Tema 9 - Conjugació (2014)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 2º curso
Asignatura Biologia Molecular Procariotes
Año del apunte 2014
Páginas 10
Fecha de subida 26/12/2014
Descargas 17
Subido por

Vista previa del texto

BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TEMA 9 – Conjugacio LA CONJUGACIÓ 10/12/14 Per tal que es produeixi la conjugació és necessari que dues cèl·lules s’apropin la una a l’altra mitjançant pilis conjugatius. Els pilis reconeixen receptors de paret i, quan estan units a l’altra cèl·lula, s’escurcen mitjançant despolimerització per apropar-les. Una vegada estan juntes, es forma un porus conjugatiu en el lloc en el qual estava el pili, gràcies a la fusió citoplasmàtica.
Un parell conjugatiu està format per les dues cèl·lules i el porus conjugatiu.
El pili només serveix per acostar les dues cèl·lules donadora i receptora .
MECANISME DE CONJUGACIÓ Tenim la cèl·lula donadora i la cèl·lula receptora. Es forma un pili conjugatiu, s’acosten i es genera un porus conjugatiu.
Quan les dues cèl·lules estan juntes es diu que es forma un parell conjugatiu. Tenim una proteïna que tallarà el DNA de la cèl·lula donadora en un punt concret que anomenarem OriT (origen de transferència), també anomenat regió Mob. Serà el punt a partir del qual començarem a transferir el DNA.
Aquesta proteïna és la relaxasa i el que fa és reconèixer i enganxar-se a l’OriT, talla i obre el DNA i el transfereix a la cèl·lula receptora (se’n van la relaxasa i una cadena senzilla de DNA a la cèl·lula receptora).
Aquest DNA de cadena senzilla que ha entrat, amb l’ajuda d’una primasa que farà d’encebador, podrà replicar i tindrem un plasmidi amb una cadena nova i una cadena vella. Alhora, com ens hem emportat una cadena de la original, a la cèl·lula donadora també es donarà la polimerització d’una nova cadena de DNA (en tallar ha quedat un 3’OH lliure perquè pugui enganxar-se la polimerasa i replicar en cercle rodant).
97 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 La cèl·lula receptora un cop ha rebut el plasmidi s’anomena cèl·lula conjugant o cèl·lula transconjugant. Ara ja no serà una cèl·lula receptora sinó donadora – serà capaç de generar pilis conjugatius – les cèl·lules donadores normalment són com peludes, que són pilis que estan intentant trobar cèl·lules per pescar-les. Una cèl·lula receptora no produeix pilis, és pescada. La gràcia és que cèl·lules donadores que tinguin el mateix sistema de donar plasmidis sovint detecten que altres cèl·lules ja tenen el plasmidi i no li passen – dues cèl·lules peludetes, com han canviat l’estructura de paret, ja no s’enganxen (pelitos con pelitos no). Només detectaran les que no tinguin el plasmidi.
En funció dels pilis conjugatius podem trobar diferents punts de recepció. Una cèl·lula que ja té un plasmidi pot rebre un altre plasmidi mentre no sigui el mateix que ja té, perquè modifiquen la paret de la cèl·lula receptora de la mateixa manera, i no es reconeixeran.
Esquema del mecanisme de conjugació – aquest mecanisme dins la cèl·lula està coordinat. Una cèl·lula no farà que la seva relaxasa talli el DNA en el oriT fins que la cèl·lula tingui garantida la presència d’una segona cèl·lula (no s’activa el procés de transferir el DNA, ni es munta el porus conjugatiu si al voltant no hi ha cèl·lules).
Les estructures tant del pili com del porus acumulen moltíssimes proteïnes. Per tant no té molt sentit muntar tota la parafernàlia pa na. És per això que és necessària aquesta coordinació.
Totes aquestes proteïnes estan sintetitzades però desubicades. Quan reben la senyal que hi ha una cèl·lula a prop, s’agrupen i conformen els pilis i els porus. Això activa la relaxasa perquè reconegui l’OriT i es talla i transfereix el DNA.
98 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 On es produeixen els pilis? Estan codificats en els gens Tra – són gens que codifiquen pels productes gènics implicats en la transferència (pilis, porus). També són necessàries les proteïnes de l’origen de transferència – la regió Mob és la regió necessària per la transferència, per l’OriT.
Per tant, les cèl·lules han de ser Tra+ Mob+. També trobem plasmidis Tra- Mob-; seran plasmidis que no podran moure’s (no tenen OriT) ni sintetitzar les enzims per la conjugació. Finalment tenim Tra- Mob+ i Tra+ Mob-. El segon no es mou tot i que té la maquinària necessària per la conjugació i el primer té un OriT però li falta la maquinària. La deficiència tant de Tra com de Mob es pot complementar. Els que tinguin regió Mob i es trobin en un entorn amb gens Tra podran moure’s, ja que els gens Tra es poden complementar en trans. Però no es pot complementar l’origen de transferència en trans, s’ha de fer en cis.
