Sesiones problemas 2 (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Pompeu Fabra (UPF)
Grado Medicina - 2º curso
Asignatura Bioquímica II (Biología molecular)
Año del apunte 2016
Páginas 9
Fecha de subida 19/04/2016
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Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 11/11/2015 PROBLEMAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR SESIÓN 2- Cómo determinar que una proteína o complejo proteico se une específicamente a DNA con técnicas in vitro (EMSA y footprinting) e in vivo (ChIP) Técnicas que se utilizan para medir la interacción entre proteínas y DNA. Las técnicas se dividen en: - IN VITRO = “en medio artificial, en laboratorio” EMSA § EMSA = “Electrophoretic mobility shift assay” à técnica utilizada para estudiar interacciones entre proteínas y ácido nucleicos. Se basa el una electroforesis con distintos carriles. El primero contendrá fragmentos del DNA de interés marcados. En el resto de carriles se añadirán distintos componentes de reacción que se verán a continuación.
§ Tenemos un fragmento de DNA marcado radioactivamente. Este fragmento de DNA va a tener una movilidad determinada en función de su tamaño. Si este DNA lo incubamos con una proteína que tiene capacidad para unirse a DNA, en condiciones nativas la movilidad de este DNA variará.
* Una proteína que tiene capacidad de unirse a DNA puede ser de diversos tipos. Aquí se mencionan: Factores de transcripción (TF) Proteínas de recombinación A B Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 11/11/2015 à Esto está esquematizado en la imagen: en primer lugar se hace una electroforesis (A), en la cual el DNA correrá hasta ciertos puntos. Cuando se revela el gel (mediante una radiografía, B) solo se observará el DNA que haya sido marcado radioactivamente ( ). Se analiza carril por carril a continuación: Carril Electroforesis A 1º DNA radioactivo 2º DNA Resultados radiografía B Se observa la banda del DNA radioactivo (100 molec.) Dos bandas: una parte del DNA está libre incubado con una proteína (FT) con (aprox. 50 molec.) y corre igual que la afinidad por DNA (50 molecm) banda del carril 1º, mientras que otra parte del DNA (50 molec aprox.) estará unido al FT y tendrá una movilidad distinta (= shift).
3º Competición específica: sonda/DNA radioactivo La proteína se unirá por probabilidad a la (100 sonda no marcada. Por eso se observa como molec.) + FT (50 molec.) + exceso si solo hubiese sonda marcada en este carril.
de la misma sonda no marcada Pero en realidad también se produce un (10.000 molec. = 100 veces nº de shift entre FT y la sonda no marcada.
sonda marcada).
4º Competición no sonda/DNA 5º específica: (100 la imagen) se seguiría observando la misma molec.) + FT (50 molec.) + exceso radiografía que en el carril 2º debido a que de sonda no específica (10.000 la molec. = 100 veces nº de sonda interaccionaría con FT. La sonda mutante marcada).
no se revelará en la radiografía.
Supershift: complejo ternario, es So observa una banda con todo el complejo decir, se hace un complejo a tres con mínima movilidad (contiene Ig) y luego bandas. Se añade sonda marcada, vuelve a aparecer la banda con sonda FT marcada que no se haya unido a FT.
y un reconozca radioactivo Si la unión fuese especifica (como ocurre en anticuerpo a FT (Ig) (proteína) complejo a tres bandas.
que = sonda no específica/mutante no *Para demostrar que lo que se está observando está realmente formado por sonda marcada y la proteína añadida.
§ El objetivo de estudiar esta interacción es demostrar especificidad, es decir, que una proteína se une a DNA porque reconoce una secuencia (FT); o en el caso de un factor de recombinación, porque reconoce alguna estructura. Por eso se hacen competiciones.
* Existen dos tipos de competiciones: - Competición específica => Competencia por la unión con exactamente el mismo fragmento de DNA (sonda) pero no marcado( ).
- Competición no específica => Competencia por la unión con una molécula de DNA (sonda) que no tenga ninguna relación con la sonda marcada ( ).
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB § 11/11/2015 Si la unión proteína ßà DNA es específica (FT realmente reconoce una secuencia de nt) à no afectará el que se añadan sonda en exceso de una sonda competidora. Por lo contrario, si la unión proteína ßà DNA no es específica (por ejemplo, es por cargas) à si que se verán diferencias porque si que habrá competición al añadir una sonda competidora en exceso.
§ La última prueba de especificidad es lo que se conoce como un supershift. Consiste en añadir el quinto carril un anticuerpo para la proteína que interacciona con la sonda marcada. Se forma de este modo un complejo ternario con: sonda marcada + proteína (FT)+ anticuerpo ( ). Esto se usa para comprobar que lo que se observa es realmente la sonda marcada unida a un FT.
A B à En la imagen se observa un caso complejo: estudio interacción fragmento DNA con varias proteínas: - La banda más gruesa e inferior en todos los carriles corresponde a la sonda marcada libre (A y B) - Carriles 1º y 2º se observa complejo formado por proteína Mcm1p con sonda marcada (A).
- Carriles 5 y 6 se observa otro complejo formado por dos proteínas, Mcm1p y Yox1p con la sonda marcada (A).
