Pràctiques microbiologia (MB) (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Microbiología - 1º curso
Asignatura Microbiologia
Año del apunte 2016
Páginas 6
Fecha de subida 20/04/2016
Descargas 10
Subido por

Vista previa del texto

Pràctiques  microbiologia     PRÀCTICA   1:   Preparació   Triptona   Aporta  energia  i  aa   10  g   medis  cultiu   Extracte  llevat   Aporta  nutrients   5  g   -­Brou   LB   (no   necessita   agar   per  solidificar)   NaCl     10  g     Aigua  destil·lada     1000  g     -­L’agar  LB  es  prepara  igual,  afegint  15  g  d’agar  per  litre.  L’agar  és  solidificant.     *El  medi  LB  és  un  medi  ric  (complex)  que  es  fa  servir  per  fer  créixer  qualsevol   microorganisme.       Després  s’ha  d’esterilitzar  durant  121ºC  durant  15  min.  a  l’autoclau  i  ja  es  pot   repartir  en:   -­Plaques   de   petri,   tubs   per   profunditat,   tubs   d’agar   inclinat   (el   deixem   solidificar  inclinat  i  això  permet  augmentar  la  superfície  de  cultiu  del  tub  i   permet  no  haver  d’utilitzar  tant  medi  de  cultiu)  i  picadura.     S’ha  d’esterilitzar  prèviament  el  medi  de  cultiu  perquè  no  volem  que  creixi  res   abans  de  sembrar  i  no  hi  hagi  interferència  en  els  resultats;;  per  assegurar-­nos   que  el  que  creix  és  allò  que  sembrem.     -­‐Com   saber   si   ho   hem   preparat   el   medi   de   cultiu   estèrilment?   Gràcies   a   la   banda   d’autoclau,   o   també   podem   dosificar-­‐ho   i   fem   ho   cultivem   a   37º,   si   hi   apareixen   microorganismes  és  que  no  ho  em  fet  en  condicions  estèrils.     -­‐Després  de  la  incubació,  el  medi  de  cultiu  és  estèril?   A)  Si  estem  en  un  medi  sòlid,  si  hi  ha  hagut  creixement  no  és  estèril.   B)  Si  estem  en  un  medi  líquid,  si  és  tèrbol,  no  és  estèril.       El  medi  de  cultiu  l’hem  de  deixar  refredar  abans  d’abocar-­‐lo  a  les  plaques  per  no  cremar-­‐ nos   i   per   no   matar   al   microorganisme.   Però   si   esperem   massa   temps   l’agar   es   solidificarà.       -­‐Preparació  del  Ringer:  solució  NaCl  al  0,9%.  I  autoclavar.       *S’ha  de  retolar  cada  medi  indicant:  (tipus  medi,  alumne  i  data  preparació).     *S’ha   de   controlar   l’esterilitat,   per   això   afegirem   una   cinta   d’autoclau   en   el   moment   d’autoclavar   el   material   (si   està   calibrada   a   121º,   el   viratge   de   color   indicarà   que   ha   arribat  a  aquesta  temperatura).       Com  fer  dissolucions:   10-­‐1  :  4,5  mL  Ringer  (medi  de  dilució)  +  0,5  mL  mostra   10-­‐2:  5  mL  Ringer  +  0,05  mL  mostra     S’utilitza  Ringer  perquè  si  utilitzéssim  aigua  destil·∙lada  ens  carregaríem  les  cèl·∙lules.   És   una  solució  salina  que  permet  treballar  amb  cèl·∙lules  en  suspensió  sense  que  aquetes   morin.           PRACTICA  2:  Tècnica  asèptica  i  mètodes  de  sembra     E.  Coli   Pseudomonas  fluorescents   Fag  Lambda     *Overnight   (ON)   =   mostres   del   bacteri   en   èppendorf.   Sempre   contenen   una   concentració  inicial  de  109.       Tècnica  asèptica   Tècnica   usada   per   evitar   contaminants   durant   la   manipulació   de   cultius   i   medis   de   cultius  estèrils.  Per  això  es  treballa  amb  el  bec  Bunsen  encès  (tenint  en  compte  que  la   flama   aporta   una   zona   d’un   pam   d’aire   estèril   al   voltant   seu).   Les   pipetes   també   estan   estèrils  en  el  pipeter  (per  això  s’han  d’obrir  en  la  flama).  En  obrir  i  tancar  els  tubs  de   vidre   s’han   de   flamejar   la   boca   i   les   ampolles.   