Tema 12 Modificaciones post-traduccionales (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Ciencias Biomédicas - 2º curso
Asignatura Proteómica
Año del apunte 2015
Páginas 29
Fecha de subida 08/04/2016
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2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV INGENIERÍA DE PROTEÍNAS Y PROTEÓMICA TEMA 12 Modificaciones post-traduccionales Introducción y estrategias proteómicas generales para la identificación de PTMs Las proteínas pueden sufrir muchas y diversas modificaciones después de acabar el proceso de traducción. De hecho, se han descrito más de 200 de ellas.
En el siguiente esquema están representadas las modificaciones más comunes y relevantes: fosforilación, acetilación (que está ganando mucha importancia últimamente), ubiquitinación, glicación y ancorajes de membrana, como GPI (que permiten unir proteínas a la membrana plasmática).
Son modificaciones muy diferentes que condicionan de manera muy diferente la función de la proteína.
Por ejemplo, proteólisis parciales de la proteína muy a menudo implican la activación de la proteína, y suelen ser modificaciones post-traduccionales las que actúan como señal para que las proteínas sean parcialmente proteolizadas. Estas modificaciones que señalan la proteína a proteolizar también pueden desencadenar una proteólisis total, es decir, la degradación de la proteína.
1 Modificaciones post-traduccionales Además, una misma proteína puede padecer diversas modificaciones a la vez y, en función de la combinación de éstas, la proteína puede responder de una manera o de otra. En la siguiente tabla se pueden ver ejemplos de modificaciones concretas y el efecto de éstas sobre las proteínas que las sufren: En muchas ocasiones, cuando hablamos de modificaciones post-traduccionales, hablamos de la existencia de una molécula donadora, que es la que aporta lo necesario para modificar a otra molécula.
Por ejemplo, en el caso de la acetilación, la molécula donadora es el AcetilCoA, que aporta el grupo acetil. En otros casos, es la molécula donadora en sí misma la propia modificación, como es el caso del glutatión (la modificación consiste en la adición de la molécula de glutatión entera).
Identificación de modificaciones post-traduccionales Se trata de uno de los grandes retos de la proteómica. Hay muchas modificaciones posibles a estudiar (se han identificado muchas). Otra dificultad del estudio de las modificaciones radica en que no todas las moléculas de una proteína en una situación fisiológica determinada se encuentran modificadas: normalmente, la modificación afecta a una pequeña fracción. Por tanto, para estudiar las modificaciones post-traduccionales hay que conseguir obtener unas condiciones en las que tengamos la mayor proporción posible de proteína modificada (aunque este % nunca será el 100%).
Por otro lado, también tenemos problemas con la estabilidad de las modificaciones, ya que durante el proceso de estudio de modificaciones, éstas pueden cambiar o perderse.
Por tanto, si ya es de por sí complejo identificar una proteína de una mezcla de proteínas, aún es más complejo identificar una modificación post-traduccional. Es por esto por lo que se debe intentar enriquecer la proporción de proteína modificada para perder complejidad. Muchas veces, estos estudios comienzan con la proteína pura.
Además, cuando identificamos proteínas por espectrometrías de masas rara vez obtenemos un coverage del 100%, que sería necesario para identificar el 100% de las modificaciones posttraduccionales. Las modificaciones pueden encontrarse en cualquier aminoácido de la proteína, por lo que para tenerlas todas localizadas sería necesario identificar la totalidad de la proteína.
- Estrategias de detección basadas en electroforesis bidimensional Es común hacer una tinción que permita identificar una determinada modificación post-traduccional.
Como vemos en la siguiente gráfica, aparecen spots allá donde esté la modificación. La electroforesis bidimensional se utiliza para comparar las modificaciones de las proteínas en dos condiciones.
2 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La dificultad radica en que solo se pueden detectar las modificaciones de las proteínas más abundantes (en las proteínas poco abundantes cuesta mucho identificar las modificaciones). Además, también es complicado identificar qué proteína corresponde a cada modificación .
-Estrategias libres de gel Otra estrategia es identificar una modificación concreta en los péptidos resultantes de la proteólisis de la proteína. Tenemos una mezcla de péptidos, algunos de los cuales tienen modificación. Para reducir la complejidad de la muestra enriquecemos la cantidad de muestra que incluye la modificación post-traduccional mediante una columna de afinidad. A través de una columna podemos purificar aquellos péptidos que estén modificados y, una vez purificados, enviarlos a la detección por masas/masas (MS/MS).
Las estrategias libres de gel nos permitan identificar las modificaciones de proteínas que son poco abundantes, además de proporcionar una identificación más fiable e información sobre los residuos modificados.
El problema es que se trata de una estrategia menos cuantitativa.
Los espectrómetros de masas/masas nos permiten ver si el péptido tiene la modificación o no. Hay dos modos de operación en MS/MS en identificación de modificaciones post-traduccionales: - Precursor Ion Scanning Tenemos un analizador de masas, una cámara de colisión en la que se fragmentan los péptidos y un segundo analizador de masas. Sabemos que cuando se fragmenta el péptido obtenemos una relación masa/carga determinada, que es característica de la modificación post-traduccional. Se fija 3 Modificaciones post-traduccionales esta relación masa/carga en el segundo analizador. Así, cada vez que se detecta esta relación masa/carga el aparato intenta identificar cuáles son los iones precursores que han dado la señal.
