tema 3 (2) (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Santiago de Compostela
Grado Biología - 4º curso
Asignatura evolución humana y diversidad molecular
Año del apunte 2017
Páginas 4
Fecha de subida 26/06/2017
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más bien las improntas del revelado que están reflejando los lugares donde hay radiactividad y así podemos distinguir los diferentes individuos.
Cualquier fallo en cualquiera de las fases no sale. Es un proceso largo y tedioso.
APLICACIONES. LIMITACIONES La ventaja es que yo puedo acceder a cualquier región del genoma, cualquier parte del genoma es susceptible de diseñar una sonda específica y poder ver la variabilidad.
Se puede analizar regiones expresivas y no expresivas, regiones moduladoras, regiones promotoras… cualquier región del genoma Se puede analizar directamente la variabilidad real del genoma, por lo tanto permite reflejar la variabilidad del genoma Se puede analizar simultáneamente varias regiones del genoma siempre y cuando incorpore ligandos alternativos a la sonde de hibridación Las limitaciones son que es un proceso costoso (económicamente caro). En estudios masivos no se adecua bien, porque al ser un proceso lento y gradual no se pueden coger veinte o 30 individuos a la vez. También está el inconveniente de la radiactividad.
La variabilidad puede pasar desapercibida, porque estamos utilizando una enzima de restricción determinada. La variabilidad que pasa desapercibida cuando aplico el enzima 1 requiere usar otro enzima, y así más veces. Si queremos reflejar toda la variabilidad nucleotídica de un gen por ejemplo, tendremos que aplicar numerosas enzimas de restricción.
Esto lo hace aún más complejo y más tedioso. La diana de restricción lo que hace es tantear un único punto, el resto pasa desapercibido La aplicación requiere una cuestión fundamental, repensar ese modelo y remodelarlo para que pueda ser utiliza en estudios masivos Ha habido modificaciones y adaptaciones, y ha cambiado en lo que corresponde a la metodología general. Ha cambiado de objetivos La realidad es que no da banda discretas, sino que da improntas. Se deteriora la resolución (electroforesis, transferencia a bloting y transferencia a membrana) TEMA 3 RLFPs 5 Hay más limitaciones porque no da bandas discretas, sino improntas que se pueden diferenciar, pero la resolución se deteriora porque hacemos transferencia a electroforesis, luego a blotting y luego a membrana fotográfica y la banda inicial pueden encontrar que al finalizar todo el proceso tenemos improntas. Puede haber individuos conflictivos en los que no se aprecia la diferencia entre bandas PCR- RLFP A finales de los años 80 se inicia la PCR. La PCR permite tomar cualquier región del genoma, acotarlo mediante unos primers y efectuar una amplificación de esa región acotada. No se requiere la utilización de sodas, se elimina estar parte. Se puede hacer una amplificación de cualquier región. Tengo una libertar de elección amplísima. Yo diseño las condiciones. Al cabo de 30 ciclos se tienen millones de copias de esa región, de cada región concreta 2n copias (por célula de DNA) Vamos a suponer que parto de la extracción del DNA, de 0.1 mL de sangre total. La extracción de DNA a partir de leucocitos. Si yo parto de ese DNA y efectúo una PCR ¿Cuántas copias tendré tras efectuar la PCR? Tendré que saber el número de leucocitos (4 o 5 mil por microlito), esto se multiplica por los mL que tenemos y por 2n TEMA 3 RLFPs 6 Esto permite desarrollar la estrategia PCR/RFLP. Tenemos el DNA, hacemos PCR del DNA que queremos analizar, hacemos amplificación y tenemos 2n copias. Tenemos que utilizar el enzima de restricción adecuado en la zona que queremos y la diferencia en este caso, consiste en que todo el DNA está en copia sencilla, pero el fragmento que queremos analizar está en mucha proporción, de manera que el DNA no analizado está presente, pero en tan mínima cantidad que no se aprecia en el gel de electroforesis y se simplifica el análisis. Esto tiene otra ventaja, ya que el bandeado de la electroforesis corresponde con el mapa de restricción. Ahora tenemos bandas discretas que pueden ser de mayor o menor resolución. Si necesitamos mucha resolución por tener bandas muy próximas utilizamos un gel de poliacrilamida (PAGE), pero si no necesitamos mucha resolución usamos agarosa.
Esto permite simplificar enormemente y tenemos una tinción con bromuro de etidio (agarosa) o silver staining (PAGE) y tenemos el mapa de restricción. Así, conseguimos imágenes muy nítidas. Esto implica mayor capacidad de resolución, simplificación, ahorro económico, no radiactividad, fiabilidad y consistencia en la interpretación de los mapas de restricción Este método ya permite hacer estudios masivos (screening) Esta PCR permite analizar una región específica. Después hacemos una tinción Esto hoy en día se aplica con mucha frecuencia La segunda parte del genoma humano es para darle significado a las regiones nucleotídicas y ver su importancia biológica La detoxificación. Como mammalia que somos tenemos el reflejo en nuestro genoma de la evolución histórica, el ambiente está interaccionando con el individuo. Un xenobiótico son sustancias químicas ajenas al individuo que dentro de la célula actúan por similitud como si fueran agentes naturales, por ejemplo protocancerígenos. A lo largo de los años de la evolución los genomas de los diferentes seres vivos se han ido depurando y desarrollando una maquinaria detoxificante y protectora (es necesario un tiempo evolutivo amplio) Los organofosforados (fertilizantes) es un xenobiótico nuevo que aparecen en nuestro entorno y para los que todavía no estamos bien preparados. Algún grupo de ellos van a ser metabolizados por la SOD II, esto significa que en la medida que entra un organofosforada en la célula esta dispone de mecanismos capaces de metabolizarlos, inactivarlos y eliminarlos. Es un protocancerígeno TEMA 3 RLFPs 7 Mutaciones en la SOD II puede provocar que no metabolice el xenobiótico. Esto significa que los individuos expuestos a organofosforados y sean portadores de la mutación pertenecen a grupos de riesgo. Los tejidos diana son la vejiga y la próstata. Tenemos que saber como expresan los alelos (homo o heterocigoto). A priori no se sabe quien es el grupo de riesgo, tendré que efectuar ensayos enzimáticos para comprobar esto. El grupo de mayor riesgo corresponde al homocigoto que expresa los dos alelos con la mutación (2.25% de la población). El heterocigoto presenta una detoxificación parcial, es de menor riesgo pero también de riesgo. El número de años, la dosis y el tiempo transcurrido van a influir. El 25% de la población son heterocigotos Si yo quiero analizar una mutación concreta tengo que saber en que región está. Se va a las bases de datos del proyecto genoma humano para conocer la secuencia nucleotídica. Lo que se quiere hacer es diseñar unos primers que acoten la zona que yo quiero analizar y después hay que seguir el resto de los pasos (esquema pág. 6) DNA FINGERPRINTING Se hablará más adelante TEMA 3 RLFPs 8 ...

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