Les   nanses   de   picadura   i   de   Kolle   també   s’han   d’esterilitzar   posant-­‐les   “al   roig”   però   s’ha   d’esperar   a   que   es   refredi   abans   d’agafar  l’inòcul  per  evitar  matar  les  cèl·∙lules.       Sembra  microorganismes  en  placa   •   Per  esgotament:  permet  obtenir  colònies  aïllades.     -­‐En  ziga-­‐zaga:  s’agafa  amb  la  nansa  de  Kolle  una  mostra  del  microorganisme.  Es  ssembra   per  estria  en  ziga-­‐zaga  fins  que  s’esgota  la  mostra.  Quan  més  lluny  de  l’inici  més  colònies   aïllades  trobarem.   -­‐En  escocès:  amb  la  nansa  de  Kolle  es  fan  diverses  etapes  (dividit  la  placa  en  4  parts)  i  és   necessària   l’esterilització  de  la  nansa   de   Kolle   cada   cop   (esperant   temps   refredament).   Hi  haurà  més  creixement  en  aquelles  zones  inicials.       *Serveix  per  assegurar-­‐nos  que  només  cultivem  un  microorganisme.  Així  podem  agafar   una  de  les  colònies  aïllades  i  la  tornem  a  cultivar  en  una  nova  placa.       •   En  superfície   Es   sembren   0,1   mL   de   la   dilució   adequada,   disposant-­‐los   sobre   la   placa   de   LB   i   escampant-­‐los   homogèniament  sobre   tota   la   superfície   utilitzant   la   nansa   de   Digralsky   d’un  sol  us.       •   Sembra  en  profunditat   Es   sembra   0,1/1   mL   de   la   dilució   adequada   en   una   placa   de   Petri   estèril   i   buida.   Posteriorment   s’afegeix   20mL   d’agar   LB   prèviament   liquat   i   mantingut   líquid   a   45ºC.   Agiteu  suaument  rotant  la  placa  sobre  la  taula  i  deixeu  refredar  i  solidificar  les  plaques.   Permet  que  hi  hagi  cultiu  dintre  de  la  placa.     *S’ha  de  mantenir  l’agar  a  45ºC  abans  d’abocar-­‐lo  per  evitar  que  ens  cremem  i  no  mati   els  microorganismes.       *És   important   invertir   les   plaques   de   petri   durant   la   incubació   perquè   molts   cops   es   produeix  la  condensació  i  així  evitem  que  quedi  H2O,  a  més  com  que  no  és  un  recipient   hermètic  s’hi  podrien  dipositar  partícules  de  l’aire.         Sembra  microorganismes  en  tubs  d’agar  inclinat     Té  l’avantatge  que  en  un  sol  tub  permet  augmentar  la  superfície  de  sembra  i  ser  prou   gran  com  per  a  a  obtenir  un  bon  cultiu  en  estria.  Amb  la  nansa  de  Kolle.     Sembra  microorganismes  en  tubs  d’agar  en  picadura   Els  microorganismes  són  sembrats  dintre  de  l’agar.  Permet  veure  si  el  bacteri  inoculat   és  capaç  de  créixer  a  baixes  concentracions  d’oxigen  degut  a  que  l’agar  solidificat  no   deixia   passar   l’oxigen.   Així,   com   més   a   l’interior   de   l’agar   siguin   capaços   de   créixer,   menys   oxigen   necessiten,   mentre   que   si   fonamentalment   creixen   a   la   superfície   més   aerobis  estrictes  seran.  Amb  la  nansa  de  picadura.       Sembra  cultius  confluents  (en  placa)   S’observa  creixement  continu  i  homogeni  en  tota  la  placa,  una  vegada  han  crescut  els   bacteris.       1)  Sembra  en  superfície:  es  mulla  l’escovilló  en  un  cultiu  bacterià  i  s’escampa  per  tota  la   placa  de  LB.  Serveixen  per  fer  un  antibiograma  (en  la  indústria  dels  antibiòtics).  Es  posa   en  la  placa  un  paper  de  film  amb  antibiòtic  i  si  quan  s’incuba  tot  ha  crescut,  vol  dir  que   l’antibiòtic  no  afecta,  però  si  quan  s’incuba  hi  ha  zones  no  crescudes  és  que  aquest  és   efectiu  i  inhibeix  el  creixement.     2)  Sembra  en  doble  capa:  s’utilitza  pel  recompte  i  aïllament  de  virus  bacterians.  S’afegeix   a  l’agar  BBL  tou  en  medi  líquid  0,2  mL  d’un  cultiu  bacterià  (E.  Coli)  i  0,1  mL  de  la  dilució   del  fag  adient  (Fag  lambda).  