TEMA 5. TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Complutense de Madrid (UCM)
Grado Farmacia - 4º curso
Asignatura Micriobiología clínica
Año del apunte 2017
Páginas 7
Fecha de subida 19/06/2017
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Apuntes de Microbiología clínica curso 2016/2017. Profesor: Rafael Rotger Anglada. Grupo A.

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TEMA 5. TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN Encontramos las técnicas rápidas de identificación. La tendencia es identificar lo más rápidamente posible por lo que existen una serie de técnicas que, en pocas horas, identifican al microorganismo en la muestra. Hoy en día están proliferando técnicas que ni siquiera hay que realizarlas en el laboratorio, sino que se realizan in situ en la cabecera del paciente (Point of care tests). De esta manera se ahorra mucho tiempo y mucho dinero en medicamentos.
Dentro de estos métodos rápidos, los más antiguos son métodos inmunológicos que identifican los antígenos microbianos en la muestra. Una limitación de estas técnicas es que no valen para todo, es decir, hay que sospechar cuál puede ser el microorganismo para saber qué anticuerpo utilizar. Estas técnicas a veces no se emplean como técnica rápida sino al final, como técnica de identificación.
Suelen emplear anticuerpos monoclonales que son más específicos que los policlonales debido a que presentan la misma región de reconocimiento y todos reconocen el mismo epítopo. Esto también mejora la sensibilidad.
La opción más moderna es la de los métodos moleculares. Con estos métodos se detectan ácidos nucleicos o secuencias génicas (DNA o RNA).
DETECCIÓN DE GENES ESPECÍFICOS POR HIBRIDACIÓN Podemos fijar el DNA de la muestra sobre un soporte y, después, desnaturalizado, buscar una secuencia. Para identificarlo necesitamos un fragmento de DNA complementario al que buscamos.
De esta forma, la secuencia complementaria hibridará y encontraremos la secuencia que buscamos.
Esta técnica no se suele usar hoy en día porque es poco sensible. No se suele encontrar suficiente DNA o RNA bacteriano. Lo que sí se utiliza es la técnica de PCR ya que, aunque tengamos una muestra muy pequeña, podemos amplificarlo para después hacer, por ejemplo, la hibridación e identificarlo.
La reacción de PCR nos proporciona la sensibilidad de la técnica y la hibridación la especificidad.
Podemos tener el doble de especificidad porque tenemos, primero, la especificidad que nos da la unión a los primers y después, una vez que los hemos amplificado, la última reacción que detecta ese gran número de copias, nos indica si hemos amplificado la región que queríamos identificar.
Estas técnicas pueden estar automatizadas. La muestra se coloca en el aparato y este realiza todas las técnicas mencionadas.
PCR en tiempo real Esta técnica es muy rápida y nos da una idea también cuantitativa. Va detectando la amplificación a medida que se producen las copias, es decir, no espera a que se produzcan todas las copias.
Otra técnica que se está imponiendo dentro de la PCR es la PCR digital. En este caso, se diluye el ácido nucleico presente en la muestra en una placa de pocillos. El objetivo es que en cada pocillo caiga una molécula de DNA o ninguna. Después se realiza la reacción de PCR en estos pocillos. Los resultados serán 1 o 0. Cuando se hace un matriz de unos y ceros, se puede calcular estadísticamente, de manera 1 muy precisa, el número de copias que había inicialmente en la muestra. Esta técnica está muy automatizada.
Genes útiles para identificación por PCR - Secuencias de inserción (IS): son elementos que se insertan en los cromosomas. Hay bacterias con algunas secuencias muy características y repetidas. Esto aumenta la sensibilidad.
- Genes de RNA ribosómico (16S-23S): si se secuencian permiten identificar cualquier bacteria. La mayoría de las bacterias tienen también varias copias de estos genes para producir gran cantidad de ribosomas. Es muy indicativo de la especie o género bacteriano (utilidad taxonómica). Se puede hacer una variación de PCR utilizando este RNA ribosómico y en vez de identificar directamente la bacteria podemos amplificar todo el RNA ribosómico, de forma que se amplifique de cualquier bacteria buscando un fragmento que exista en todas las bacterias. De esta manera podemos identificar cualquier bacteria, hasta las desconocidas. Eliminamos el problema de saber qué bacteria estamos buscado, podemos identificarla amplificando el RNA ribosómico sin saber cuál era en un principio.
La tendencia es la detección simultánea de múltiples patógenos. Se venden kits que tienen sondas y cebadores para identificar diferentes bacterias en una misma reacción.
SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO: MÉTODOS “CLÁSICOS” Es otro método de identificación y consiste en, a partir de la muestra, sembrar en un medio de cultivo adecuado y después de incubar, obtener bacterias aisladas. El aislamiento es imprescindible para su identificación. En algunas muestras puede ser aconsejable hacer un paso intermedio que es un enriquecimiento de la muestra. Solo se hace en algunas muestras en las que el número de microorganismos es bajo, es decir, insuficiente para detectarlo. Esto suele ocurrir cuando la muestra es de sangre.
Para aumentar el número de bacterias se suele hacer un cultivo intermedio en un medio liquido enriquecedor. A veces estos medios de enriquecimiento pueden ser selectivos, es decir, favorecen el crecimiento de algunos géneros o especies determinadas. Dependiendo de los casos, se utilizarán los medios de enriquecimiento normales o selectivos.
2 Una vez que ha pasado la fase de enriquecimiento, que puede tener una duración variable según la muestra, pasamos al aislamiento en placa para obtener las colonias aisladas. El medio de enriquecimiento muchas veces posibilita emplear técnicas rápidas sin tener que hacer el aislamiento en placa.
Medios de cultivo para muestras clínicas Los medios generales para cultivo suelen tener un medio base compuesto por infusión de cerebrocorazón (BHI) o triptona-soja (TSI). Son mezclas con gran cantidad de proteínas y azúcares.
En las muestras clínicas se suele utilizar agar sangre. El motivo de añadir la sangre es que algunos patógenos crecen mejor en presencia del suero o los glóbulos rojos, puede favorecer su crecimiento y eliminar algunas sustancias tóxicas. En algunos casos se ha visto qué componente de la sangre es el que hace crecer las bacterias y no se utiliza sangre sino solo ese componente.
El agar sangre nos permite detectar reacciones de hemólisis. Esta reacción es útil para identificar la bacteria. Por tanto, el agar sangre es un medio diferencial.
El agar chocolate es agar sangre calentado a unos 50ºC. Este agar es necesario para algunas bacterias que necesitan componentes contenidos en los glóbulos rojos. La temperatura lisa los glóbulos rojos, liberan el contenido y hacen que este medio sea adecuado para algunas bacterias.
El agar sangre para anaerobios incluye algunas vitaminas como la K y una dosis extra de hemina que son necesarias para cultivar algunas bacterias anaerobias estrictas. Este agar también recibe el nombre de Schaedler.
La mayoría de las muestras se siembran en estos tres medios ya que permiten identificar a la mayoría de las bacterias.
Si buscamos algo más concreto podemos utilizar medios selectivos. Una forma de eliminar el crecimiento de parte de los microorganismos es añadir antibióticos o antifúngicos. Esto es imprescindible si queremos tratar muestras muy contaminadas porque vienen en tejidos con microbiota normal. Debemos emplear antibióticos a los cuales sepamos que la bacteria que buscamos es resistente.
Hay más tipos de medios selectivos que lo que tienen son diferentes composiciones que favorecen el crecimiento de unos microorganismos u otros. Además de selectivos, los medios pueden ser diferenciales. Estos medios nos permiten identificar algunos tipos bacterianos por las reacciones que den en el medio.
3 Cultivo de bacterias Una vez que sembramos las placas hay que llevarlas a incubar a unos 36ºC. Para algunas, la temperatura ideal es de 22ºC y otras necesitan temperaturas más altas, hasta 42ºC. La temperatura también ejerce un papel selectivo.
La atmósfera puede ser aerobia o anaerobia. Si las bacterias son anaerobias empleamos sistemas de incubación anaerobia como las jarras de anaerobiosis donde se emplea un generador químico de gas que elimina el oxígeno creando una atmosfera anaerobia.
Algunas bacterias, como las microaerófilas necesitan poco oxígeno por lo que la combinación de gases debe adecuarse a ellas. Existen sobres de gas para bacterias determinadas. Para las microaerófilas existe una solución sencilla que consiste en meter una vela en un recipiente hermético encima de las placas. La vela consume parte del oxígeno y genera algo de CO2. Cuando se apaga la vela, hay entre el 5 y el 10% de CO2 en la jarra.
Proceso y cultivo automático Existen robots que lo hacen todo automático. Siembran, incuban, leen y dan resultados.
Identificación de colonias aisladas Las colonias se identifican mediante tinciones, Gram o específicas. A veces se hacen reacciones específicas rápidas como la catalasa, la prueba de la oxidasa, fermentación/oxidación de azúcares, utilización de sustratos, detección de actividades enzimáticas, etc.
Hoy en día se hacen en dispositivos con pocillos que contienen el medio de cultivo, el sustrato y los reactivos, donde se pueden hacer todas estas pruebas bioquímicas y se leen los resultados en autoanalizadores.
Los resultados negativos y positivos se utilizan para identificar las especies microbianas. Se utilizan claves dicotómicas para identificar a los microorganismos según los resultados de las pruebas bioquímicas.