-Neutral loss Es probable que, al fragmentar el péptido con la modificación post-traduccional, ésta se pierda o no coja carga (por lo que no será detectable). En caso de que esto ocurra, la estrategia es establecer unas condiciones de fragmentación que hagan que se pierda la modificación post-traduccional. Se indica que el segundo analizador de masas busque aquellos precursores que, tras haberse fragmentado, han perdido una masa concreta que se corresponde con la masa de la modificación.
Si combinamos estas dos estrategias con el enriquecimiento de la modificación, podemos identificar péptidos e incluso llegar a identificar el aminoácido que sufre la modificación.
Modificación para moléculas singulares Fosforilación La fosforilación consiste en la adición de un grupo fosfato a la proteína. La molécula donadora es el ATP y se trata de un proceso reversible catalizado por las enzimas kinasas, muchas de ellas específicas para cada proteína concreta.
Se considera que hasta un 30% de las proteínas del organismo son susceptibles de ser fosforiladas y que los residuos fosforilables son serina, treonina y tirosina. Los aminoácidos que más se encuentran fosforilados son las serinas (después las treoninas y por tirosinas).
4 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV La fosforilación es muy importante desde el punto de vista de la regulación de la actividad enzimática y de la señalización celular.
Estudio de la fosforilación de proteínas Las kinasas están muy bien descritas y se ha conseguido incluso desarrollar anticuerpos contra la proteína fosforilada en un residuo concreto.
En el siguiente ejemplo vemos cómo se ha llevado a cabo el estudio de cómo se fosforilan determinadas proteínas ante estímulos concretos. Vemos que determinados estímulos provocan an mayor o menor grado la fosforilación de una serina y una treonina.
Para estudiar la fosforilación de proteínas puede llevarse a cabo un Western Blot, basándonos en que algunas proteínas corren menos cuando se encuentran fosforiladas que cuando no lo están. Cuando se encuentran fosforiladas retrasan su movimiento, dando lugar a una banda adicional (que se interpreta como la proteína fosforilada). Este retraso en el movimiento es probablemente causado por una menor unión de SDS cuando la proteína se encuentra fosforilada.
*Análisis más global de la fosforilación - fosfoproteómica Pueden marcarse las proteínas con fósforo radioactivo antes de hacerlas correr en gel. Normalmente, esto solo funciona bien en estudios in vitro, por ejemplo, si se quiere comprobar a qué proteínas fosforila una determinada kinasa. Es estudios in vitro no acostumbra a utilizarse este sistema ya que implica que las células incorporan una gran cantidad de fósforo radioactivo, lo que es muy difícil de conseguir. Además, implica hacer crecer a las células en presencia de radioactividad.
5 Modificaciones post-traduccionales Otra opción son los anticuerpos fosfo-globales Se trata de anticuerpos que, en teoría, reconocen cualquier proteína fosforilada y que pueden comprarse. En principio son específicos del tipo de aminoácido fosforilado: fosfo-tirosina, fosfoserina o fosfo-treonina.
Los anticuerpos contra fosfo-tirosinas funcionan más o menos bien pero no los de anticuerpos anti fosfoserinas o fosfo-treoninas.
Por ejemplo, para ver cómo cambia el patrón de fosforilación en tirosinas ante una condición concreta se lleva a cabo un Western Blot con anti-fosfotirosinas. Cada spot representa una tirosina fosforilada.
Como estrategias más Bottom-up tenemos las aproximaciones Shot-gun.
Por ejemplo, la inmunoprecipitación con anticuerpos anti-fosfotirosina. Para ello se usan columnas de afinidad, que podemos encontrar de dos tipos: IMAC y titanium oxide.
- IMAC: se usan columnas de afinidad a metal con hierro, que a pH bastante ácido tiene bastante afinidad por los fosfopéptidos.
- Columnas con óxido de titanio (titanium oxide): el óxido de titanio también tiene bastante afinidad por los fosfatos.
En el ejemplo del la imagen vemos una doble purificación, primero con una columna de anticuerpos y después con IMAC. Así se consiguen purificar las proteínas fosforiladas.
6 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Para las fosforilaciones es bastante típico emplear la estrategias de neutral loss para confirmar que un péptido está realmente fosforilado. Durante la ionización de la espectrometría de masas los péptidos adquieren carga positiva por lo que no se pueden detectar. Por tanto, se detecta si se pierde la modificación.
Acetilación Se trata de una modificación que ocurre mayoritariamente en residuos de lisina y que consiste en la adición de un grupo acetil. La forma más común de acetilación es la catalizada por las enzimas llamadas acetil-transferasas y el grupo acetil procede normalmente del AcetilCoA (molécula donadora).
Además, el proceso se puede revertir gracias a las deacetilasas que utilizan como sustrato el NAD, que es convertido en nicotinamida por un lado (que se separa del nucléotido) y acetil ADP-ribosa por el otro.
