm així que per desestabilitzar un bloc el punt crític és la part central, no els extrems. Als extrems la variació de Tm és molt baixa però la variació de temperatura a la part central provoca un canvi d’estabilitat molt gran. Per tant, en usar oligos, si el dissenyem perquè hibridi amb el DNA motlle perquè el possible nucleòtid mutat estigui a la part central, podrem discriminar molt bé la hibridació perfecta de la imperfecta (missmatch). Si incrementes molt la severitat desnaturalitzes tant si l’aparellament és perfecte com imperfecte però hi ha un rang de variació de severitat que fa si l’oligo s’ha unit perfectament es mantingui hibridat i si és imperfecta es desuneixi.
11 DGM- Tema 6 mfiguls ASOH - L’anàlisi es fa per dot blot directe El DNA motlle és DNA amplificat per PCR corresponent a les seqüències a analitzar Les sondes són oligonucleòtids de 19-21 nt Un exemple per veure com es dissenyen les oligosondes: EX/ Anèmia falciforme, volem detectar un canvi en un aminoàcid, produït per una mutació.
• Podem dissenyar un oligo on la posició central coincideixi amb la mutació, l’oligo per l’al·lel salvatge es faria a partir de la seqüencia codificant i fem l’oligo de manera que coincideixi en el punt central de la mutació. Aquest ens permetrà determinar la presència de l'al·lel salvatge. Per tant en aquestes condicions es donaria hibridació en l’individu normal i l’heterozigot.
• L’altre oligo serà igual però hibridarà amb la mutació. Al hibridar-lo amb el filtre, no hibridarà en l’homozigot però si en l’heterozigot i l’homozigot per l'al·lel mutat.
En el filtre, a mes, afegim un control positiu i negatiu, en el positiu hi ha d’haver hibridació i en el negatiu no. Així ens assegurem que la hibridació s’ha donat correctament.
Després de la hibridació s’han de fer rentats de relativa severitat.
Hi ha dues opcions: - hibridar, deshibirdar i tornar a hibridar, és a dir, fer totes les mostres en un filtre. Cada mostra tindrà unes coordenades en el filtre, de manera que podrem analitzar moltes mostres. En cada hibridació posarem una sonda per un al·lel diferent i llavors analitzarem el resultat d’una mostra sabent les seves coordenades (si ens dona positiu per les dues sondes, és heterozigot).
- fer un filtre per cada mostra La fotografia seguent mostra un ASOH per individus afectats per fibrosi quística (+- à homozigot normal, ++ à heterozigot i -+à homozigot mutant) 12 DGM- Tema 6 mfiguls Dot blot directe vs revers Però en el dot blot directe, fixem sobre el suport sòlid el DNA a analitzar i s’hibrida amb sondes marcades.
Però el dot blot pot ser revers, llavors serà a l’inrevés. Partim d’un suport sòlid on té fixades les sondes utilitzades per l’anàlisi sense marcar. El que marquem són els productes que hem amplificat per PCR (mostra que analitzem). Per tant, és a l’inrevés.
- Amb el dot blot directe analitzem una mutació en diferents pacients Amb el dot blot revers analitzem la presència de diferents mutacions en un mateix individu. Per fer això, dissenyem una sonda per cada una de les mutacions en la seqüencia salvatge i en la seqüencia mutada, per tant per cada punt de mutació, tenim dues sondes: una per l’al·lel salvatge i l’altre per la mutant.
També podem veure patrons de metilació per PCR. Això sí, d’una manera diferent a la que ho fem per Southern.
Ens interessa saber si hi ha algun canvi en el patró de metilació en la seqüencia promotora d’un gen que analitzem. Per Southern utilitzàvem una parella d’enzims de restricció, però per PCR ho fem d’una manera diferent. Per PCR analitzem el DNA amplificat però aquest no tindrà metilacions, es perdran (perquè la taq nomes amplifica).
El mes normal, doncs, és tractar el gDNA amb disulfit sòdic, un fort mutagen , de manera que alterarà el DNA utilitzat com a motlle per fer la PCR.
Després del tractament el podem analitzar de diferents maneres: - COBRA - Methylation specific PCR - Bisulfite sequencing - MassArray specific PCR - Pyrosequencing 13 DGM- Tema 6 mfiguls 1. Seqüenciació / Bisulfit sòdic El tractament amb bisulfit sòdic produeix una desaminació de citosines és a dir, fa que la citosina perdi el grup amino i es converteixi en uracil. Ara bé la 5-metilcitosina (citosina metilada) és resistent a l’acció de disulfit sòdic i es manté com a citosina, per tant, després del tractament: - citosina à uracil - citosina metilada à citosina Si amplifiquem determinades seqüències de regions promotores susceptibles al silenciament per metilació, les podem seqüenciar i determinar l’estatus de metilació de les citosines Per tant, després del tractament amb bisulfit seqüenciarem el producte i veurem què hi ha. Si hi havia una citosina, passarà a uracil i si està metilada, es mantindrà com a citosina. Per tant, les citosines que resten seran les que estaven metilades.
