Resum tema 6 (2016)

Resumen Catalán
Universidad Universidad de Girona (UdG)
Grado Biología - 3º curso
Asignatura Biologia Molecular
Año del apunte 2016
Páginas 5
Fecha de subida 28/04/2016
Descargas 19
Subido por

Vista previa del texto

RESUM BIOLOGIA MOLECULAR Marta Galceran TEMA 6: LA TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINAT Clon: ésser idèntic a partir d’un d’origen. Organisme en que s’ha introduït un genotip nou, aquest forma una colònia (tots aquests tindran el mateix genotip que el recombinat i serà diferent a la resta de colònies que no provenen d’aquest organisme).
Clonatge: introduir un segment de DNA forani dins d’un organisme.
DNA introduït: molècula de DNA recombinat  unió covalent de dues molècules de DNA d’orígens ≠.
Una d’aquestes seqüències és un vector format per DNA plasmídic + insert. L’altre DNA té el gen que ens interessa.
Els vectors han de tenir:    Mecanisme d’inserció fàcil dins la cèl·lula hoste.
Capacitat de replicar-se juntament amb l’hoste, de manera autònoma (orígens de replicació propis).
Selecció de les cèl·lules que porten aquest vector.
Tractem el DNA i el vector:   Amb els mateixos enzims de restricció per tenir extrems compatibles (cohesius).
DNA lligasa: per la reacció de lligament, fa unions covalents.
Obtenim molècules recombinants que serà el que introduïm dins l’hoste. Caldrà seleccionar aquelles que hagin incorporat el DNA recombinat.
El vector és específic per un determinat hoste i és el que determina quin hoste utilitzarem. Podem posar DNA eucariota en una cèl·lula procariota sempre que tinguem el vector adequat.
Hi ha cèl·lules que han incorporat el vector i altres no. Dos tipus d’estratègies de selecció:   Resistència a antibiòtics, drogues citotòxiques o drogues genotòxiques: incorporar en el vector un gen que confereixi resistència a l’antibiòtic o verí.
Síntesi d’aminoàcids (auxotròfia): incapaços de sintetitzar un aa concret (els hi falta un gen). En el vector hi ha un gen que permet al bacteri sintetitzar aquest aa. Cultivem les cèl·lules en medi mínim i només sobreviuran les cèl·lules que hagin incorporat el vector.
Obtenció de molècules de DNA recombinat.
DNA lligasa: enzim que genera enllaços fosfodièster entre els grups hidroxils i fosfat (segments de DNA amb extrems compatibles). Lligasa necessita un cofactor (adenina). Lligasa té en el centre actiu una lisina amb grup –NH (enllaç altament reactiu), pot unir-se covalentment amb cofactor prostètic per ser activa: AMP (prové de l’ATP).
ATP  AMP-enzim + PPi. Lligasa + AMP = activa  osca de DNA i PPi s’allibera. Atac nucleofílic que lliga els extrems.
1 RESUM BIOLOGIA MOLECULAR Marta Galceran Es pot produir lligament amb extrems cohesius (compatibles) i extrems roms, però és més difícil que es trobin.
Vector d’extrems cohesius i barreja amb altres molècules de DNA. L’extrem s’unirà a la molècula que tingui els extrems cohesius complementaris.
Han de ser complementaris amb els extrems del vector  tall amb enzims isocaudòmers  talla diferents seqüències però els extrems cohesius seran els mateixos.
(seqüències polylinquer) Vector ha d’entrar dins la cèl·lula, replicar-se i poder-se seleccionar. Vector ha de tenir seqüències intocables per que el plasmidi no perdi la seva funció. Vector amb origen de replicació compatible amb el de l’hoste.
Seqüències polylinker (MCS: multitoning site): gran quantitat de dianes de restricció úniques (sense fer malbé la resta del vector, que no es talli per varis llocs), permetre la inserció del DNA forani per evitar que s’insereixi en una seqüència important (serà on s’introduirà l’insert). Vector amb el mateix origen de replicació que la cèl·lula hoste.