- Carriles 5 y 6 se observa otra banda más superior. Se trata de un complejo cuaternario formado por Mcm1p + Yox1p + sonda marcada + anticuerpo anti-Yox1p (A) = hay un total de 4 moléculas.
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB § 11/11/2015 EMSA permite medir parámetros cinéticos de la unión proteína – DNA, por ejemplo: Ø Cinética de unión Ø Constantes de afinidad (KA) Ø Constantes de disociación (KD) Ø … § Y todo ello se hace mediante competiciones.
§ Ejemplo para terminar con esta técnica: se quiere medir la cinética a la cual se disocia DNA de una proteína. Se usa dicho fragmento + competidor especifico + proteína y a distintos tempos (1’ 2’ 3’…) se va cargando el complejo en el gel. El shift (unión proteína con sonda marcada) irá despareciendo con el tiempo. Y podría hacerse lo mismo a la inversa:¿cuánto tiempo tarda en formarse la asociación? à esto dará idea de cómo de fuerte se une una proteína a al ácido nucleico.
FOOTPRINTING § No se obtenemos ningún parámetro pero permite saber exactamente a qué nucleótidos se une un factor de transcripción, es decir, cuales son los nucleótidos que entran en contacto con el FT.
§ ¿Cómo se lleva a cabo? ¿Cuándo se utiliza? De antemano debe saberse que hay un fragmento de DNA (100-200 nt) al cual se un FT. El investigador busca conocer la secuencia exacta de nt que interaccionan y se unen a FT. (1) Lo que ese hace es marcar dicho fragmento en 5’ a partir de T4 polinucleótido quinasa (sesión 1, marcaje extremo 5’).
! Fragmento DNA con extremo 5’ marcado = color rojo § A (2) Posteriormente, estos fragmentos marcados se digieren con DNAsa. Se trata de una digestión parcial y aleatoria de todos los fragmentos posibles.
§ (3) Se lleva a cabo una electroforesis de acrilamida para los productos de la digestión (A).
§ B (4) Al revelar los resultados (radiografía, A) se observa una recopilación de todos los fragmentos posibles digeridos, por orden de su tamaño (forma escalera).
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB § 11/11/2015 (5) Paralelamente se incuba el fragmento de DNA y se incuba con el FT o proteína con el que se sabe que tiene afinidad. Siguiendo los pasos vistos previamente, se digieren los productos de la incubación con DNAsa, se hace una electroforesis de acrilamida y se revelan los resultados (B).
§ ¿Qué ocurrirá en este segundo caso (B)? La DNAsa digerirá aleatoriamente los fragmentos de DNA igual que en A, pero con la excepción de que los resultados de revelar le electroforesis mostraran un hueco (falta de bandas o footprint). Este hueco se corresponde con aquella secuencia de nucleótidos que DNAsa no habrá podido digerir debido a la unión de estos con la FT (zona “protegida” de la digestión por unión con FT).
§ ¿Qué obtenemos?¿Qué podemos determinar? La región de nucleótidos reconocidos por la proteína (FT). Por lo tanto, no obtenemos ningún parámetro cinético, sino un “mapa”.
Fragmento nt reconocidos por proteína - IN VIVO = “en el organismo vivo” Hasta ahora se ha estudiado la interacción DNA-proteína IN VITRO, pero podría darse el caso (y es probable) de que FT solo interaccione en algunas condiciones determinadas con el DNA.
Por ejemplo, porque no están en el núcleo, porque no están activadas, etc. Para estudiar estar situaciones se llevan a cabo estudio IN VIVO, como son los ChIP. Además, esta técnica puede combinarse con RT-PCR y microarrays.
ChIP § ChIP = “Chromatin Immunoprecipitation” o Immunoprecipitación de cromatina à que consiste en una immuniprecipitación experimental diseñada para estudiar la interacción entre proteínas y DNA a tiempo real en la célula. Su objetivo es determinar si una proteína específica (como FT o promotores) está asociada con un región genómica específica bajo qué condiciones y en qué localización.
§ Técnica basada en 2 claves, crear y revertir un cross-link reversible: ⇒ (1) Cross-link reversible con formaldehido à molécula muy pequeña que, en ser añadida, penetrará fácilmente un tejido debido a que atraviesa todas las Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 11/11/2015 membranas. Es capaz de inducir uniones covalentes entre cualquier proteína y ácido nucleico si estos están en contacto (Ejemplo. Si el FT está en el núcleo pero no está en contacto con el DNA no va a 1 producir ninguna unión). De modo que si FT y DNA están tocándose, formaldehido los “pegará”. De hecho, es como hacer una foto para estudiar cómo están en un momento determinado las proteínas y el DNA.
* El cross-link reversible consiste en realizar uniones covalentes entre DNA y una proteína específica. También puede ocurrir entre DNA y otro agentes exógenos/endógenos.
⇒ (2) A continuación se lisaran las células así como 2 su A cromatina (no interesa trabajar con grandes fragmentos sino con trozos pequeños). Esto se hace mediante el método de 3 A sonicación, en el cual se aplican ultrasonidos para realizar la lisis. Cada célula romperá de forma física las cromatinas por sitios diferentes aleatorio) y los (totalmente fragmentos serán aproximadamente de 500 4 5 nt.
