Tema 13. (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Complutense de Madrid (UCM)
Grado Farmacia - 3º curso
Asignatura Microbiologia I
Año del apunte 2016
Páginas 5
Fecha de subida 20/06/2017
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    Tema  13:  Variabilidad  genética  en  microorganismos:  mutación     Características  del  material  genético   §  Estable   §  Transmisión  de  la  información  a  la  progenie  (heredable)   §  Expresión  de  la  información   §  Variabilidad  genética  (espontánea  o  inducida):   -­‐  Mutación  (cambio  en  el  DNA)   -­‐  Recombinación  (combinación  de  DNAs)   Cuando  una  bacteria  se  divide  por  reproducción  vegetativa,  las  dos  células  hijas  obtienen  exactamente  el   mismo  genoma.     En  una  de  estas  divisiones,  una  base  de  todo  su  genoma,  la  DNA  polimerasa  puede  introducir  una  base   errónea.  Es  un  mutante  asimétrico,  porque  solo  una  de  las  células  de  la  progenie  hereda  la  copia.  En  general   es  un  proceso  negativo.  Si  no  es  un  problema,  esta  mutación  seguirá  estando  en  la  progenie.   Sin  embargo,  el  mutante  puede  tener  una  ventaja  selectiva  frente  a  los  demás  individuos  de  su  especie   (ventaja  selectiva).  Esto  es  el  motor  de  la  evolución.     Tasa  de  mutación   Para  que  se  produzca  una  mutación,  la  DNA  polimerasa  debe  cometer  un  error  que  no  se  corrija.  Esto  no  es   muy  común.     La  tasa  de  mutación  es  la  probabilidad  de  que  tenga  lugar  una  mutación  en  un  gen  determinado  en  el   transcurso  de  una  generación  (10-­‐6-­‐10-­‐8).  Depende  de:   -­‐  El  microorganismo.  Un  virus  RNA  evoluciona  muy  rápido,  muta  mucho.   -­‐  Las  condiciones  de  crecimiento.  En  condiciones  favorables,  la  DNA  polimerasa  no  se  suele  equivocar.  En   condiciones  límite,  la  bacteria  aumenta  la  tasa  de  mutación  a  propósito,  para  ver  si  así  puede  salir  de  las   condiciones  desfavorables.   -­‐  La  región  del  genoma  (hot  spots).  En  los  hot  spots  son  donde  se  acumulan  las  mutaciones,  porque  haya   muchos  pares  CG  (muchos  puentes  de  hidrógeno),  etc.       Frecuencia  de  mutación   Probabilidad  de  que  un  individuo  en  una  población  sea  mutante.     Alelo   En  procariotas  no  hay  ploidía,  solo  tienen  un  cromosoma.  Si  se  compara  un  gen  en  una  estirpe  y  se  busca  el   mismo  gen  en  otra  especie,  se  ven  subespecies.     Los  alelos  silvestres  son  el  estado  normal  y  funcional  del  gen.  La  proteína  producida  será  funcional.   El  alelo  mutante  es  el  erróneo,  que  puede  ser  una  ventaja  o  un  perjuicio.  La  mutación  se  puede  apreciar   objetivamente  o  no.  Si  no  se  puede  apreciar,  no  tenemos  un  fenotipo.     El  mutante  puede  ser  de  pérdida  de  función  o  de  ganancia  de  función.   Si  tenemos  un  gen  mutante,  se  ve  qué  función  hacía  el  gen  (qué  fenotipo  tiene).     El  fenotipo  son  las  características  apreciables  derivadas  de  la  interacción  del  ambiente  con  el  genotipo.  Puede   ser  silvestre  o  mutante  (ventaja  o  perjuicio).  Revela  la  función  del  gen  afectado.   El  genotipo  es  el  conjunto  de  genes  que  contiene  una  célula  (constitución  genética).     La  nomenclatura  de  genes  se  hace  con  3  letras  en  cursiva  minúscula  y  una  última  letra  en  mayúscula.   