Modificar un MCS per obtenir dianes de restricció d’interès. Calen dos oligonucleòtids (un reprodueix moltes dianes de restricció i el complementari amb extrems no aparellats).
Cal sintetitzar l’encebador i també l’encebador complementari a aquest fragment. Tindrem dos extrems 5’ cohesius i lliures =, però no complementaris.
A 95ºC es desnaturalitza i ell refredem a poc a poc, els oligonucleòtids s’uneixen de nou. Segment de DNA bicatenari, excepte fragments 5’, monocatenaris i cohesius. Aquest vector obté les noves dianes de restricció (que hem inclòs).
Transferasa terminal afegeix nucleòtids a l’atzar a 3’ sense motlle. Pot actuar en ssDNA (més eficaç) i dsDNA.
Exonucleasa del fag  (virus) talla dsDNA des de 5’ i elimina nucleòtids d’un fragment bicatenari. Queda cadena monocatenaria a l’extrem 5’, així pot treballar la transferasa terminal.
Afegim nucleòtids d’un sol tipus (adenina) es forma una cua de poli-A als extrems monocatenaris. Cues són complementaries. Afegim transferasa terminal amb dTTP, formarà cua complementaria.
Afegim polimerasa per emplenar els llocs buits (còpia) i lligasa per unir els forats.
Generar extrems cohesius a partir d’extrems roms.
Linker: molècula petita de DNA bicatenari, produeix una determinada diana de restricció.
Afegim linkers, amb lligasa (pot lligar fragments roms, ≠ molècules de linkers en tàndem a banda i banda) i el fragment de DNA. Linker es lligarà als extrems i formarà extrems roms. Digestió amb l’enzim de restricció (correspon a la diana de linker) i quedaran extrems cohesius monocatenaris.
El DNA també pot tenir dianes per aquest enzim, procariotes tenen les dianes per destruir el DNA forani, però no talla el DNA propi. 1r tractar el DNA amb metil transferasa  l’enzim ja no tallarà dins del gen, abans d’afegir el linker, perquè sinó metilarà tot i l’enzim no tallarà per enlloc.
2 RESUM BIOLOGIA MOLECULAR Marta Galceran Tallar el vector amb l’enzim de restricció, els extrems són compatibles i dóna lloc a la molècula de DNA recombinant.
 Associacions del propi insert intramoleculars: els extrems de l’insert són compatibles entre ells que es poden unir entre el mateix fragment i formar una molècula circular; o intermoleculars: en tàndem en molècules lineals, no es repliquen.
 Associacions del vector intramolecular: formació d’un vector re-circularitzat; o intermoleculars: unió  amb altres vectors (molècules circulars).
Associacions insert-vector: unir el vector amb l’insert (rDNA buscat) o unir-se amb varies molècules d’insert.
Es poden replicar, clons de DNA recombinat.
1. Relació de concentració vector/insert: Vector/insert = molt alt  afavoreix reaccions intramoleculars, molt DNA recircularitzat (2), no els volem.
Vector/insert = molt baix  afavoreix concentració d’inserits, lligament sobre si mateix en tàndem (1), no els volem.
Condicions equimolars: obtenim el DNA que volem.
2. Temperatura i temps de reacció: 37ºC: temperatura òptima per l’enzim, amb una hora no hi hauria aparellaments.
Cal Tª òptima de treball de l’enzim i una Tª que afavoreixi l’aparellament de bases (extrems cohesius).
A 18ºC l’enzim té poca activitat, cal molt de temps, però ens assegurem l’aparellament. Si volem extrems roms a 25ºC ja fem perquè la Tª no influeix en la capacitat d’unió de les dues molècules.
3. Puresa dels fragments a unir: Multitud d’inserts ≠, però només ens interessa 1.
Elimina els grups fosfats a 5’ i obtenim extrems OH lliures a 3’ i 5’, lligasa no podrà actuar (no es tancarà sobre si mateix).
L’insert sí que té fragments de fosfats, es podrà unir amb el vector. P a 5’ de l’insert es pot unir al OH de 3’ del vector.