⇒ (3a) Seguidamente se añade un anticuerpo (Ig) contra la proteína específica.
(3b) Luego se realiza una immunoprecipitación, de modo que precipitará todo lo que esté enganchado al Ig => FT que, si está unido a un fragmento de DNA, también lo arrastra.
* Immunoprecipitación (IP): técnica para precipitar una proteína en solución a partir de un Ig que la reconoce y se une a ella. También se ha visto la Co-IP, para precipitar complejos proteicos. En este curso se estudia la ChIP , Immunoprecipitación de DNA.
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 11/11/2015 ⇒ (4) A continuación se lleva a cabo la reversión del cross-link para poder realizar la detección de presencia de DNA en la immunoprecipitación. ¿Cómo se hace? Mediante calor que permite la rotura de la unión covalente. De modo que se separan las proteínas de los fragmentos de cromatina (supuestamente, puesto que aun no se ha comprobado que realmente haya DNA).
⇒ (5) Por último, para comprobar si realmente se dispone de DNA, se hace una PCR, es decir, se amplifica el DNA. Pueden darse dos casos: o Amplificación à si unión DNA-FT o No amplificación à no unión DNA-FT § Por lo tanto, si los resultados dan amplificación, es decir, que hay producto de PCR, significa que DNA si que habría estado unido a FT. Por lo contrario, si no hay amplificación, significa que no se habría producido ninguna unión en el momento en que se ha realizado el cross-linking.
No se obtiene ningún parámetro, pero da idea de lo que ocurre IN VIVO en le célula.
ChIP & Real Time-PCR § Si este mismo ensayo acopla a una Q-PCR (PCR cuantitativa) puede observarse también la cinética de unión proteína-DNA IN VIVO, es decir, se lleva a cabo el ChIP a distintos tiempos. Ejemplo: ChIP a tiempos de 0’, 20’, 40’, 60’ y 80’. Permite observar como un FT se une al promotor de SPO12 y luego, con el tiempo, deja de unirse.
También se estudia coma un FT se une a otro promotor, MCM13, y luego deja de unirse => cinética de lo que está pasando en la célula “foto a 0min”, “foto a 20min”, etc.
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 11/11/2015 ChIP & MICROARRAYS § ChIP & microarray consiste en hacer un ChIP y, además, el producto de la PCR marcarlo con un nucleótido fluorescente. Con microarrays se estudia lo que le ocurre a todo el transcriptoma de modo que, si se acopla un ChIP a este tipo de estudio, lo que se observa es lo que le ocurre a todos los genes a los cuales se une un FT o lo que es lo mismo, todos los lugares del genoma a los que una proteína puede unirse.
¿Por qué se puede observar? Debido a que aquellos genes a los cuales se una el FT, tendrán DNA fluorescente.
à Se presenta un caso en que los autores quieren saber a qué genes se une el FT (E2F), es decir, todos los genes a les que se une. De antemano ya saben a qué región se une E2F. Al realizar ChIP & microarray en rojo se observan aquellos genes a los cuales se une el FT.
MICROARRYAS DE EXPRESION vs MICROARRAYS GENÓMICOS § En microarray de expresión se tiene una región que se transcribe. Si se hace un ChIP, se marca y se hace un microarray de este tipo no se observaría nada.
¿A qué se debe este hecho? Porque el FT se une al promotor y este tipo de microarray trabaja con transcripción de genes.
§ Para acoplar un ChIP a un microarray, hace falta un tipo de microarray especial: microarray genómicos. En este tipo, los genes no presentan ORF (marcos abiertos de lectura), lo que se tiene son la regiones intergénicas à regiones donde se unen la proteínas para poderlo acoplar a un ChIP.
Bioquímica II 2n Medicina UPF-UAB 11/11/2015 PREGUNTAS TIPO EXAMEN £ £ Mediante EMSA podemos caracteriza la unión proteína-DNA in vivo.
EN los EMSAs, determinamos la especificidad de la unión mediante competiciones con DNA y mediante incubaciones con anticuerpos que inducirán “supershifts”.
£ Mediante EMSA podemos cuantificar la afinidad de un factor de transcripción por un promotor, calculando sus constantes de asociación.
£ En un Footprinting podemos cuantificar la afinidad de un factor de transcripción hacia un fragmento de DNA.
£ En un Footprinting podemos determinar la secuencia exacta de unión de un factor de transcripción a su DNA diana.
£ En un Footprinting, la sonda se puede marcar tanto en 5’ mediante T4 polinucleótido quinasa como mediante random priming (Klenow).
£ En la técnica de Footprinting, mediante digestión de DNA con enzimas de restricción podemos determinar la secuencia exacta de unión de un factor de transcripción a su DNA diana.
£ La técnica de ChIP nos permite determinar y caracterizar la unió de proteína a ácido nucleico in vitro.
£ La técnica de ChIP se puede acoplar a microarrays para determinar todos los lugares del genoma a los que una proteína puede unirse.
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