En la siguiente tabla vemos reflejada la "popularidad" de la acetilación y de la fosforilación, que se miden en función de las citaciones por año en PubMed. La popularidad equivale a la relevancia que da a la modificación la comunidad científica. Como podemos comprobar en el gráfico, se comenzó a hablar más tarde de la acetilación, pero ésta ha ido ganando importante a raíz del descubrimiento de procesos en los que está implicada.
7 Modificaciones post-traduccionales La acetilación se ha podido relacionar con procesos metabólicos de la célula, ya que se sabe que actúa como un sensor del aspecto metabólico de la célula.
La acetilación está regulada en gran medida por los niveles de AcetilCoA en la célula. Cuando aumentan los niveles de AcetilCoA aumenta el grado de acetilación de las proteínas.
El AcetilCoA se genera tanto en la vía de la glicólisis como en la vía de la β-oxidación de ácidos grasos, por lo que, cuando estas dos vías metabólicas se encuentran activas se ve reflejado en el grado de acetilación, sobre todo en la mitocondria.
Además, el estado nutricional también afecta a los niveles de NAD, la molécula aceptora de los grupos acetil en la deacetilación.
De todo esto podemos concluir que:  Elevados niveles de nutrientes favorecen la acetilación de proteínas.
 Niveles disminuidos de nutrientes favorecerán la deacetilación de proteínas.
Las primeras proteínas en las que se descubrió la acetilación fueron las HISTONAS que, como ya sabemos intervienen en el proceso de regulación del empaquetamiento de la cromatina.
Cuando las histonas se encuentran acetiladas, la cromatina está más laxa, lo que permite que acceda a ella la maquinaria de transcripción. Por lo que indirectamente, la acetilación de histonas implica indirectamente transcripción. Este proceso entra dentro de lo que se conoce como regulación epigenética y encontramos patrones alterados en muchas situaciones patológicas.
Como las primeras muestras de esta modificación post-traduccional fueron descubiertas con las histonas, las enzimas que la catalizan también son conocidas con histonas acetiltransferasas. Ocurre lo mismo en el caso de la deacetilación - histonas deacetelasas.
8 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Además de a las histonas, la acetilación afecta a otras proteínas. A nivel de la mitocondria se ha visto mucha acetilación, que se ha relacionado, como ya hemos explicado con el estado metabólico. En el siguiente estudio podemos ver reflejados los niveles de acetilación a nivel mitocondrial. Observaron que existe una deacetilasa en la mitocondria que aumenta su expresión en situación de falta de alimento.
Gracias a anticuerpos que reconocían residuos de lisinas acetiladas realizaron un Western Blot en el que comprobaron la desaparición de ciertas bandas en las ratas en ayuno (que si estaban presentes en las ratas alimentadas) y que se correspondían con histonas acetiladas. Por el contrario, en las ratas alimentadas no se daban bandas que se correspondían con las histonas deacetiladas que sí estaban en las ratas en ayuno.
Las proteínas que intervienen en el metabolismo de ácidos grasos varían su actividad cuando se encuentran acetiladas. Esto constituye un mecanismo de adaptación a situaciones metabólicas cambiantes.
Un punto de interés de la acetilación es que, dado que se trata de una modificación implicada en muchos procesos, se pueden desarrollar inhibidores de las enzimas implicadas que pueden ser fármacos interesantes para determinados patologías.
Por ejemplo, se ha observado que los niveles de acetilación están implicados en algunos cánceres.
Inhibiendo las deacetilasas de histonas, podemos provocar que la cromatina se encuentre más relajada y, por tanto, unos niveles de transcripción mayores.
En el siguiente esquema vemos los diferentes procesos en los que la acetilación está implicada y en los que una desregulación causa patología. Para estos casos se estudian inhibidores de las deacetilasas de histonas como fármacos con potencial interés terapéutico.
9 Modificaciones post-traduccionales La aspirina, fármaco que proviene del ácido acetilsalicílico, provoca acetilación no catalizada de proteínas ya que puede actuar como molécula donadora: en concreto transfiere el grupo acetil a una serina de una prostaglandina.
Detección de proteínas acetiladas: estrategias Bottom-up La acetilación de proteínas es un ejemplo en el que se puede aplicar Precursor Ion Scanning.
Normalmente, para poder detectar una modificación se necesita cierto trabajo previo con la proteína pura para ver cuáles son los iones reporteros. Es decir, hay que empezar con la parte más simple.
En el siguiente estudio han estudiado qué fragmentos aparecen con lisina acetilada y han encontrado un ion marcador con una relación masa/carga concreta.
Un ion immonium de una lisina pesa X Daltons (101 Da) pero cuando esta lisina está acetilada su peso aumenta (a 143 Da). Si el segundo analizador de masas detecta esta relación masa/carga, ya sabemos que hay una lisina acetilada. Teóricamente esto debería funcionar pero durante el experimento, esta relación masa/carga aparecía poco en los espectros; era más común 126 Da, que se corresponde con un ion immonium acetilado que ha perdido el grupo amino (NH3).
Una vez se conocen las relaciones masa/carga que nos deben interesar, ya se puede pasar a realizar trabajos más complejos.
Por tanto, en el segundo analizador nos tendremos que fijar solamente en unas relaciones masa/carga concretas, en este caso, las típicas de acetil-lisinas. Es decir, en un primer análisis se encuentra el ion característico que luego se aplica al programa real.