Normalmente  solo  se  anotan  las  mutaciones,  se  asume  que  el  resto  son  genes  silvestres.  El  silvestre  se  anota   con  3  letras  minúsculas  y  la  cuarta  letras  mayúscula  que  suele  indicar  un  gen  del  operón.  Si  hay  una  mutación,   esas  letras  van  seguidas  de  algo  más.  Es  la  anotación  del  genotipo.   El  fenotipo  son  3  letras  sin  cursiva;  es  +  si  es  silvestre  y  -­‐  si  es  mutante.       Tipos  de  mutaciones   Mutaciones  genómicas/cromosómicas:  macromutaciones.  Implican  recombinación.  Son  grandes  inserciones,   delecciones,  translocaciones,  inversiones,  duplicaciones,  etc.     1       Mutaciones  génicas:  micromutaciones.  Mutaciones  puntuales  fuente  de  error  de  la  copia  por  parte  de  la  RNA   polimerasa.   §  Inserción:  se  inserta  una  nueva  base   §  Delección:  se  elimina  una  base   §  Sustitución:  se  cambia  una  base  por  otra   Si  hay  un  cambio  en  el  operón  de  la  biosíntesis  de  histidina,  puede  provocar  la  pérdida  de  función  (no  se   sintetiza  histidina).     Si  la  mutación  ocurre  en  el  promotor,  puede  perderse  la  posibilidad  de  que  se  una  la  RNA  polimerasa.  No  se   expresa  ningún  gen  posterior.   Si  la  mutación  afecta  al  operador  (al  que  se  une  el  represor),  el  represor  no  lo  reconoce  y  se  pierde  la   capacidad  de  represión.  Hace  que  los  genes  se  estén  sintetizando  siempre.       §  A  nivel  de  función:  silenciosa,  cambio  de  función,  pérdida  de  función.   §  A  nivel  del  código  genético:  silenciosa,  sin  sentido,  cambio  de  sentido  (conservador  y  radical).     Hay  mutaciones  silenciosas  desde  el  punto  de  vista   fenotípico  porque  puede  ser  la  misma  secuencia  para   el  mismo  aminoácido  (degeneración  del  código   genético)  o  puede  darse  en  una  parte  que  no  se   codifique.  La  proteína  que  tiene  la  mutación  no   cambia.     La  mutación  puede  tener  las  bases  de  un  codon  de   stop  (mutación  de  pérdida  de  función).  Suele  ser   bastante  letal.  Es  la  mutación  sin  sentido.     Lo  más  normal  es  que  el  cambio  sea  de  un  codon  a   otro  con  una  codificación  distinta.  Tenemos  la  misma   proteína  pero  con  un  aminoácido  diferente  en  una   parte.  El  fenotipo  de  esta  mutación  depende  de  lo   importante  que  sea  el  aminoácido.     Una  deleción  será  más  grave  que  una  sustitución  si   ocurre  dentro  de  un  gen  estructural.  El  código  se  lee   en  tripletes,  por  lo  que  cambiará  el  marco  de  lectura.  La  probabilidad  de  que  aparezca  un  codon  de  stop  es   alta.  Estos  cambios  suponen  una  inactivación  del  gen.   Si  el  error  es  eliminar  o  insertar  3  bases,  el  cambio  no  sería  tan  grave  porque  no  se  pierde  el  marco  de  lectura.   Se  ha  insertado  o  eliminado  solo  un  aminoácido.  La  proteína  se  producirá  entera,  pero  con  un  aminoácido   más  o  menos.  Es  menos  dañino  para  el  código  que  la  inserción  o  deleción  de  1  base.       Tipos  de  mutaciones  según  las  consecuencias  fenotípicas:   §  Mutación  letal  (genes  indispensables)   §  Mutación  condicional:  mutantes  termosensibles  o  criosensibles.   §  Mutación  estructural  (cápsula,  movilidad,  etc)   §  Mutación  morfológica:  problemas  de  crecimiento,  forma  de  la  célula,  color,  etc.   §  Resistencia/sensibilidad  a  compuestos  químicos  o  fenómenos  físicos:  resistencia  a  antibióticos,  metales   pesados,  desinfectantes,  hipersensibilidad  a  algo,  etc.   §  Nutricional:  biosíntesis  (auxótrofos),  degradación.   No  todos  los  genes  del  genoma  son  indispensables,  pero  otros  sí,  como  el  metabolismo  primario.  El  fenotipo   de  una  mutación  en  un  gen  esencial  es  la  muerte  (inviable).     Una  mutación  condicional  termosensible  es  una  mutación  en  un  gen  esencial  que  no   impide  su  funcionamiento  a  temperatura  óptima,  pero  a  temperatura  subóptima  no  se   pliega  bien  la  proteína,  no  funciona.  Hay  una  pérdida  de  función  y  letalidad  condicional   (solo  a  temperaturas  subóptimas).  Permite  tener  mutantes  en  genes  esenciales,  que   cambiando  la  temperatura  de  cultivo,  condiciona  la  viabilidad  del  organismo.         2       Recuperación  del  fenotipo  silvestre   Son  mutaciones  que  devuelven  el  fenotipo  silvestre.     •  Reversiones:  ocurre  una  segunda  mutación  que  recupera  el  fenotipo  silvestre.  Se  da  exactamente  en  la  base   en  la  que  había  una  mutación.  Este  individuo  acumula  2  mutaciones  frente  al  organismo  general.     o  Reversión  directa:  UUA  (Leu)  à  UUC  (Phe)  à  UUA  (Leu).  Se  recupera  el  fenotipo  y  el  genotipo.   o  Reversión  equivalente:  UUA  (Leu)  à  UUC  (Phe)  à  UUG  (Leu).  Se  recupera  el  fenotipo,  pero  no  el   genotipo.   •  Mutaciones  supresoras  intragénicas:  no  se  da  en  la  base  en  la  que  había  la  primera  mutación.  La  segunda   mutación  hace  que  la  proteína  vuelva  a  ser  funcional.  La  proteína  acumula  2  mutaciones,  es  una  proteína   más  funcional  que  la  que  tenía  solo  una  mutación.   •  Mutaciones  supresoras  extragénicas:  es  una  segunda  mutación  que  recupera  el  fenotipo  silvestre  en  un  gen   distinto  al  gen  en  el  que  ocurrió  la  primera  mutación.  Hay  alguna  relación  funcional  entre  los  dos  genes,  por   ejemplo  activadores  y  supresores.     o  Supresores  sin  sentido  (tRNA):  la   segunda  mutación  ocurre  en  un   tRNA  y  la  primera  mutación  produjo   un  codon  sin  sentido.  La  segunda   mutación  afecta  a  una  parte  del   genoma  de  genes  que  codifica  para   un  tRNA.  Este  tRNA  que  introduce   un  aminoácido,  reconoce  codones   de  stop.  Para  todas  las  proteínas   que  tuvieran  un  codon  de  stop,  este   tRNA  introduce  un  aminoácido,  en  vez  del  codon  de  stop.     o  Supresores  fisiológicos:  Un  gen  está  en  modo  silvestre  y  está  sometido  a  regulación.  Un  represor  es  una   proteína,  codificada  por  un  gen,  que  puede  estar  en  otra  parte  del  genoma.  Imaginamos  que  ese  represor   además  está  regulado  negativamente  por  otro  elemento.  Este  regulador  del  represor  es  también  una   proteína,  y  estará  codificado  por  otro  gen.  Imaginamos  que  muta  el  regulador  negativo  del  represor.  Lo   que  ocurre  es  que  el  represor  no  tendrá  quien  lo  controle,  y  por  tanto  ese  gen  no  se  va  a  expresar  nunca   porque  el  represor  hace  que  no  se  exprese  nunca  porque  el  represor  no  está  regulado  negativamente.  