Tema 2 (2012)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 1º curso
Asignatura Biología Celular
Año del apunte 2012
Páginas 5
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 4
Subido por

Vista previa del texto

TEMA 2: VISUALITZACIÓ DE CÈL·LULES I COMPONENTS Lents òptiques: les utilitzem al microscopi òptic Lents electromagnètiques: les utilitzem al microscopi electrònic Els microscopis òptics van aparèixer al 1600 aproximadament i l’electrònic no va aparèixer fins al 1930.
Les coses més petites que bacteris no les podem veure amb microscòpia òptica, per tant hem d’utilitzar l’electrònica.
MICROSCÒPIA ÒPTICA Pot utilizar-se amb diferents tipus de filtres, anells i estratègies:  El confocal no és una estratègia del microscopi òptic ni de l’electrònic (utilitza làser) CAMP CLAR: És la forma d’utilitzar el microscopi òptic en el qual s’utilitza una bombeta com a font de llum que es concentra sobre la mostra gràcies a la lent. Els rajos de llum travessen la mostra i arriben a l’ull gràcies a unes lents de l’objectiu i a l’ocular.
Els augments que es poden aconseguir amb camp clar son entre 1000 i 1200.
 Càlcul dels augments: AUGMENTS DEL MICROSCOPI= Augments objectiu · Augments ocular AUGMENTS DE LA MICROGRAFIA A partir de l’escala de la foto…..: AUGMENTS MICROGRAFIA= Mida virtual/ Mida real *Mida virtual: centímetres de l’espècie en el paper Exercici: Exercici:  LÍMIT DE RESOLUCIÓ: Distància mínima en que dos punts separats els podem veure com a separats. Es calcula per l’Equació d’Abbé: *λ: longitud d’ona de la llum que jo utilitzo -Límit de resolució màxim teòric: 0’94 micròmetres aprox.
Exercici:  PODER DE RESOLUCIÓ: és la inversa del límit de resolució, el poder de resolució no depèn dels augments.
En camp clar és important treballar amb mostres primes i que la mostra tingui color, hi ha tres opcions: 1.Si la mostra és prima i té color no hem de fer res 2.Si la mostra és prima i no té color l’hem de fixar, tenyir i observar.
3. Si la mostra és gruixuda l’hem de tallar utilitzant un micròmetre, si la mostra és molt tova la ports incloure en una resina que la polimeritza o bé congelar-la.
CONTRAST DE FASES: En aquest cas la fase de les ones de la llum canvia en trobar-se diferents coses de diferent densitat i gruixudesa, així, no cal tenyir les mostres i per tant aquesta tècnica és important per mantenir viva la mostra.
NOMARSKI (DIC): Nomarski permet el volum en la fotografia i per tant permet manipular (s’utilitza per manipular oòcits) i treballar amb cèl·lules vives.
MICROSCÒPIA DE FLUORESCÈNCIA: Es basa en la propietat dels fluorocroms ( o proteïnes fluorescents, que són diferents tipus de molècules) . Els fluorocroms són molècules que quan s’il·luminen els seus electrons s’exciten i passen a un nivell superior, per tornar al seu estat fonamental els fluorocroms alliberen energia en forma de fluorescència. Cada fluorocrom té un espectre d’emissió característic.
El que es fa quan es duu a terme aquest procés és il·luminar la mostra (amb UV normalment) i hi ha filtres específics per a cada fluorocrom que recullen la seva fluorescència. Així podem enganxar fluorocroms a les molècules i observar estructures diverses.
MICROSCÒPIA CONFOCAL: En aquest cas s’il·lumina la mostra amb làser (d’Argó, Heli...) i a partir d’uns sistemes electrònics i un Software podem recollir la imatge enfocada en un pla determinat i rebutjar les imatges desenfocades. La confocal sol utilitzar fluorocroms simultàniament, així aquesta tècnica permet rastrejar la mostra i recollir-la en un ordinador cada pla de la mostra.
MICROSCOPI ÒPTIC CONVENCIONAL VS MICROSCOPI ÒPTIC INVERTIT El convencional s’utilitza més per observar mostres fixades i tallades, en canvi l’invertit s’utilitza més per observar cultius ja que és molt més fàcil de manipular-los.