10 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Metilaciones Se trata de una modificación más compleja que la acetilación que, según se ha descrito, puede afectar a los aminoácidos lisina y arginina. La complejidad de la metilación radica en que, un mismo aminoácido puede sufrir más de una metilación (se le pueden añadir diversos grupos metilo).
Las reacciones de metilación son catalizadas por enzimas específicas de residuo, es decir, por una lisina- metilltransferasa o por una arginina-metiltransferasa.
La molécula donadora del grupo metil es una adenosilmetionina (adoMet).
Podemos encontrar hasta tres metilaciones en una misma lisina. Consecuentemente, el aminácido resultante será monometil- lisina, bimetil-lisina o trimetil-lisina.
En las argininas también se ha descrito que pueden sufrir más de una metilación, pero como tienen dos grupos amino, pueden darse dos situaciones: - Si la segunda metilación se produce en un grupo amino diferente del amino en el que se ha producido la primera metilación hablamos de dimetilArginina simétrica.
- Si las dos metilaciones se producen en el mismo amino, hablamos de dimetilArginina asimétrica.
De hecho, las enzimas que catalizan la formación de la forma simétrica y de la asimétrica no son la misma enzima.
La metilación no es una modificación tan estudiada como la acetilación. Aún así se han descrito metilaciones en diversos organismos.
11 Modificaciones post-traduccionales Funciones afectadas por la metilación: - Remodelación de la cromatina - metilación de histonas - Interacciones proteicas - Localización subcelular - Afinidad al sustrato En la siguiente tabla se muestran ejemplos de proteínas cuya interacción con algún componente se ve afectada por la metilación.
Adenilaciones Se trata de una modificación cuya existencia está muy comprobada en organismos procariotas. Consiste en la adición del grupo adenilato y es catalizada por la enzima adenil-transferasa. Además, la propia enzima que lleva a cabo la adenilación es capaz de catalizar la reacción inversa, la deadenilación.
Esta modificación afecta a la función de las proteínas: por ejemplo, la enzima glutamina sintetasa deja de estar activa cuando se encuentra adenilada.
12 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Hidroxilación Consisten en la adición de un grupo hidroxilo (-OH). Se ha descrito que afectan sobre todo a residuos de prolina y lisinas.
El proceso es catalizado por la enzima prolil hidroxilasa en el caso de los residuos de prolina y por la lisil-hidroxilasa en el caso de las lisinas. La hidroxilación puede producirse en cualquier carbono.
En la imagen vemos la reacción completa que llevan a cabo estas enzimas, que requiere de oxoglutarato y de oxígeno (aportado por la molécula donadora).
Las hidroxilaciones tienen bastante interés ya que afectan al colágeno. Como sabemos, el colágeno es una molécula con una importante función estructural.
Está formada por fibras en cuya formación resultan fundamentales los residuos de hidroxilisina e hidroxiprolina que son muy abundantes en la molécula. Es decir, los aminoácidos lisina y prolina hidroxilados. Cabe recordar que la hidroxilación de estos residuos requiere de la presencia de ácido ascórbico, asociándose su déficit con el escorbuto.
La hidroxilación también tiene interés desde el punto de vista de la regulación de HIF, el factor inducible por hipoxia. Esta proteína se encarga de sensar los niveles de oxígeno; cuando los niveles de oxígeno son altos, HIF se expresa pero se degrada muy rápidamente. Cuando los niveles de oxígeno son bajos, la proteína HIF se estabilizan.
Es una hidroxilación de una prolina lo que regula la estabilidad de este factor. Cuando la prolina está hidroxilada, es reconocida por unos factores que degradan la proteína. Lógicamente, la hidroxilación, y por tanto la consiguiente degradación de HIF, solo se producen cuando hay oxígeno disponible. Si por el contrario no hay disponibilidad de oxígeno, el residuo no se encuentra hidroxilado y la proteína HIF se encuentra estable (desempeña su función como factor transcripcional).
13 Modificaciones post-traduccionales Modificaciones en extremo N y C terminal Estas modificaciones post-traduccionales pueden tener diversas funciones. En el siguiente esquema podemos ver las modificaciones que se pueden encontrar: Formación del ácido piroglutámico Esta modificación solo se puede producir cuando hay un ácido glutámico o una glutamina en el extremo N-terminal. La enzima encargada de catalizar esta reacción es la glutamil-ciclasa.
Esta modificación aumenta la estabilidad de la proteína, que se hace más resistente a las aminopeptidasas, las proteasas que degradan las proteínas comenzando por el extremo N-terminal.
Además, se ha visto que esta modificación es necesaria para el reconocimiento de muchos neuropéptidos por parte de su receptor.
Esta modificación también se relaciona con las placas amiloides ya que el péptido β amiloide la tiene, lo que lo hace más resistente a la degradación.
La introducción de la modificación es una cuestión a tener en cuenta en los neuropéptidos, ya que tiene una aplicación práctica y podría resultar interesante introducirla in vitro.
Proteólisis limitada: zimógenos o pro-enzimas Existen procesos de activación de la función que implican la proteólisis parcial de las proteínas. La ruptura proteólitica se produce en el proceso de maduración de la proteína y es llevada a cabo por las proteasas.