La diferència de pics de timina (que aparella amb uracil) i citosines, ens indicarà la proporció de citosines metilades en aquella posició. Però com que no podem diferenciar quina timina prové de citosina no metilada i quina era normal, no podem determinar quina proporció de citosines no metilades hi havia en el DNA.
Amb aquest sistema, però, no podem diferenciar les 5mC de les 5hmC. Perquè la 5mC i 5hmC són resistents al tractament desaminant de disulfit sòdic. Ara bé si fem un tractament previ a aquest, un tractament desoxidant llavors: - 5hmC à 5fC, a la que sí que li afecta el disulfit sòdic.
Per tant per detectar 5mC, 5hmC i citosines no metilades farem: - desoxidant + disulfit sòdic + seqüenciació (per diferenciar 5hmC i 5mC) Les timines que apareguin seran 5fC - disulfit sòdic + seqüenciació (per diferenciar mC i C) I compararem els resultats d’ambdues seqüenciacions dels dos tipus de tractaments.
2. Methylation Specific PCR, MSP (PCR específica de metilació) Podem utilitzar altres mètodes que no tenen tanta precisió com la seqüenciació.
Podem dissenyar encebadors específics per metilació i no metilació: es a dir, tindrem dos encebadors per la mateixa regió que tinguin el nucleòtid 5mC i amb 5C. I llavors farem un tractament del gDNA amb disulfit sòdic i una PCR: - si no hi ha metilació, el producte amplificar per PCR, a totes les citosines hi haurà uracil - si hi ha metilació, tindrem citosines.
Per tant, en aquest cas, l’estabilitat de l'encebador dependrà de si el DNA està metilat o no.
14 DGM- Tema 6 mfiguls Per exemple, en una mostra d’un pacient de tumor pulmonar, al encebador dissenyat per absència de metilació hi ha amplificació (DNA no està metilat) i en l’encebador dissenyat per presència de metilació no.
3. Combined bisulfite restriction analysis (COBRA) S’utilitzen tractament amb disulfit + PCR + enzims de restricció.
Tractem el gDNA amb bisulfit, fem un PCR i després el tallem amb enzims de restricció. Si les citosines estan metilades, al tractar-les amb disulfit no es modifiquen i el producte de PCR no canvia, però si que ho fa si hi havia C no metilades.
Per tant, al tractar el DNA amplificat amb enzims: - si el DNA estava metilat à la diana es manté i talla à Ens apareixeran els productes de la digestió (dues bandes) - si el DNA no està metilat à les citosines passen a T i la diana no es manté (l’enzim no tallarà) à Ens apareixerà la banda corresponent al producte amplificat (només una banda) Si el percentatge de metilació varia ens apareixeran 2, 3, 4 bandes... per determinar el percentatge de metilació, comparem la intensitat de senyal de les bandes corresponents al DNA de les bandes digerides respecte al DNA amplificat per cadascun dels carrils.
𝐅𝐫𝐚𝐠𝐦𝐞𝐧𝐭𝐬 𝐝𝐢𝐠𝐞𝐫𝐢𝐭𝐬 % 𝐝𝐞 𝐦𝐞𝐭𝐢𝐥𝐚𝐜𝐢ó = 𝐅𝐫𝐚𝐠𝐦𝐞𝐧𝐭𝐬 𝐧𝐨 𝐝𝐢𝐠𝐞𝐫𝐢𝐭𝐬 ∗ 𝐅𝐫𝐚𝐠𝐦𝐞𝐧𝐭𝐬 𝐝𝐢𝐠𝐞𝐫𝐢𝐭𝐬 CRIBRATGE (SCREENING) DE MUTACIONS Recerca de noves mutacions: Per PCR podem detectar la presència de MUTACIONS en regions específiques d’un gen determinat. Això s’utilitza molt en oncologia.
Hi ha moltes tècniques per veure si hi ha mutacions en una seqüencia. Bàsicament parlarem del recorregut electroforètic diferencial: - Algunes d’elles estan basades en el Recorregut electroforètic diferencial o En aquests casos, s’utilitzen gels de poliacrilamida, perquè tenen elevada capacitat de diferenciació o Hi ha tres tipus:´ § Anàlisi d’heterodúplex § Polimorfismes de conformació de cadena senzilla § Electroforesi en gel de gradient desnaturalitzant El canvi de recorregut electroforètic es pot donar per diferències en mida o mutacions puntuals (no canvia mida sinó mobilitat).
1. Anàlisi d’heterodúplex Es tracta de diferenciar si els productes aparellen perfectament o no.
La mobilitat de les molècules de dobles cadena de DNA depèn de: • La grandària del fragment 15 DGM- Tema 6 • mfiguls el grau d’aparellament dels heterodúplexà els mal aparellats corren menys Així podem detectar mutacions en les seqüències de DNA • Es treballa amb fragments de 50 pb.
• El gel que utilitzem és no desnaturalitzant (acrilamida) • L’eficàcia del gel es del 90%.