4 TÉCNICAS MOLECULARES Estas se emplean sobre todo cuando la bacteria es difícil de identificar por métodos bioquímicos. Esta técnica permite identificarlas por sus antígenos. Por otro lado, podemos realizar la amplificación de ácidos nucleicos por PCR y la hibridación múltiple. En este caso, como tenemos gran cantidad de muestra de ácido nucleico, se puede realizar la hibridación múltiple directamente.
Esta hibridación múltiple o microarrays utiliza portaobjetos que tienen en la superficie una serie de puntos y cada uno es una sonda genética para detectar distintas bacterias y virus. Si esta lámina se pone en contacto con una suspensión del cultivo que hemos realizado podemos buscar cuál es la bacteria o virus presente. Se hace la reacción de hibridación y por técnicas de fluorescencia se leen los positivos que salen en la lámina.
También se puede utilizar la espectrometría de masas (MALDI-TOF) para identificar péptidos de muestras. Permite analizar proteínas presentes en la muestra, generalmente, las proteínas del ribosoma que son las más abundantes. Cogemos una colonia de la placa que se mezcla con una matriz y se coloca en una placa con el resto de muestras. La placa con todas las muestras se analiza utilizando un sistema de laser que provoca la separación de los péptidos de la muestra. Se hace, o bien sobre las colonias, o bien, sobre las muestras que tengan muchas bacterias, ya que la muestra es poco sensible y solo se utiliza si la muestra tiene muchas bacterias o si está enriquecida. No funciona bien con mezclas, tienen que ser cultivos medios.
Una vez preparada la placa de MALDI, se produce la ionización y desorción por láser y los péptidos salen volando a través de un tubo en función de la carga que hayan adquirido al ser ionizadas. Una vez que llegan al final, el detector detecta los impactos y en función del tiempo que hayan tardado en llegar se realiza un perfil de masa/tiempo de vuelo. De esta manera, podemos comparar los perfiles MALDI-TOF con los que hay en las bases de datos de perfiles peptídicos. Esta técnica no sirve para virus ya que presentan pocas proteínas para dar perfiles interesantes que se puedan identificar. Esta técnica ahorra mucho tiempo.
5 TIPIFICACIÓN (TIPADO O TIPAJE) DE MICROORGANISMOS La tipificación consiste en diferenciar cepas dentro de la especie. Se suele hacer con fines epidemiológicos para saber qué transmisión hay, ya que llegar a especie no es suficiente.
Hay muchas técnicas, pero la que más se utiliza es la de serotipado. El serotipado consiste en técnicas inmunológicas de detección de antígenos. Se utiliza la aglutinación con antisueros (Ac). La clasificación mediante el serotipado se realiza en serotipos o serovares. Dentro de los esquemas de tipado a veces se habla también de serogrupo, que agrupa varios serotipos con antígenos comunes.
El serotipado se utiliza mucho en bacterias Gram negativas y se basa en distintos tipos de antígenos que encontramos en estas. En algunas de ellas puede haber antígeno capsular que es un polisacárido que forma la cápsula. Estos antígenos se conocen como antígenos K.
Por otra parte, las bacterias también pueden tener flagelos y las proteínas de estos también son antigénicas. Por lo que podemos detectar el antígeno flagelar H.
En las Gram negativas existe una estructura llamada LPS o lipopolisacárido en la membrana externa.
Consta de dos partes, la parte más externa o lípido A que interacciona con los lípidos de membrana y la parte más interna o antígeno O (antígeno somático).
Dentro de las técnicas moleculares también hay sistemas para tipificar (métodos genéticos). Hoy en día uno de los más utilizados es el MLST que se basa en secuenciar fragmentos cortos que se encuentran en distintos loci o regiones del cromosoma. Estos fragmentos se definen por convenio.
Es decir, para una bacteria determinada se definen los loci que se van a secuenciar. Secuenciar 7 loci suele ser suficiente para identificar una bacteria.
Una vez secuenciados, se comparan los distintos alelos de las diferentes bacterias que queremos analizar y vemos las diferencias puntuales en esas regiones. Se le da un número a cada alelo de forma arbitraria.
6 De esta manera podemos clasificar las bacterias por complejos clonales o MLST que son la combinación de los números que corresponden a cada uno de los alelos. La ventaja de esto es que es muy reproducible ya que la secuenciación no comete errores.
Hay otras tendencias no muy instauradas, por ejemplo, la secuenciación de alto rendimiento o secuenciación masiva, pero lleva mucho trabajo. Esto se realiza con algunas bacterias complicadas. La secuenciación nos permite comparar los genomas y ver los cambios que se han producido y las que se mantienen al compararlo con el genoma de otras bacterias.
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