Ocurre por ejemplo durante la maduración de las proteasas digestivas.
La proteólisis parcial de la proteína puede provocar cambios en la proteína que por ejemplo, pueden hacer más accesible su centro activo.
14 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Esto es lo que ocurre en el caso de la proteólisis del quimiotripsinoide para dar lugar a quimiotripsina. En la imagen vemos como la proteólisis hace que cambie la posición de algunos aminoácidos concretos. En general, el plegamiento es muy similar entre las dos proteínas, pero se provocan pequeños cambios que favorecen la función de la proteína en cuestión. Por ejemplo, en el caso del quimitripsinógeno vemos que hay un brazo que dificulta la entrada al centro activo y que éste ya no se encuentra en la quimiotripsina.
Direccionalidad de las proteínas: péptidos señal Los péptidos señal son otro caso de proteólisis parcial. Como ya sabemos, hay muchas proteínas que son específicas de un orgánulo concreto. Se ha descrito que esta localización de las proteínas se debe a señales intrínsecas de la proteína que gobiernan su transporte. Estas señales son secuencias reconocidas por proteínas transportadoras que se encargan de transportar la proteína hasta el orgánulo que le corresponde. Muchas de estas secuencias son cortadas durante el proceso de importación.
En la siguiente tabla podemos ver ejemplos de péptidos señal: Por ejemplo, una hélice anfipática en el extremo N-terminal constituye una señal que indica que la proteína debe ser transportada a la mitocondria. Cuando esta hélice se sintetiza es reconocida por proteínas que transportan la proteína a la mitocondria. Una vez que se encuentra allí, la secuencia es cortada.
Para el retículo endoplasmático existen dos señales diferentes: una de retención en el retículo y otra para que las proteínas salgan (para ser modificadas).
15 Modificaciones post-traduccionales Glicosilación de proteínas: enzimática y no enzimática Esta modificación consiste en la adición de glicanos a la proteína. Podemos encontrarla a nivel de asparaginas (N-glicosilación) o a nivel de serinas y treoninas (O-glicosilación), en las que el glúcido se une a un hidroxilo.
Es una modificación complicada de estudiar ya que los glicanos que se añaden a la proteína están formados por distintos monosacáridos, que pueden ser muy diversos (se han descrito hasta 30 azúcares distintos unidos a proteínas).
Además, las estructuras los azúcares presentan estructuras muy diferentes y complejas, ya que éstos pueden tener ramificaciones.
Se considera que, en organismos eucariotas, la glicosilación puede llegar a afectar a un 50% de las proteínas.
Esta modificación puede tener funciones muy diversas: interacción, regulación, señal de secreción, … Es decir, las glicoproteínas se encuentran implicadas en muchos procesos.
A nivel de proteínas plasmáticas podemos encontrar muchas proteínas glicosiladas. La glicosilación de proteínas plasmáticas aumenta mucho la vida media de éstas, ya que limita su eliminación a nivel renal. En esto encontramos una aplicación ya que, podemos intentar mimetizar esta modificación para alargar la vida media de proteínas terapéuticas en el plasma.
La glicosilación también está implicada en procesos de adhesión celular. Por ejemplo, en el proceso de adhesión de linfocitos a las células endoteliales, en cuyo reconocimiento participan los glicanos de la superficie del endotelio.
La parte extracelular de las células tiene una gran cantidad de glicanos que forman parte de glicoproteínas y glicolípidos, presentando un papel importante en interacción entre células, entre otras cosas.
16 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV En la siguiente imagen podemos ver cómo se han detectado las glicoproteínas gracias a un fluoróforo conjugado con biotina. Como podemos comprobar, las proteínas glicadas abundan en la membrana plasmática.
Más recientemente se ha ido descubriendo que la glicosilación de proteínas tiene cierto papel en la regulación metabólica: Hay factores de transcripción que pueden ser modificados por N-acetilglicosamina, cambiando su actividad. Es la enzima OGT, (N-acetilglucosamina transferasa) la encargada de esta modificación, y la enzima OGA es la encargarla de revertirla. Además, que esta modifcación se produzca depende de los niveles de una molécula donadora cuya síntesis depende directamente del estado nutricional de la célula. Y es que para sintetizar esta molécula donadora hacen falta aminácidos, carbohidratos, acetilCoA, ATP y nucleótidos. Por tanto, cuando la célula se encuentra en un estado nutricional óptimo, se producirá la adición de N-acetilglicosamina (GlcNAcilación) a los factoras de transcripción.
17 Modificaciones post-traduccionales En la siguiente tabla se puede ver la descripción de proteínas afectadas por este tipo de modificación, que afecta a funciones celulares variadas. También se han relacionado alteraciones en la glicosidación de proteínas con ciertas patologías (como se muestra en la tabla).
Las glicoproteínas también tienen relevancia en procesos cancerígenos. Se han observado en diversos tumores alteraciones en glicanos. Se ha descrito que hay ciertos glicanos que son más típicos de células embrionarias (polisiálico, …) que, en procesos tumorales se encuentran en tejido en los que no deberían estar o deberían estar a concentraciones mucho menores.