Si   ocurre  tras  esa  mutación  una  segunda  mutación  que  inactive  al  represor,  lo  que  ocurre  es  que  se  acaba  la   represión,  y  el  gen  se  va  a  expresar  sin  ningún  control.  Si  mi  fenotipo  era  la  expresión  de  ese  gen,  tras  estas   dos  mutaciones,  recupero  el  fenotipo  salvaje.     Complementación  en  trans   Se  produce  cuando  tenemos  2  copias  del  mismo  gen  en  la  célula.  Una  es  mutante  y  si  otra  es  silvestre,  la   silvestre  es  dominante  sobre  la  mutante.  La  silvestre  complementa  la  mutación  del  sistema.  Muchas  veces   está  en  otra  molécula  de  DNA.   Si  hay  dos  copias  mutantes  en  el  mismo  gen,  las  dos  copias  están  inactivadas  y  no  se  pueden  complementar.         3       Obtención  de  mutantes  en  el  laboratorio:  mutación  +  selección   Se  puede  aumentar  la  tasa  y  frecuencia  de  mutación  con  mutágenos.  Los  mutágenos  hacen  que  la  DNA   polimerasa  se  equivoque  mucho.  Hay  mutágenos  químicos,  radiaciones  y  biológicos.  los  biológicos  son   porciones  de  DNA  que  se  insertan.   Los  mutágenos  químicos  funcionan  como:   -­‐  Agentes  intercalantes:  moléculas  que  encajan  en  la  doble  hélice  y  estorban   a  la  polimerasa.   -­‐  Análogos  de  bases:  son  iguales  que  las  bases  nitrogenadas,  pero  tienen   una  parte  diferente.  Se  incorpora  el  análogo  en  el  DNA,  que  luego  no  se   aparea  con  la  base  habitual.  Genera  una  mutación,  que  se  produce  en  la   segunda  generación,  cuando  se  copie  la  cadena.     -­‐  Agentes  alquilantes:  modifican  las  bases.   -­‐  Ácido  nitroso,  hidroxilamina.   Las  radiaciones  que  se  usan  son  las  UV.  Las  ionizantes  no  se  usan  mucho,  porque   son  peligrosas.  Las  bacterias  absorben  la  luz  y  cuando  hay  2  timinas,  la  luz  forma   dos  enlaces  entre  los  anillos,  formando  un  ciclobutano  (dímero  de  timina).  Si  las   bacterias  se  mantienen  en  oscuridad  y  no  les  vuelve  a  dar  la  luz,  la  unión  no  se   resuelve     Además  necesitamos  un  criterio  para  seleccionar  los  mutantes.     Si  buscamos  una  ganancia  de  función,  se  usa  una  selección  directa  (positiva).  Se  cogen  las  células  que  han   sobrevivido  a  la  mutagénesis  y  se  cultivan  en  un  medio  de  presión.  el  mutante  será  el  único  clon  que  crezca   en  la  placa.  Se  usa  la  resistencia  a  ntibióticos,  inhibidores  químicos,  etc.   Es  fácil,  no  se  necesita  enriquecimiento.  La  dificultad  es  encontrar  la  condición  óptima  del  agente.     Si  nos  pasamos  mutando,  tendremos  demasiadas  mutaciones.   Necesitamos  la  dosis  necesaria  para  generar  las  mutaciones  que   queremos  sin  matar  a  los  organismos.  Se  cogen  distintos  tiempos  de  la   mutagénesis  y  se  cuentas  las  células  que  sobreviven.     Hay  que  trabajar  en  un  punto  en  el  que  aparezcan  no  muchas   mutaciones  de  fondo.  Son  condiciones  poco  drásticas,  pero  suficientes   para  generar  las  mutaciones  que  queremos.     Si  el  fenotipo  del  mutante  es  de  pérdida  de  función,  el  método  de  selección  será  indirecta  (negativo).  Hay  que   examinar  un  gran  número  de  colonias.  Se  generan  miles  de  colonias  en  un  medio  nutritivo  en  una  torre  de   placas  y  pasar  las  colonias  por  el  replicador  a  dos  medios:  original  y  medio  que  dice  el  genotipo.  Así  sabemos   cuáles  son  las  colonias  buscamos.  