Per tant, de totes les possibilitats, els que es poden moure seran els que tinguin regió Mob sempre i quan es trobin en un entorn amb Tra o els portin incorporats. La regió Mob no pot complementar-se en trans perquè l’OriT es mouria de lloc.
No tots els mecanismes de conjugació tenen sistemes d’exclusió – no en tots els casos la presència dels plasmidis impedirà la reconjugació del mateix plasmidi.
99 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 CONJUGACIONS BIPARENTALS i TRIPARENTALS En la biparental intervenen la cèl·lula receptora i donadora, mentre que en la triparental apareix la cèl·lula helper.
Si tenim un plasmidi Tra+Mob+ podrà passar per si sol a la cèl·lula receptora. Però si és TraMob+, podem fer una conjugació amb 3 cèl·lules; una d’elles té el plasmidi Tra+Mob+, (cèl·lula helper), una que té un plasmidi que només es mou si algú complementa en trans els seus gens Tra (cèl·lula donadora del plasmidi coix) i una cèl·lula receptora. La helper complementa en trans el plasmidi de la donadora i passa a la receptora.
Per tant, en la imatge – tenim el plasmidi groc discontinu que no pot transferir-se per si sol a la cèl·lula receptora. Tenim un plasmidi que sí que pot moure’s, que està en la cèl·lula helper (Tra+Mob+). Aquest el mobilitzem a la nostra cèl·lula donadora, perquè complementi en trans els gens tra al plasmidi que volem moure. Seleccionant les característiques adients per seleccionar la nostra cèl·lula amb Tra de la helper (amb antibiòtics), obtenim per conjugació a la cèl·lula receptora el plasmidi que volíem ja que haurà pogut moure’s agafant els gens tra de la helper. No tindrem els helpers mai sols perquè no tindran la resistència que sí que tindrà el nostre plasmidi, no podran créixer aquells que no hagin transferit els tra en la receptora.
Podem tenir una cèl·lula que aporta els gens via plasmidi però també podem tenir cèl·lules que codifiquin en el seu cromosoma per gens Tra.
Aquestes no es troben normalment en la natura, les hem construït nosaltres. Tot i que hem d’exceptuar les cèl·lules que són capaces de transferir el seu genoma.
La presència dels gens Tra en un cromosoma permet que qualsevol vector que hi hagi en la cèl·lula, si té un OriT compatible amb els gens Tra, aquest plasmidi podrà moure’s a les cèl·lules receptores. Un cop a les cèl·lules receptores el plasmidi ja no es podran moure a no ser que en aquesta receptora tingui gens Tra (ell no porta amb ell els gens Tra).
Això és una manera d’assegurar que els plasmidis que estem movent d’un lloc a un altre és quedin on nosaltres volem que es quedin.
100 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 REGULÓ TRA Diferents gens tra – no només codifiquen per pilis, també poden codificar per helicases (obren el DNA), etc.
FUNCIONS DELS PILIS De pilis n’hi ha molts tipus i cada un té sistemes de conjugació diferent i específic, i per tant tindran gens Tra diferents (però tots es basen en el mateix). Fins i tot a vegades no s’anomenen Tra perquè els va descobrir algun tofan que no sabia que era un Tra però després es va veure que codificava per la relaxasa etc.
- Biosíntesis de pili sexuals Estabilització dels agregats de conjugació (traG i traN) Replicació i transferència del DNA (traI, traD, traM, traY i traZ) Regulació de la transferència (traJ) Control negatiu del sistema finO i finP Exclusió de superfície (traS i traT) 101 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TIPUS DE PLASMIDIS CONJUGATIUS – plasmidis que tenen gens Tra (Reguló Tra) però no Mob. A nivell natural, no són molt abundants (no tenen molta lògica).
MOVILITZABLES – Plasmidis que tenen gens Mob (Reguló Mob) però no els Tra CONJUGATIUS I MOVILITZABLES – Tenen gens Tra i gens Mob (Tra+Mob+).
Alguns plasmidis mobilitzables contenen relaxasa en la seva seqüència perquè el que és més específic del sistema de transferència és el reconeixement de l’OriT i el tall – la relaxasa és qui vehicula el DNA reconeixent una seqüència concreta. Per tant, molts plasmidis que només són Mob+, tenen la relaxasa que permetrà que el plasmidi es pugui mobilitzar en més sistemes. Si es troben en un entorn amb gens Tra però la relaxasa no és compatible amb l’OriT no podran conjugar igualment. En canvi moltes relaxasas són compatibles amb la majoria de sistemes.
TRANSFERÈNCIA DE DNA Cèl·lula donadora (plasmidi) – pilis – acostament de parets – porus conjugatius – relaxasa reconeix l’OriT, talla, vehicula el DNA – es produeixen fragments d’Okazaki per generar la replicació – la relaxasa s’encarrega de la recircularització del DNA – tenim les dues cèl·lules amb plasmidi de doble cadena.
Els plasmidis no són les úniques estructures que duen a terme la conjugació – ICE (Elements Extracromosòmics Conjugatius). Són un conjunt d’elements que permeten fer una conjugació.
102 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 A part de plasmidis, per exemple, també podem trobar transposons conjugatius.