El interés de esto radica en que estos glicanos podrían usarse como biomarcadores.
Además, como estrategia terapéutica se ha planteado desarrollar anticuerpos específicos contra estos glicanos característicos de tumor.
Se realizó un estudio en el que empleando anticuerpos contra formas modificadas de polisiálico (PSA)conseguían evitar metástasis en ratón.
En la siguiente tabla podemos ver un listado de "vacunas" anticancerígenas basadas en carbohidratos - consisten en anticuerpos que reconocen estos carbohidratos "específicos de los tumores". Actualmente hay muchas vacunas de este tipo ya en fase de ensayo clínico.
18 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Glicoproteómica: identificación de glicoproteínas En primer lugar tenemos tinciones específicas para detectar proteínas.
Por ejemplo, ProQ Emerald que es una tinción que detecta glicanos. En este estudio se realizó una comparación entre dos geles, uno de los cuales tenía teñidas todas las proteínas y el otro solamente las glicoproteínas (con ProQ Emerald). En ambos geles (de electroforesis bidimensional) vemos que aparecen "rosarios" de spots, que se corresponden a las glicoproteínas - esto se debe a que los glicanos provocan ciertas diferencias de movilidad.
Este estudio es un ejemplo Top-down.
Como estrategia Bottom-up tenemos el enriquecimiento de glicoproteínas. Para ello se emplean columnas de lectinas (para purificar las glicoproteínas), unas proteínas que tienen capacidad de unir carbohidratos de la superficie de patógenos (y de las que podemos encontrar varios tipos).
Las lectinas tienen cierta especifidad: tienden a unirse a glicanos concretos aunque se considera que in vitro pueden unir varios.
La unión a los carbohidratos implica un átomo de calcio en el lugar de unión.
En el siguiente estudio identificaron una serie de glicoproteínas de C. elegans. Los investigadores tenían una mezcla de proteínas que asaron por una columna de lectinas, purificando las glicoproteínas que podía haber en el extracto. Liberaron los péptidos con glicosidasa y los analizaron por espectrometría de masas.
19 Modificaciones post-traduccionales La N-glicosidasa corta en el lugar donde hay una asparagina glicosilada, dejando un ácido aspártico. El tratamiento con N-glicosidasa constituyó una forma extra de confirmar que la proteína se encontraba glicosilada.
Caracterización de glicanos: glicoanálisis En el análisis de glicoproteínas el punto clave suele ser caracterizar la naturaleza del glicano que está unido a la proteína: de qué está compuesto y su estructura, es decir, llevar a cabo el glicoanálisis.
Normalmente, es necesario purificar las glicoproteínas y separar de alguna manera el glicano de la proteína en sí. A la hora de separar el glicano de la proteína podemos encontrarnos ante dos situaciones:  Si el glicano está unido a una asparagina, se puede quitar gracias a la enzima N-glicosidasa.
 Cuando nos encontramos ante O-glicosidación, es decir, si el glicano se encuentra unido a residuos de serina o treonina, éste solo se puede quitar mediante métodos químicos.
Aparte de la glicación enzimática, podemos encontrarnos ante la glicación no enzimática, normalmente producto de la capacidad del carbohidratos de interaccionar con residuos de la proteína y quedar unido a ellos. Es bastante común en los grupos amino de la hemoglobina, en cuyo caso la forma glicada recibe el nombre de A1c y sirve como biomarcador de la media de concentración de glucosa en sangre durante los últimos tres meses.
*Antes de terminar la glicosilación de proteínas, es necesario hacer un breve inciso para aclarar cuestiones de nomenclatura: El término GLUCOPROTEÍNAS no es correcto técnicamente hablando ya que, estrictamente hablando un GLIcano y un GLUcano no son lo mismo. Los glucanos son polímeros de glucosa mientras que los glicanos son polisacáridos. Como la mayoría de los glúcidos que se unen a las proteínas no son polímeros formados estrictamente por glucosa, sino que son glicanos, debemos hablar de GLICOPROTEÍNAS.
20 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Modificaciones por lípidos Llevar lípidos enganchados es otra modificación que pueden sufrir las proteínas. Ejemplos de los lípidos que se pueden encontrar modificando las proteínas son el miristato, palmitato, ácido palmitoleico, farnesil, ... y otros como los que vemos en la siguiente tabla.
*Los tres últimos lípidos que aparecen en la tabla son terpenos.
Los lípidos se pueden enganchar a cisteínas o a otros aminoácidos.
Normalmente, la unión de ácidos grasos a las proteínas acostumbra a servir para anclar las proteínas (que no tienen dominios transmembrana) a la membrana, permitiendo una unión dinámica. En un momento dado, el enlace entre proteína y lípido se puede cortar, liberándose la proteína de su unión a la membrana. Es decir, los lípidos acostumbran a funcionar como anclajes a la membrana.
Otra modificación algo más compleja es la unión a GPI, un fosfolípido. Éste tiene dos cadenas hidrofóbicas unidas a un glicerol que a su vez está unido a un fosfatidilinositol. Esta molécula puede engancharse a las proteínas por ejemplo por el extremo C-terminal.
Alteraciones en estas modificaciones se han relacionado con patologías. Se ha postulado que las enzimas que introducen los ácidos grasos pueden constituir dianas terapéuticas.