Las  colonias  quedan  en  la  misma  posición  original,  se  buscan  las  colonias   que  están  en  una  placa  y  faltan  en  otra.       4       Después  de  la  mutagénesis,  se  hace  crecer  a  las  células  en  un  medio  sin  histidina.  Además,  tiene  un   antibiótico  bactericida,  como  la  penicilina.  El  antibiótico  tiene  como  diana  las  enzimas  que  construyen  la   pared  celular.  Las  células  se  lisan  porque  no  tienen  pared  celular.  esto  solo  ocurre  en  el  caso  de  las  células   que  crezcan.  Es  inmune  al  antibiótico  los  mutantes  porque  si  tienen  una  mutación  en  la  histidina  y  se  ponen   en  un  medio  sin  histidina,  no  pueden  crecer,  pero  tampoco  se  mueren.  El  antibiótico  no  pueden  matar.  El   antibiótico  mata  a  los  que  crecen  (los  no  mutantes).  Tenemos  menos  clones  supervivientes,  pero  de  ellos,   habrá  mayor  proporción  de  bacterias  mutantes.     Prueba  de  Ames:  estudios  de  carcinogenicidad   Se  puede  poner  el  compuesto  de  hígado  de  rata  con  celulosa  y  se  ve  si  aparecen  más  mutantes  entorno  al   disco.  Si  se  aumenta  la  tasa  de  reversión,  aumenta  el  número  de  colonias  alrededor  del  disco.   Todos  los  aditivos  que  llegan  a  la  cadena  alimentaria  humana  tienen  que  demostrar  que  no  son   carcinogénicos,  es  decir,  cancerígenos.  Si  es  carcinógeno  es  porque  es  mutagénico,  hace  que  aumente  la  tasa   de  mutación.  Lo  que  se  hace  es  ensayar  ese  compuesto  con  una  bacteria,  y  se  emite  una  tasa  de  reversión.   En  definitiva,  esta  prueba  es  un  análisis  de  la  tasa  de  reversión  de  cepas  de  Salmonella  Typhimurium  con   mutaciones  en  el  operón  de  biosíntesis  de  histidina  y  defectos  en  reparación  del  DNA  y  en  pared  celular  (más   permeables).   La  Salmonella  es  un  auxótrofo  para  histidina  (no  la  sintetiza),  y  esto  puede  revertir,  así  que  yo  voy  a  buscar   revertientes,  que  pase  de  His-­‐  a  His+,  de  mutante  a  silvestre.  Yo  mezclo  la  Salmonella  con  el  carcinógeno  y   esto  lo  siembro  en  un  medio  sin  His,  de  forma  que  no  va  a  crecer  a  no  ser  que  mute,  que  revierta.  Cuanto  más   cancerígeno  sea,  más  reversiones  habrá  y  más  crecerá;  si  el  compuesto  es  muy  carcinogénico  salen  muchos   revertientes.   Muchas  veces  se  añade  a  ese  compuesto  extracto  de  hígado  de  rata  para  ensayarlo.  Esto  es  porque  puede   que  el  compuesto  en  sí  no  sea  carcinógeno,  pero  puede  ser  que  al  metabolizarse  sí  sea  cancerígeno.  Al  añadir   estas  enzimas  hepáticas,  podemos  ver  si  esto  es  así  o  no.   Lo  que  también  se  puede  hacer  es  poner  el  compuesto  en  un  disco  de  celulosaimpregnado  de  la  sustancia  a   estudiar  y  ver  si  entorno  a  ese  disco  aumenta  la  tasa  de  mutación.  Si  crecen  más  alrededor  del  disco,  es  que   he  puesto  algo  mutagénico.     *En  la  imagen,  el  primer  tubo  de  ensayo  corresponde  al  control,  sin  añadir  el  agente  que  vamos  a  estudiar.  En  el  segundo   tubo  se  añade  ya  el  agente,  y  en  el  tercer  tubo  se  añade  más  cantidad  del  agente.  En  la  foto  en  blanco  y  negro  vemos  el   ejemplo  de  los  discos  de  celulosa  impregnados       5   ...

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