Afegiu  suaument  el  tub  i  aboqueu-­‐ne  el  contingut  sobre  una   placa  de  BBL  intentant  que  es  distribueixi  homogèniament.  Deixeu  solidificar  les  plaques   i  poseu-­‐les  a  incubar.  A  les  8-­‐12  hores  ja  s’observaran  les  calbes  on  hauran  actuat  els   viurs.       Disseny  banc  dilucions   S’han  de  contar  entre  15  i  300  colònies.  (CFU/mL)       Concentració   109   107   105   103   102   FDA   (factor   dilució   0   10.2   10-­‐ 10-­‐6   10-­‐7   4   acumulat)     ON       Per   Per   (inicial)   superfície   profunditat                       PRÀCTICA  3:  DETERMINACIÓ  CONCENTRACIÓ  MICROBIANA     Mètode  NMP  (número  més  probable):  permet  detectar  microorganismes  sense  saber-­‐ ne   la   seva   concentració   en   medis   líquids.   És   un   mètode   estadístic   a   partir   d’una   taula   i   que  ens  dirà  aproximadament  la  concentració  d’organismes.  Es  mira  el  nombre  de  tubs   tèrbols  [+]  (els  que  hi  ha  hagut  creixement)  i  els  que  estan  transparents  [-­‐]  (no  hi  ha   hagut  creixement).  Es  fan  dilucions  i  en  cadascun  dels  tubs  s’inocula  1mL,  s’incuben  i   llavors  es  busca  la  taula  del  NMP  el  triplet  de  valors  corresponents  als  positius  de  cada   dilució  per  obtenir  el  valor  de  cèl·∙lules/g.       Recompte  viables  mostra  líquida   Recompte  de  colònies  crescudes  a  cada  placa  de  la  pràctica  2,  utilitzant  aquelles  que   tinguin  entre  15  i  300  colònies.  I  així  amb  la  fórmula  es  pot  obtenir  CFU/mL.     Nº  colònies  /  (FDL  *  volum  sembrat)     Recompte  de  viables  per  filtració   Filtrem  un  volum  conegut  d’aigua  a  través  d’una  membrana  estèril  amb  un  diàmetre  de   porus  (0,45micres)  que  no  deixa  passar  bacteris,  si  virus.  Col·∙loquem  la  membrana  en   una  placa  de  medi  McConkey.  Les  colònies  creixen  sobre  el  filtre.     *El  medi  McConkey  és  un  medi  de  cultiu  selectiu  que  permet  el  creixement  únicament   de   bacteris   gramnegatius   (ja   que   porta   cristall   violeta   i   sals   biliars   que   inhibeixen   el   creixement   de   grampositius),   i   a   més   és   diferencial   pels   gramnegatius   que   poden   fermentar  la  lactosa.  Conté  roig  neutre  (que  és  l’indicador  de  Ph)  i  lactosa  com  a  font  de   carboni.  Aquells  que  fermentin  la  lactosa  presentaran  una  coloració  groga  o  incolora,   mentre  que  aquells  que  fermentin  la  lactosa  presentaran  una  coloració  vermella  degut   a  la  baixada  del  pH.       Mesura  indirecta  de  la  concentració:  absorbància   A   partir   d’una   suspensió   de   microorganismes   es   realitza   el   banc   de   dilucions:   1/2,   1/4,   1/8  i  1/16.  Llavors  es  mesura  l’absorbància  en  una  cubeta  d’espectrofotometria  usant  el   medi  de  dissolució  com  a  blanc.  Així  es  pot  fer  una  gràfica  on  representen  l’absorbància   en  front  de  la  concentració,  i  s’obté  una  recta  patró  (corba  de  titulació)  a  partir  de  la   qual  sabent  una  altra  mostra  la  seva  absorbància  podrem  saber  la  seva  concentració.       Mesura  indirecta  de  la  concentració:  patró  McFarland   S’afegeix   5mL   d’un   medi   de   dilució   en   un   tub   de   vidre   i   s’elabora   una   suspensió   de   microorganismes  que  tingui  la  mateixa  terbolesa  que  un  Standard  McFarland  nº5  (amb   una  concentració  de  bacteris  de  1,5*108/mL).  Així  anirem  posant  microorganismes  fins   a  obtenir  la  mateixa  densitat.       Titulació  de  fags   Recompte  del  nombre  de  calbes  de  les  plaques  de  la  practica  2.  Expressant  el  resultat   en  PFU/mL.      