También se ha observado que en determinadas patologías como el cáncer o la progeria hay procesos alterados en la modificación por ácidos grasos. Para estas enfermedades también se han planteado los inhibidores de esta modificación como posible tratamiento.
21 Modificaciones post-traduccionales Modificaciones relacionadas con daño oxidativo Las modificaciones por daño oxidativo son más bien modificaciones accidentales e inevitables en lugar de formar parte de procesos regulados como el resto de modificaciones vistas hasta ahora.
El oxígeno es el aceptor final de los electrones de la cadena de transporte electrónico, es decir, coge los electrones que se han ido transportado a lo largo de los complejos de la cadena.
El problema es que el oxígeno es muy reactivo y puede coger electrones de otras partes de la cadena generando especies reactivas del oxígeno (ROS) que pueden provocar daños en las diferentes estructuras celulares.
Continuamente, parte del oxígeno que respiramos se convierte en estas especies reactivas. Tenemos sistemas para eliminarlas, pero es inevitable que una pequeña parte evite estos sistemas y modifique estructuras. Es decir, el daño molecular oxidativo es una consecuencia natural de la vida aerobia.
Entre las moléculas y estructuras que pueden sufrir daños se encuentran las proteínas. En determinados procesos patológicos, la modificación de las proteínas por parte de los ROS es mucho mayor, debido a un aumento de la producción de los radicales libres o a una disminución de los mecanismos de defensa.
Las especies reactivas del oxígeno han estado relacionadas con multitud de procesos patológicos: - Envejecimiento - Diabetes mellitus - Enfermedades neurodegenerativas - Alzheimer, Parkinson, enfermedad de Huntington, … - Aterosclerosis - Nefropatía 22 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Modificaciones que provocan las ROS a las proteínas - Oxidación de metioninas - Formación de carbonilo - Oxidación de grupos tiol - Nitración (de tirosinas) Consecuencias de la oxidación de proteínas - Pérdida de función - Entrecruzamiento (Crosslink) entre dos proteínas o entre dos partes de la misma cadena polipeptídica - Corte de la cadena peptídica - Según qué modificación se produzca puede aumentar la hidrofobicidad de la proteína, lo que conlleva a la agregación proteica.
- Pérdida de cofactores metálicos. Son especialmente sensibles a sufrirla las proteínas que contienen centros hierro-azufre.
Oxidación de metioninas La metionina tiene un átomo de azufre proclive a sufrir oxidaciones (proceso que puede ocurrir in vivo o in vitro). Cuando se oxida una metionina se forma metionina sulfóxido. La prueba de que la oxidación de metioninas se produce también in vivo es que prácticamente todos los organismos tenemos metionina sulfóxido reductasas, capaces de regenerar la metionina en forma reducida.
Se considera que la oxidación de metioninas es un proceso accidental.
Hay algún autor que postula que el proceso podría estar catalizado por metionina sulfóxido reductasas y que sugiere que podría constituir un regulador de la actividad de algunas proteínas.
Formación de grupos carbonilo La formación de grupos carbonilo consiste en la introducción de un grupo aldehído a la proteína.
Esta modificación puede tener repercusiones sobre la función y la hidrofobicidad de la proteína ya que los grupos aldehídos son más hidrofóbicos. El aumento de la hidrofobicidad puede provocar que las proteínas se agreguen.
Normalmente se considera que los carbonilos pueden formarse por tres vías: - Gracias al ataque directo de un ROS, como el peróxido de hidrógeno, a la proteína. Acostumbra a ocurrir en metaloproteínas, en las que, de alguna manera, el metal favorece la activación de las ROS.
23 Modificaciones post-traduccionales - Catalizada: hay algunas enzimas que pueden introducir grupos carbonilo en lisinas, como las lisil-oxidasas.
Esta es una modificación que acostumbra a producirse en el colágeno: para estabilizar la molécula de colágeno se producen entrecruzamientos entre las moléculas de tropocolágeno entre estos residuos ya que los grupos aldehído son relativamente reactivos y pueden tender a entrecruzarse estableciendo enlaces covalentes (que estabilizan la cadena de colágeno).
Si este proceso se produjera en exceso, el colágeno perdería elasticidad. Hay gente que afirma que el exceso de estos entrecruzamientos está detrás del envejecimiento.
- Modificaciones secundarias: introducción de grupos carbonilo.
Hay proteínas que pueden interaccionar con productos de la peroxidación lipídica que contienen grupos aldehído. Los aldehídos reaccionan con los aminoácidos de las proteínas y quedan enganchados a ellos, introduciendo el grupo carbonilo en la proteína.
Esta modificación también puede derivar de la glicación: se produce un glicano que si se oxida genera un aldehído.
Los carbonilos se acostumbran a usar como marcadores de la presencia de estrés oxidativo. En el siguiente estudio analizaron la presencia de grupos carbonilo en fibroblastos obtenidos de individuos control de diferentes edades y en individuos jóvenes (jóvenes y niños) con síndromes de envejecimiento prematuro (Hutchinson Gilford, un tipo de progeria).
24 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Los grupos carbonilo se pueden detectar utilizando compuestos que reaccionen con ellos como DNPH, que reacciona dando color.
