Seminario 2 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad de Lleida (UdL)
Grado Biotecnología - 1º curso
Asignatura Biología Celular
Año del apunte 2016
Páginas 3
Fecha de subida 21/04/2016
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Biología Celular.
Héctor Escribano Seminario 2 Tipos de microscopios electrónicos En estos microscopios se utilizan rayos de electrones en lugar de luz visible. Los electrones también tienen una longitud de onda muy pequeña (0,004nm) frente a los 350nm o 700nm de la luz visible. Las lentes son electromagnéticas y tienen la capacidad de desviar los rayos de electrones. Dadas estas propiedades deberíamos tener una resolución cien mil veces menor que en los convencionales. Pero no solo son estas las propiedades que lo definen, ya que la apertura numérica también es más pequeña, 0,01. La resolución teórica es de 0,2, y la que suele ser real es de 2.
Microscopio óptico de transmisión En tubo del microscopio, se pone un filamento metálico que se somete a una temperatura hasta que se pone incandescente, y luego se somete a un fuerte campo electromagnético (100.000V) para arrancar los electrones del filamento. Si se aumentase el valor del campo eléctrico, se podría mejorar la resolución.
Una serie de condensadores dirigirán los electrones hacia la muestra, y los electrones son recogidos por un objetivo de lentes electromagnéticas. Los electrones siguen su camino hasta una pantalla fluorescente.
Los puntos de luz son aquellos que han atravesado la muestra y han chocado contra la pantalla, mientras que aquellos electrones que no han podido atravesar la muestra no chocan contra la pantalla creando un punto oscuro, debido a que no se ha excitado ese punto de la pantalla. No se observa por un objetivo, sino que la imagen se forma en la pantalla, en blanco y negro (luz y oscuridad).
Los electrones viajan en el vacío, ya que si hubiera otras moléculas intervendrían con la imagen. Si el vacío no fuera correcto, la resolución empeoraría.
Fijación.
Se suele utilizar el Tetra oxido de Osmio, porque se une a los lípidos de las membranas y Glutaraldehido para conservar la estructura interna de las proteínas. La acción de los fijadores consiste en establecer uniones entre moléculas e intermoleculares, bloqueando la disposición espacial de las moléculas, para que ni se muevan ni se degraden.
Tinción.
Las muestras también se han de teñir, ya que son bastante transparentes a los electrones, los dejan pasar con facilidad, debido a que sus átomos son de bajo radio y tamaño pequeño que no impiden su paso. Por eso se utilizan sales de metales pesados, que tienen diferentes afinidades por diferentes estructuras y que debido al gran tamaño de estos átomos retienen a los electrones, creando ese contraste de luz.
El Tetra oxido de Osmio aunque es un tinte, se añade ya durante la fijación, aunque su función es meramente la de colorear.
Biología Celular.
Héctor Escribano Seminario 2 Deshidratación.
La muestra se deshidrata para que el agua de la muestra no se evapore una vez dentro del tubo y destruya el vacío que se ha creado.
Inclusión.
Se utilizan sustancias parecidas a las resinas, que dan rigidez a la muestra, al solidificar a temperatura ambiente, dando consistencia de plástico duro. Esa rigidez es necesaria para cortar la muestra muy finita, del orden de 50-70 nm y no de micras como en el microscopio óptico. Por eso se utiliza el ultramicrotomo con cuchillas de diamante.
La imagen que se obtiene es una sección muy fina de la muestra y no da fielmente la estructura de los orgánulos, por eso se utilizan diferentes secciones en serie para utilizarlas y renderizar una imagen en 3D del orgánulo.
Técnica de contraste negativo Se utiliza para muestras muy pequeñas, como virus o bacterias. En una rejilla recubierta de Carbono, se pone una gota de la solución vírica y una gota de solución de una sal pesada. Con un papel de filtro se quita el exceso de solución salina, pero por el borde de cada virus, queda un resto de solución que no se puede eliminar. (Apuntes para descripción grafica). Los electrones podrán atravesar las partículas víricas y se verán blancas. Las zonas alrededor de las partículas al estar rodeadas de la sal de metal pesado impedirán el paso de los electrones y se mostraran oscuras.
La tinción positiva es aquella en la que se tiñe la estructura, la negativa, se tiñe el medio pero no la muestra y se deja que los electrones atraviesen la muestra, completamente.
Criofractura y Criocorrosión.
Se congela la muestra y se corta con una cuchilla también a baja temperatura. La cuchilla no corta recto, sino que corta entre las dos bicapas lipídicas, por lo que mantiene la estructura de los orgánulos de membrana, quedando un relieve. Se pulveriza la muestra, de lado, con sales pesadas, de Platino (Sombreado metálico); solo marcando la mitad de las estructuras por uno de los lados. Además, se pulveriza con Carbono para formar un molde. Lo que se observa mediante esta técnica es el molde, y no la muestra.
Biología Celular.
Héctor Escribano Seminario 2 Microscopio electrónico de transmisión Es lo más parecido a una lupa, y la luz no ha de atravesar la muestra; nos sirve para observar la superficie de los objetos con gran detalle sin haber de cortarlos, ya que la luz solo incide sobre estos. También se debe poner el filamento metálico incandescente y se les conduce a la muestra. La muestra estaría cubierta por una fina película de metal, que impediría que los electrones atravesaran la muestra. Dependiendo del perfil de la superficie, los electrones rebotaran en una dirección u otra, y serán recogidos por un detector.
Los datos del receptor darán lugar a una imagen en una pantalla.
La muestra también se ha de preparar, deshidratar.
Para "pintar" la muestra de metal, se establece una diferencia de potencial en un recipiente cerrado, lleno de Argón cargado positivamente. El cátodo es de Oro, y el ánodo dirige al Argón hacia el cátodo, chocando con el Oro y desprendiéndolo, creando una atmosfera de Oro que al ir cayendo por gravedad, recubrirá la muestra.
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