Imaginem un individu heterozigot per un gen: 1. Quan fem la PCR tindrem dos amplicons (un per cada al·lel), 2. Un vegada l’hem fet, desnaturalitzem el DNA amplificat 3. Renaturalitzem (es formaran estructures homodúplex –aparellament perfecteo heterodúplex – aparellament no perfecte).
4. Quan fem el gel desnaturalitzant veurem aquestes diferències en l’aparellament com a diferents bandes: a. Homozigot: una banda b. Heterozigot: dues o més bandes (una que ha corregut menys, corresponent a l’heterodúplex) Si volem augmentar l’eficàcia podem fer un tècniques més sensibles, com la cromatografia liquida desnaturalitzant (dHPLC), així podem detectar amb més precisió les mutacions.
2. Polimorfismes de conformació de cadena senzilla (SSCP) Una altra variant que s’utilitza són les variants en la conformació que adopten les cadenes senzilles de DNA. Les cadenes simples sempre corren més lentes que les dobles.
La mobilitat de les cadenes senzilles depèn de: - la seva grandària - com s’ha replegat sobre si mateixa la cadena Qualsevol canvi en la seqüència de la cadena pot canviar la configuració i, per tant, el seu recorregut electroforètic.
La configuració de la cadena i el seu recorregut electroforètic depenen de múltiples factors com la temperatura i el buffer (cal analitzar 3-5 condicions diferents) Els passos són: 1. PCR 2. Desnaturalització 3. Refredem ràpidament, així doncs, es renaturalitza bruscament, llavors, les cadenes senzilles es replegaran diferent segons la seqüencia que tinguin 4. Fem un Gel d’acrilamida no desnaturalitzant, ja que ens interessa estudiar l’estructura que adopten les cadenes senzilles a. Homozigot normal: dues bandes b. Heterozigot (amb la mutació): les dues bandes del normal i dues bandes més (que corresponen a les dues cadenes de la variant al·lèlica on s’ha produït la mutació) c.
Però per molt ràpid que renaturalitzem, sempre es formaran dobles cadenes. Llavors veurem bandes sota el gel que correspondran als heterodúplex (han corregut més).
SSCP/HA: Analitzant tant els heterodúplex com les cadenes senzilles en un sol anàlisi, s’augmenta la capacitat de detecció de mutacions.
16 DGM- Tema 6 mfiguls Un cop detectem una mutació mitjançant aquests dos anàlisi, seqüenciarem.
3. Electroforesi en gel de gradient desnaturalitzant (DGGE) - Permet analitzar fragments més grans: 1-1’5 kb Té una major resolució Basada en que la desnaturalització del DNA és fa per blocs, no es una desnaturalització brusca i en un moment determinat, sinó que es va desnaturalitzant la molècula de DNA per fases, augmentant la severitat.
- Els primers blocs que desnaturalitzen son els rics en AT - Els últims blocs que desnaturalitzen son els rics en GC Els passos són: 1- PCR 2- Desnaturalització 3- Renaturalització 4- Gel d’acrilamida amb un gradient desnaturalitzant.
Imaginem una molècula que ha patit una mutació: un al·lel és AT i l’altre és CG. El bloc amb GC és més estable, de manera que si les dues molècules avancen pel gel, arriba un punt en que el bloc AT és més inestable que el GC, de manera que desnaturalitzarà i la seva mobilitat es veurà reduïda (avançarà més lentament perquè ara està en cadena simple) mentre que el bloc GC seguirà avançant ràpid, fins que arribi el punt que es desnaturalitzarà.
Per tant, obtindrem dues bandes perfectament distingibles.
Imaginem una molècula amb ATG. Si muta a AGG, avançarà més.
- A més, també podem distingir l’homozigot per una variant i per l’altra i l’heterozigot. A més de les dues bandes que distingeixen l’heterozigot, apareixen dues bandes corresponents als heterodúplex.
Si fem córrer el gel 2, 3 o 4 h, les distàncies entre les bandes i la seva posició variaran (seran més avall com més estona estigui funcionant el gel).
o Però si fem un CDGE (electroforesi en gel desnaturalitzant constant), en aquest, les distàncies incrementaran però seran proporcionals.
DGGE + CDGE El gradient desnaturalitzant pot ser transversal (incrementem grau de desnaturalització d’esquerra a dreta).
Els gradients desnaturalitzant estaran en dues dimensions, i tindrem un front que avança.
- Les molècules que avançaran més ràpid seran les doble cadena - Les molècules que avançaran més lent seran les cadena simple - Les molècules que estaran al centre seran punts intermedis.
Així obtenim com una corba.
- Si la mutació és TAàGC, el front que obtindrem avançarà més ràpid que el del individu amb els al·lels normals (corba es desplaça cap a baix) Si la mutació és GC à TA, el front que obtindrem avançarà més lent que el del individu amb els al·lels normals (corba es desplaça cap a dalt) Per comprovar que realment hi ha la mutació però, sempre seqüenciarem. Però nomes caldrà seqüenciar els fragments on sospitem que hi ha la mutació.
17 ...