Nº  calbes  /  (FDL  *  volum  sembrat)       Recompte  directe  de  cèl·∙lules  vives  i  mortes   Cèl·∙lules  tenyides  amb  blau  de  metilè   -­‐Cèl·∙lules  mortes  à  blaves   -­‐Cèl·∙lules  vives  à  transparents       Posar   la   mostra   en   un   porta   i   examinar   al   microscopi   amb   l’objectiu   de   100X.   S’han   de   comptar  al  microscopi  el  nombre  de  cèl·∙lules  vives  i  mortes  en  diferents  caps  de  visió   (uns  10  camps).  Calcular  per  separat  la  concentració  de  cèl·∙lules  vivies  i  mortes  (cel/mL)   amb  les  fórmules  següents:         PRÀCTICA  4:  Aïllament  de  microorganismes   L’aïllament  de  microorganismes  s’utilitza  per  obtenir  cultius  purs:  Cultiu  en  què  totes  les   cèl·∙lules  provenen  d’una  sola  cèl·∙lula  inicial  i  mantenen  llurs  característiques  genètiques   al  llarg  del  temps.     Seran  sembres  en  superfície  en  plaques  de  TSA  (medi  ric)  i  en  plaques  de  sabouraud   (permet   l’aïllament   de   fongs   i   llevats,   ja   que   porta   components   que   inhibeixen   el   creixement  de  bacteris).  Després  s’incubaran  a  30ºC  per  a  que  puguin  créixer  tots  per   igual  (Temperatura  semblant  a  la  del  medi).       Aïllament  microorganismes  de  superfícies  (indústria  alimentària)   1)  “Frotis”:  es  mulla  l’escobilló  estèril  en  ringer  i  es  passa  l’escobilló  per  la  superfície  a   mostrejar.  Després  es  passa  per  la  placa  (TSA  i  Sabouraud).       2)  Plaques  Rodac  que  permeten  fer  un  mostreig  per  impressió.  Són  més  petites  que  les   normals,   i   el   medi   en   agar   sobresurt   de   la   placa.   Permet   fer   una   sembra   directa   ja   que   es  frega  amb  la  placa.       Aïllament  microorganismes  ambient  aeri   Recompte   de   microorganismes   de   forma   indirecta,   ja   que   aquests   cauran   a   la   placa   oberta  per  sedimentació  (durant  30  min),  (TSA  i  Sabouraud).           PRACTICA  5:  Tècnica  microscòpica     E.  Coli  (gramnegatiu)  :  flagel·∙lació  perítrica.   Pseudomonas  fluorescents  (gramnegatiu):  flagel·∙lació  polar.   Staphylococus  arlettae  (grampositiu):  sense  flagel·∙lació.  Forma  de  coc  i  agrupades.     Bacilus  subtilis  (grampositiu):  flagel·∙lació  perítrica.       *La  flagel·∙lació  no  es  pot  veure  per  ME.     Tècnica  de  la  gota  pendent   -­‐Permet  observar  microorganismes  in  vivo.   -­‐Posar   10   micres   de   mostra   sobre   un   cobreobjectes,   i   posar   4   punts   de   vaselina   a   la   es   cantonades   del   cobreobjectes.   Posar   el   portaobjectes   sobre   el   cobreobjectes   i   pressionar  suaument.  Donar  la  volta  i  observar  que  la  gota  de  cultiu  penja  en  l’espai   entre  el  portaobjectes.       Mètodes  de  tinció   Es  necessita  una  bona  extensió  de  la  mostra.     -­‐Per  agafar  cultius  sòlids,  esterilitzem  la  nansa  de  Kolle  i  recollim  una  colònia  i  la   posem   al   portaobjectes.   Amb   una   o   dos   gotes   d’aigua   mesclem   i   finalment   assequem  el  frotis  o  preparació  amb  bunsen.   -­‐Per  agafar  cultius  líquids  col·∙loquem  una  o  dues  gotes  del  cultiu  amb  la  nansa   de  Kolle  i  ho  repartim  per  una  àrea  extensa.  Finalment  ho  assequem  el  frotis  o   preparació  amb  el  bunsen.       •   Tipus  de  tinció     1)  Tinció  simple:  blau  de  metilè.  Tenyeix  tota  la  mostra.     2)  Tinció  diferencial:  tinció  Gram.  Tenyeix  violeta  grampositius,  els  gramnegatius  queden   transparents.     -­‐Tinció  cristall  violeta,  rentar  amb  aigua  i  deixar  escórrer.     -­‐Afegir  lugol  (fixació  del  color  a  la  paret).     -­‐Decolorar  amb  alcohol.   -­‐Tenyir  amb  safranina  alcohòlica  (rosa  en  gramnegatius).   -­‐Rentar  amb  aigua  i  assecar  amb  paper  de  filtre.     ...

Comprar Previsualizar