3 RESUM BIOLOGIA MOLECULAR Marta Galceran Tallar el vector i l’insert amb dos enzims de restricció ≠, eliminació d’un fragment molt petit del vector.
Extrems cohesius (extrems del vector) no seran compatibles, no es re-circularà. L’insert té 2 dianes de restricció i compatibles amb el vector, la diana de l’insert s’unirà a la diana compatible del vector.
Diferents enzims de restricció que generaran els mateixos talls cohesius. Cues generades compatibles entre elles.
Insert + vector: queda un híbrid entre les dues dianes que no és reconegut ni per l’enzim A ni pel B.
Detectar la presència de recircularitzats amb enzim lacZΔM15. β-galoctidasa: proteïna globular, extrems de la proteïna permeten la unió dels dos dímers, el centre actiu es troba entre els dos dímers (N-terminal), si aquests no s’uneixen la proteïna no es pot unir.
Soca mutant E. coli lac-: deleció dels primers 40-50 residus (fragment α). Falta el segment que permet que les subunitats s’uneixen  ens carreguem el centre actiu. Síntesi d’α-galoctidasa pèptid de 30 aa que correspon al fragment que falta.
α-complementació: barreja de la proteïna no activa amb els fragments solts (pèptid de 40-50 residus), unió no covalent  enzim actiu. Saber quines colònies són relligats i quines inserts.
Polylinker (dins del fragment α) que conté el gen lacZ.
X-GAL (sucre): dóna un producte hidrolitzat de color blau. Cèl·lules lac+ la β-galoctidasa degradarà l’X-GAL i les farà blaves. Les cèl·lules lac- quedaran blanques, distingit les cèl·lules que han recombinat.
Digestió del vector amb polylinker, afegim insert i lligasa  que el vector relligui i incorpori l’insert:   4 Si el vector relliga incorpora l’insert en el segment α, cèl·lules creixeran en presencia d’Amp i seran lac+ (recuperat lacZ), color blau (amb X-GAL).
Si el vector no relliga no tindrà el segment α de lacZ, cèl·lules lac-. Les que siguin recombinants creixeran en presencia d’Amp, color blanc (no hidrolitzen el X-GAL).
RESUM BIOLOGIA MOLECULAR Marta Galceran Isocaudòmer: enzims de restricció que reconeixen ≠ dianes, però generen els mateixos enzims cohesius(mateixes cues).
1. Digestió del vector i l’inserit amb dos enzims de restricció ≠ isocaudòmers.
2. Lligament en presencia de l’enzim A i la lligasa.
3. Tallar els vectors en tàndem, la diana reconstruïda no serà reconeguda. Si tenim tàndems les cèl·lules no es podran replicar, ja que tenen diverses dianes de restricció.
Fem 2 lligaments. Lligament en presència d’un enzim de restricció que només talla l’inserit. Inserit amb una sola diana de restricció i el vector no la té, evitarem la formació de tàndems.
1.
2.
3.
4.
Digestió del vector i l’inserit amb l’enzim de restricció A.
Lligament Digestió amb l’enzim B.
Purificació i relligament: separem segons el pes molecular, vector de la mateixa mida, els inserts correran més o menys segons si hi ha un o més units. Reconstruir l’insert, agafem el primer tall i l’unim a l’últim per tenir el mateix fragment inicial.
Clonatge direccional: no evita tàndems. Lligament d’inserts al revés, apareixen tàndems.
Topoisomerases I: canvien el número d’enllaç, al centre actiu hi ha una tirosina amb grup –OH, trenca l’enllaç fosfodièster.
Vectors de clonatge: extrem cohesiu amb una tirosina unida a un grup fosfat i a una topoisomerasa. Atac nucleofílic sobre la mateixa proteïna per tornar a tenir dsDNA.
S’utilitza per clonar productes de PCR, la DNA polimerasa afegeix A addicionals 3’ a les dues cadenes en creixement per que acabi la seva activitat. El producte de la PCR és complementari al vector. Tac polimerasa afegeix A abans de saltar.
Evita relligats i tàndems (extrems cohesius, però no complementaris).
Desavantatge: és que s’han de comprar els vectors.
5 ...