ESQUEMITA: Tenim una cèl·lula donadora amb el transposó conjugatiu que està situat al cromosoma. Tenim els gens Tra codificats en la seva estructura, a part de la transposasa i tot això (serà una cèl·lula peluda). La cèl·lula reconeix una altra cèl·lula. S’acosten i es genera el porus. El transposó ho detecta i s’escindeix (està de forma extracromosòmica). Aquest transposó té un OriT – envia una còpia a la cèl·lula receptora. Es trenca el porus conjugatiu. Ta-xan.
No és un plasmidi perquè el transposó no té un origen de replicació, però s’integra al cromosoma tant en la donadora com en la receptora perquè sí que té un OriT. Per tant es dóna la transferència de DNA de manera horitzontal a través de la conjugació (no es mantenen de forma extracromosòmica).
El mateix passa a les illes de patogenicitat amb els gens de virulència que es transfereixen amb el mateix sistema (la illa està integrada, s’escindeix i es trasllada a la receptora).
PLASMIDI F El primer plasmidi amb el qual es va descobrir la conjugació va ser el plasmidi F, anteriorment anomenat plasmidi sexual. El plasmidi F fa la conjugació sí o sí perquè els seus sistemes de conjugació no estan regulats per una mutació que fan que els seus gens Tra s’expressin de manera constitutiva (mutació FinO, cèl·lules peludes). La freqüència de conjugació del plasmidi F és de 1, és a dir, si poses el plasmidi F amb una sèrie de cèl·lules, totes elles acabaran amb el plasmidi F. Al principi no se sabia del fenomen de la conjugació, el que veien és que les característiques de A passaven a B sense saber perquè.
103 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TRANSFERÈNCIA DEL PLASMIDI F SOQUES Hfr Què passaria si un plasmidi conjugatiu i mobilitzable s’incorporés en el cromosoma cel·lular? Es pot incorporar de moltes maneres (formació de cointegrats per recombinació homòloga). Si aquest plasmidi l’integrem i és Tra+Mob+, l’OriT està al cromosoma. Per tant, quan es doni la conjugació, es transferirà el plasmidi i tot el que hi hagi al costat de l’OriT – transferència del cromosoma.
Les posicions en E. coli es transfereixen en minuts – es va determinar comptant els minuts de cromosoma que passen abans que es tanqui el porus. Parlem de cèl·lules Hfr (High Frequence of Recombination – han incorporat el plasmidi F), i el que els ha passat és que tenien un plasmidi conjugatiu i mobilitzable l’OriT dels quals estan dins el cromosoma i per tant transfereixen DNA cromosòmic a la cèl·lula receptora. Però l’estructura del porus conjugatiu és molt làbil, no aguanta 100 minuts estable. Per tant, la transferència de DNA cromosòmic s’acaba quan es desestructura el porus. Ara, aquest DNA cromosòmic s’ha d’estabilitzar 104 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 El DNA que ha passat a la cèl·lula receptora s’ha d’estabilitzar. Com? Teniu una cèl·lula que ara és Hfr (ha incorporat el factor F) i el transfereix a una cèl·lula receptora. Si la receptora és Trp- i la donadora Trp+, podrem tenir transconjugants Trp+? Sí, però el DNA no podrà recirculartzar en la majoria de casos perquè a priori no té cap origen de replicació (no pot transferir tot el cromosoma, és poc probable que es transfereixi l’origen de replicació). Llavors, es produeix una recombinació homòloga – intercanvi de marcadors.
Contra més baix sigui el nivell de similitud, més difícil serà que es doni la recombinació. Per què? CRISPS, patrons de metilació, etc.
Igual que passava amb els bacteriòfags, els plasmidis que s’han integrat al cromosoma i que han generat soques Hfr poden escindir-se del cromosoma, i pot escindir-se malament. Llavors tindrem el plasmidi F + un plus de gens = Plasmidi F’. Aquesta cèl·lula podrà fer conjugació, i l’OriT, si està al plasmidi, quan passi a la receptora s’estabilitzarà en forma extracromosòmica, com a plasmidi, perquè si que tindrà origen de replicació, sempre i quan entri en un entorn genètic en el qual sigui estable, on tots els seus mecanismes de replicació puguin funcionar (no com els vectors suïcides). Amb aquest mecanisme obtenim una soca merodiploide. Abans el DNA per estabilitzar-se havia de recombinar, substituíem un per l’altre.
Però aquí ni – tenim un vector plasmídic que porta gens i no cal que recombinin perquè és estable, te un origen de recombinació, és un plasmidi que ha adquirit una sèrie de gens.
Per tant tindrem dos còpies – tindrem un cromosoma sencer i un vector amb una part dels gens del cromosoma sencer. Aquest vector plasmídic l’anomenarem F’ (plasmidi F amb un plus de gens).
105 BIOLOGIA MOLECULAR PROCARIOTES PARCIAL 2 TRANSFERÈNCIA VECTOR F’ MAPEIG D’E. COLI TRANSFERÈNCIA GÈNICA EN BACTERIS 106 ...