Tema 6B: Cinètica enzimàtica (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 1º curso
Asignatura Estructura i funció de biomolècules
Año del apunte 2016
Páginas 6
Fecha de subida 25/04/2016
Descargas 25
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 6B: CINÈTICA ENZIMÀTICA La cinètica enzimàtica estudia les velocitats de les reaccions catalitzades per enzims, i com aquestes velocitats varien en funció de; la concentració de substrat, la concentració de l’enzim, de la presencia d’inhibidors, d’activadors, del Ph, de la temperatura...
I ho fa establint el mecanisme d’actuació de l’enzim, esbrinant el nombre d’etapes de la reacció, identificant els intermediaris, determinant els valors de les constants de velocitat...
- Mecanisme enzimàtic més senzill per a una reacció monosubstrat: Un enzim que reconeix un substrat amb dues constants que formen el complex i enzim-substrat i el mantenen, i quan es dóna la catàlisi governada per K2 i k-2, s’obté l’enzim + producte (pas més lent que implica la catàlisi). I amb aquesta, podrem determinar la velocitat de la reacció mesurant la disminució de la concentració de substrat (S) en funció del temps o bé, determinant l’augment de la concentració de producte (P) en el temps.
Concepte de velocitat inicial Model de Michaelis-Menten es basa en una sèrie de supòsits: - - - Suposa que treballem amb condicions de v.inicial, en la qual NO hi ha producte, sinó que hi ha enzim i substrat però encara no hi ha producte, estic en un temps inicial de la reacció (velocitat inical). I si no hi ha producte no hi ha la possibilitat que el procés vagi a la inversa, per això no hi ha, ni s’observa K-2 en la reacció.
Una altra condició és que hi hagi una concentració de S molt més gran que la d’enzim E, de manera que tot l’enzim es troba formant el complex enzim substrat. I per això la concentració d’enzim és igual a la del complex enzimsubstrat.
I si mantenim la concentració d’enzim constant, a mesura que poso més substrat augmenta la velocitat de formació de productes, ja que la velocitat és proporcional a la concentració de S.
Velocitat inicial= concentració de producte/substrat per unitat de temps. I si això passa a temps curts, on encara no hi ha producte i la concentració d’enzim és més petita que la de substrat, parlem de velocitat inicial. Tot i que hi haurà moments en que el substrat arribarà a ser igual que la concentració d’enzim, moment en que al substrat arribarà a un límit de saturació.
A més l’enzim, que no deixa de ser proteïna, pot patir un procés de degradació, de manera que no tot estarà disponible per formar producte reconeixent el substrat, per la qual cosa perdria eficiència, o bé pot patir un procés d’inhibició per producte i perdre la linealitat, i aleshores si l’enzim treballés en aquestes condicions ja no es compliria Michaelis-Menten.
L’estat estacionari i l’equació de Michaelis-Menten En l’estat estacionari: la quantitat del complex enzim-substrat és constant, la variació d’enzim substrat respecte el temps és 0, i per complir aquest estat estacionari la concentració d’enzim ha de ser més petita que la de substrat.
Si això és cert, la quantitat de producte per unitat de temps (velocitat), depèn de la k2 i la concentració del complex enzim-substrat.
De manera que perquè es compleixi Michaelis-Menten, s’ha de complir aquest estat estacionari i les condicions de velocitat inicial definides anteriorment.
Podem representar la velocitat inicial en diferents concentracions de substrat i mantenint la concentració d’enzim, es forma una corba hiperbòlica, on l’enzim segueix Michaelis-Menten, i en el cas que no fos hiperbòlica l’enzim no seguiria MM.
Amb aquests paràmetres, obtenim l’equació de Michaeli-Menten: Paràmetres cinètics de l’enzim (POWER fórmules) V.màx= velocitat que no varia per molt que augmentis la concentració de substrat, és el màxim que assoleix l’enzim. No el podem aïllar directament, no arribarem mai a tenir un valor igual perquè tendeix a un límit, a una asímptota. No podrem extreure valors concrets de les constants.
Km= constant que defineix la afinitat que té un enzim per un substrat, com d’afí és. El grau d’afinitat que té un enzim per diferents substrats no és igual. I com més gran és la constat pitjor és l’afinitat d’aquell enzim per aquell substrat, és inversament proporcional. És la concentració de substrat que correspon a la meitat de V.màx (gràfic).
Però amb el gràfic, mai podem arribar a tenir un valor real de Vmax ni per tant, tampoc el valor concret de Km. Per tant, per obtenir les constants cinètiques a partir del gràfic, les puc calcular a partir dels dobles recíprocs o mitjançant la representació de lineweaver-Burk. Faig un 1/ per la concentració de substrat i 1/ V0, dobles recíprocs dels eixos, de manera que ho converteixo en una recta i amb aquesta puc obtenir valors concrets i trobo que el punt de tall en la recta amb l’eix de les Y és 1/Vmàx, i el punt de tall en l’eix de les X és -1/Km, i això són valors concrets.
En els dobles recíprocs el punt de tall de la Km sempre queda en el quadrant negatiu (per això quan construïm l’eix posem l’eix de les Y al mig), és negatiu perquè es trobarà a l’esquerra però el valor de Km queda positiu.
El significat de les constants cinètiques La Km (constant de Michaelis) és la constant d’afinitat que té un enzim per un substrat determinat, i com més petit és el valor de Km més afinitat té l’enzim per aquell substrat concret, com per exemple la D-glucosa és un millor substrat per la hexoquinasa del cervell que no pas la D-fructosa.
Més concretament, la Km, mesura la concentració de S a la que la velocitat és la meitat de la Vmàx, menys una mesura aproximada de l’afinitat del substrat envers l’enzim, de manera que les seves unitats seran les mateixes que amb les que mesures la concentració de substrat, són unitats de concentració.
Cada parell enzim-substrat té una Km característica.
I un altre paràmetre importants, és la constant catalítica o la Kcat, que indica quantes molècules de substrat pot una molècula d’enzim convertir per segon, i és equivalent a la K2. Les seves unitats son Segons a la -1.
L’eficiència enzimàtica es mesura mitjançant Kcat /Km Aquesta constat d’especificitat (“ratios”)ens dóna dues informacions, és un paràmetre més informatiu que els altres dos, és el consens dels altres dos:   Especificitat enzimàtica: si per un mateix enzim tinc 2 substrats diferents amb dos ratios diferents, com més gran sigui la ratio, vol dir que més tendència tindrà a transformar aquell substrat que proporciona el nombre de ratios més gran. De manera que si l’enzim està en contacte amb els dos substrats a la vegada, transformarà abans en producte aquell substrat pel qual sigui més específic. La ratio dóna una idea de la especificitat enzimàtica, per una banda.
Eficiència enzimàtica: indica com de bo és l’enzim, ja que hi ha un màxim de valor d’eficiència enzimàtica, que es troba entre un valor de ratio de 108 i 109, valor pel qual diem que es tracta d’un enzim gairebé ideal o “perfecte”. Hi ha un límit de difusió de les molècules en un solvent que es el màxim valor d’eficiència enzimàtica que pot tenir un enzim per un substrat determinat, és el valor que està limitat per la velocitat a la que el E i S poden trobar-se en dissolució aquosa.
Les unitats del valor de ratio són M-1, per S-1.
Fórmules (resum) Quan K2 és molt molt més petit que K-1, a vegades diem que directament es k-1/k1.
La Kcat és el pas limitant de la reacció per tant Kcat=K2, perquè està en concentracions de temps inicial, amb unitats de S-1 (SI). Aleshores també puc posar la velocitat inicial en funció de Kcat.
...