Para intentar encontrar otra manera de identificar los grupos carbonilo se probó un reactivo fluorescente (Bodipy FL hydrazide dye) que reacciona con éstos. Las proteínas que tenían esta modificación se convertían en proteínas fluorescentes - la cantidad de fluorescencia dependía del número de carbonilos.
Modificaciones de tioles Como ya sabemos, los tioles son los grupos-SH característicos de las cisteínas. Éstos pueden sufrir diversas modificaciones: - Formación de puentes disulfuro: consisten en la unión de dos cisteínas (por los grupos -SH).
25 Modificaciones post-traduccionales - Oxidación del grupo tiol, que puede formar sulfénico cuando lleva un solo oxígeno, sulfínico cuando incorpora dos átomos de oxígenos o sulfónico cuando tiene tres. Hay maquinaria enzimática capaz de revertir la formación de sulfénico, pero esto ya no es posible cuando hay más de un átomo de oxígeno oxidando la proteína (sulfínico y sulfónico se consideran modificaciones irreversibles).
- Glutatiolación: unión de un glutatión a la cisteína. El glutatión es un tripéptido formado por glutámico, cisteína y lisina, que se considera como un tampón de tipo redox.
La cisteína puede formar un puente disulfuro con otra cisteína en situación de estrés oxidativo. Este se trata de un mecanismo completamente reversible con ayuda de ciertas enzimas. Se considera que es una modificación con papel protector, ya que reduce la probabilidad de que se formen sulfínicos y puentes disulfuros. Además, por otro lado, esta modificación actúa como elemento regulador de la actividad de determinadas proteínas, es decir, constituye una forma de activar o desactivar determinadas proteínas en situaciones de estrés oxidativo.
- S-tiolación o nitrosotiolación: consiste en la adición de óxido nítrico a los grupos tioles. En principio también es posible revertirla con relativa facilidad.
También se ha postulado como una manera de regular la actividad enzimática.
Aparte de poder variar su estado redox, las cisteínas también pueden tener cierto equilibrio ácido- base: pueden tener o no un átomo de H. En su forma tiolada las cisteínas son más reactivas y se pueden oxidar con más facilidad que en su forma protonada. Debido a esto, la reactividad de las cisteínas depende en principio del pH.
Las diferentes cisteínas de una misma proteína acostumbran a tener pKa diferentes, por lo que cada una pasará de la forma protonada a la no protonada a un pH diferente, que dependerá del entorno de la proteína.
26 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV Para evaluar el grado de oxidación que presentan los grupos tiol se juega con reactivos que pueden reaccionar con estos, como la yodoacetamida, que reacciona con tioles reducidos.
En el siguiente estudio se empleó el reactivo conjugado con un fluoróforo. En primer lugar se bloqueaban las cisteínas reducidas (-SH) antes de aplicar un reductor de puentes disulfuro (que redujo el resto de cisteínas). Sin eliminar el bloqueo inicial se añade el reactivo conjugado con el fluoróforo  se une a las cisteínas reducidas, que antes eran las oxidadas, convirtiéndolas en fluorescentes. Por tanto, las cisteínas oxidadas fueron marcadas de esta manera con fluorescencia.
Esto se aplicó en un problema biológico en levaduras. Había una muestra control y una con GRX5, un reductor de proteínas.
27 Modificaciones post-traduccionales Ayudas informáticas relacionadas con las modificaciones post-traduccionales Por un lado, podemos encontrar ayudas informáticas relacionadas con la predicción. Hay gente que se dedica a desarrollar programas de algoritmos para intentar, a partir de la secuencia de la proteína, predecir qué modificaciones post-traduccionales va a tener. Estas predicciones se realizan en base a otras modificaciones que ya se conocen (en secuencias conocidas).
Las predicciones que mejor funcionan son las relacionadas con la localización de la proteína y el punto de corte del péptido señal.
En la imagen podemos ver algunos de los tipos de predicciones que se llevan a cabo.
expsay.org es un portal de gran tradición dentro del análisis de proteínas.
Por otro lado tenemos las bases de datos en las que podemos encontrar información sobre las modificaciones post-traduccionales que se han descubierto.
Uniprot incluye todas las modificaciones post-traduccionales que se han descrito de la proteína. Por ejemplo, en la imagen vemos el resultado de la búsqueda de las modificaciones de p53.
28 2º C. Biomédicas (UdL) Irene LV También podemos encontrar bases de datos especializadas en modificaciones concretas, como PhosfoSitePlus, que está bastante especializada en lugares de fosforilación de las proteínas. Esta base de datos tiene bastante vinculación con la casa comercial Cell Signaling, por lo que se incluyen dentro de la información que proporciona, los anticuerpos de esta casa comercial contra cada modificación.
La base de datos Peptide Atlas tiene la subdivisión Phosphopeptide atlas que indica que péptidos de la proteína se han descrito e identificado por espectrometría de masas.
UNIMOD es probablemente el compendio más extensivo de las diferentes modificaciones posttraduccionales que se han encontrado en proteínas. Esta base de datos incluye una descripción química de todas las modificaciones, lo que puede resultar útil a la hora de hacer espectrometría de masas.
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