MICROSCÒPIA ELECTRÒNICA Quan les mostres no les podem veure perquè són molt petites, necessitem observar-les amb microscopi electrònic.
En el cas del microscopi electrònic la llum té una longitud d’ona molt petita, per tant un límit de resolució molt petit i per tant un poder de resolució molt gran (molta qualitat).
Hi ha dos tipus de microscopi electrònic que generen dues imatges molt diferents: -Microscopi electrònic de rastreig: dóna volum -Microscopi electrònic de transmissió: no dóna volum El microscopi electrónic té una font de llum que és d’electrons accelerats que es disparen cap a la mostra gràcies a unes lents electromagnètiques que dirigeixen el feix d’electrons.
Microscopi electrònic de transmissió (TEM): Està format per un tub de 2 metres de llarg, a dalt de tot hi ha un tub de tungstè que s’escalfa i actua com a càtode, a baix hi ha una placa metàl·lica que actua com a ànode. La placa té un foradet i així el feix ha de passar per aquí de manera que està dirigit a través de les lents, els electrons travessen la mostra i es reflecteixen en una pantalla d’observació. En aquest cilindre hi ha el buit ja que així els electrons no es desvien.
Com es genera la imatge? Els electrons travessen la mostra i bombardegen una pantalla fluorescent on hi queda un punt blanc. Per formar la imatge necessito també que hi hagi electrons que no bombardegin la imatge. Per tant, la imatge es forma a partir d’electrons que travessen la mostra(punts blancs) i altres que no (punts negres), per tant la imatge és en blanc i negre.
Per canviar la trajectòria d’un electró necessitem que la mostra tingui un nombre atòmic molt elevat. Necessito que hi hagi llocs on passin els electrons i altres on no hi passin, sinó i ha punts blancs. Per fer que no tots els electrons passin he de tenyir la meva mostra mitjançant contrast: Consisteix en dipositar en la mostra sals de metalls pesants, així quan els electrons arribin a les zones metal·litzades no les podran travessar i canviaran la trajectòria gràcies a que hi ha un contrast a la mostra.: Hi ha substàncies que s’enganxen a molècules especifiques, així puc aconseguir contrastar les diferents regions d’una mostra biològica.
Processament de mostres Per processar les mostres s’han de fixar, deshidratar, incluir en resines i tallar-les amb micròtoms de tall molt fi. Finalment, només falta tenyir-les: Tipus de tincions en microscopi electrònic de transmissió: -Contrast amb sals formades per metalls (submergir la mostra en els colorants) -Ombrejat: consisteix en enviar sals pesants de forma obliqua a la mostra, de manera que les zones més voluptuoses tenen més sals. El que fa és el mateix que una zona i permet un relleu i fer mesures d’alçada.
-Criofractura: En aquest cas no incloc en resines ni tallo, simplement congelo la mostra i amb un ganivet la colpejo de manera que la mostra es trenca per on els enllaços són mes febles (bicapa lipídica). A continuació es fa la rèplica de la mostra i s’observa Microscopi electrònic de rastreig Aquest funciona igual que el microscopi electrònic de transmissió, el que hi ha de diferent és que en aquest cas es contrasta tota la superfície de la mostra amb metalls pesants. El “generador de barrido” envia electrons primaris a la mostra que surten rebotats i llavors genera que altes electrons propis de la mostra surtin també rebotats, són els electrons secundaris. Aquests que han rebotat a la mostra són recollits en el detector.
Les imatges del microscopi electrònic de rastreig són sempre de la superfície de la mostra, però també es pot tallar una mostra i processar-la per rastreig, però en cap cas no es pot veure l’interior.
DETECCIÓ I QUANTIFICACIÓ DE MOLÈCULES INTRACEL·LULARS: En moments determinats vull saber quin és el comportament/moviments/funció d’alguna molècula i aquesta informació els microscopis no me la donen, de manera que hem de desenvolupar estratègies diferents: Detecció de proteïnes: Es detecten mitjançant anticossos, si es genera un anticòs marcat contra la proteïna que jo vull estudiar llavors quan s’uneixin la proteïna quedarà marcada i en podrem fer el seguiment.
També es poden marcar els àcids nucleics generant una seqüència marcada que s’afegirà al DNA gràcies als enzims de restricció.
Com es marquen les molècules? 1.Radioisòtops: Són àtoms de nucli inestable que es desintegren al llarg del temps i emeten partícules energètiques o radiacions. Normalment marquem directament un precursor de la molècula que estudiem amb un radioisòtop de manera que la molècula que doni estarà en part marcada radioactivament. Quan ja hem marcat la molècula fixo les cèl·lules al microscopi i visualitzo la mostra mitjançant la radiografia, que mitjançant un paper fotogràfic amb plata, quan la mostra es desintegra emet la radiació cap a la placa i la plata es diposita als llocs on s’ha emes la radiació (on estava marcat), llavors netejo i observo les restes de plata 2.Fluorocroms: Els puc enganxar directament a un anticòs fent que el meu antigen esdevingui fluorescent.
Puc marcar proteïnes o seqüències de DNA desnaturalitzant el DNA i afegint una seqüència de DNA fluorocromat i deixant-lo enganxar per complementarietat de bases al DNA inicial.
3.Altres: -Enzims que donen un canvi colorimètric (peroxidasa), es pot veure al microscopi òptic.
-Enganxar als anticossos partícules electrodenses.
Si jo vull saber el moviment d’una molècula puc fer-ho fent un seguiment fixant cada cop cèl·lules del mateix teixit(que cada cop estaran mortes) o ho puc fer in vivo.
In vivo: En aquest cas s’observen proteïnes que són per naturalesa fluorescent, les proteïnes provenen bàsicament d’algues, fongs... Les diferents proteïnes tenen diferents espectres d’emissió i absorció. Si jo vull que la tubulina sigui verda (GFP) he de modificar el gen que sintetitza la tubulina afegint-li el gen de la green fluorescent protein, així, quan es transcrigui aquest gen la tubulina serà verda. Aquesta construcció sintètica es posa a la cèl·lula mitjançant un plasmidi i la proteïna va al lloc on li pertoqui.
Això em permet (amb els utensilis necessaris) fer el seguiment en viu mitjançant un microscopi òptic invertit i un de fluorescència que rebi la fluorescència constantment i a més , faci fotos.
FRAP: Una metodologia que s’utilitza per veure el moviment de proteïnes és el FRAP que consisteix en marcar la cèl·lula (en la membrana plasmàtica per exemple) amb una proteïna de color verd i irradiar amb un làser i eliminar la fluorescència en un lloc concret (blanqueig), si es mira al cap d’un temps i es recupera la fluorescència en aquell lloc vol dir que les proteïnes marcades amb verd s’han mogut FOTOACTIVACIÓ : Consisteix en tenir la molècula fluorescent empaquetada (en una proteïna, cèl·lula...) i quan s’il·lumina a una certa longitud d’ona es desempaqueta i s’activa la fluorescència en un lloc determinat i així puc veure si la fluorescència es mou i per tant, si la proteïna on està enganxada també.
TRANSFERÈNCIA D’ENERGIA PER RESSONÀNCIA (FRET): Consisteix en treballar amb dues proteïnes fluorescents que tenen els espectres solapats (veure diapositiva). Consisteix a marcar dues proteïnes de la cèl·lula amb verd i blau per exemple, si les proteïnes a les cèl·lula estan molt allunyades emetran llum per separat, si estan molt properes (com interaccionant o bé associades) quan excitem una proteïna la primera s’excitarà i transmetrà l’energia a l’altre proteïna i s’emetrà llum verda (la primera es BFP i la segona GFP).Això em permet veure si hi ha associacions entre proteïnes i determinar si una mateixa proteïna canvia la seva configuració(posant una proteïna fluorescent de cada color a les dues puntes i mirant si al topar amb una certa molècula emet llum verda- ha canviat de conformació- o llum blava- no ha canviat de conformació---veure diapositiva).
...