Tema 9: Caracterització estructural de macromolècules (2016)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 1º curso
Asignatura Estructura i funció de biomolècules
Año del apunte 2016
Páginas 8
Fecha de subida 21/04/2016
Descargas 39
Subido por

Vista previa del texto

Sonia López Pérez Tema 9: caracterització estructural de macromolècules TEMA 9: CARACTERITZACIÓ ESTRUCTURAL DE MACROMOLÈCULES 1. Espectroscòpia L’espectroscòpia és l’estudi de la interacció entre la radiació i la matèria com a funció de la longitud d’ona (λ). la interacció de la radiació amb la matèria pot resultar en diferents fenòmens que poden ser observats i seguits de diferents maneres. El terme spectrometria és emprat per a descriure les tècniques espectroscòpiques usades per a avaluar la quantitat o d’una espècie química determinada.
Fem servir una radiació electromagnètica i mirem com varia aquesta radiació quan interacciona amb la matèria o la nostra mostra.
L’espectre electromagnètic té diferents regions. Jugant amb la longitud d’ona i el mètode que fem servir podrem intentar acotar resolucions més globals o resolucions més detallades. Mètodes incideixen un feix de llum en la mostra que produeixen canvis en la matèria. Com més baixa és la λ de llum que impacta, major és la resolució de l’estudi que faig. Hi ha d’haver una concordança entre la regió de l’espectre que volem tenir i la resolució.
1.1. Mètodes espectroscòpics i les seves aplicacions Les molècules tenen la capacitat d’absorbir en unes longituds d’ona determinades.
Quan volem fer servir l’absorbància com a mètode per predir quelcom, hem de saber on té el màxim d’absorbància la molècula, i a partir d’aleshores treballem a aquest màxim. S’incideix un feix de llum, una part de la llum travessa la mostra, una altra es 1 Sonia López Pérez Tema 9: caracterització estructural de macromolècules veu reflectida per les propietats del suport, i hi ha una part que és absorbida de la mostra. Ho fem per la llei de Lambert Beer, hi ha una relació entre la concentració i la quantitat de llum que té una mostra.
Aquesta fórmula és certa per a regions lineals de Lambert Beer. S’usa en la determinació de la concentració de les proteïnes: log I0 = ε C I = A (𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏à𝑛𝑐𝑖𝑎) I Un espectre: mesurem l’absorció en un rang de longituds d’ona. Les característiques de l’absorció electromagnètiques són útils per al càlcul de concentracions i l’anàlisi de canvis estructurals i/o la unió a lligands.
Quan incidim radiació en una mostra, en els àtoms de la molècula hi ha un procés d’excitació, els electrons pugen a un nivell energètic i després retornen al seu estat basal.
El retorn a l’estat basal pot ser de moltes maneres, en forma de calor, moviment, radiacions… això és perquè absorbeixen energia.
Hi ha vegades que les molècules absorbeixen energia pugen a un estat d’excitació major, i per tal de relaxar-se i tornar a l’estat basal el que fan és emetre llum, és el cas de la fluorescència que es dóna quan la radiació que excita és llum i el retorn a 2 Sonia López Pérez Tema 9: caracterització estructural de macromolècules l’estat basal és l’emissió de llum. En el cas de la fosforescència, la font d’energia incident ha de ser llum electromagnètica, hi ha un tema d’excitació i de retorn, però el retorn a l’estat base és molt lent, a diferència que la fluorescència, en la qual el retorn a l’estat basal es dóna en picosegons.
La quimioluminescència es dóna quan la font d’energia ve donada per reaccions químiques com en el cas de les polseres dels concerts, etc… (las de “para iluminar la boca en plan saes”).
No s’ha de confondre la quimioluminescència amb la fluorescència perquè la font d’excitació no és llum. Les “luciérnagas” o cuques de llum fan quimioluminiescència també, però en el cas dels organismes vius es parla de bioluminescència.
Un exemple de fluorescència és la quitina que amb la llum de les discoteques absorbeix llum i emet llum blava en el cas dels gin tònics, per exemple, per això es poden distingir de l’aigua en una festa.
Va haver-hi un gran boom de la fluorescència amb el descobriment de la GPF(green fluorescent protein), una proteïna que es troba prop de la boca d’algunes meduses.
Aquesta proteïna té la característica de ser molt estable tot de fulles β organitzades en forma de cilindre, s’organitza per ella mateixa, i determinats aminoàcids que queden proper en el barril β pateixen modificacions posttraduccionals que fa que es generi un cromòfor que madurarà i donarà llums dins de l’espectre. Una aplicació de l’espectroscòpia de fluorescència és el FRET (fluorescence resonance energy transfer).
La gent que aïlla i fa servir la proteïna com a model cel·lular in vivo van ser els que van tenir el premi Nobel l’any 2008, hi ha moltes modificacions i aïllament de noves molècules fluorescents des d’aleshores i no totes provenen de les modificacions de la GFP. Tenim una gran paleta de proteïnes fluorescents que ens permet treballar in vitro.
3 Sonia López Pérez Tema 9: caracterització estructural de macromolècules 1.1.1.
Proteïnes fluorescents El que cal saber sobre elles és quin és el seu màxim d’absorció, la λ a què s’ha d’excitar i en aquest cas emeten llum o radiació electromagnètica, cal saber a quina λ emet. Incidirem una llum i recollirem una altra. El detector només recull llum absorbida, el fluorímetre recull la llum emesa. Necessitem pel fluoroform que fem servir el màxim d’absorció i excitació, un dels mètodes basats en la florescència és el FRET, que es fa servir per veure si dues proteïnes interaccionen, agafem la proteïna i li enganxem un fluoroform, i a l’altra proteïna li enganxem un diferent, les posem in vitro, i si aleshores interaccionen el que passarà és que si excito el primer fluoroform, s’excita, quan es recuperi emetrà llum i aquesta llum estarà en el màxim d’absorció del fluoroform i es transferirà l’energia a l’altre fluoroform que es veurà excitat. Si hi ha FRET, veurem la llum del segon fluoroform. Per a fer un bon disseny de FRET, l’espectre d’excitació del segon fluoroform ha de ser solapable amb l’espectre d’emissió del primer fluoroform. El FRET és proporcional a la distància, com més lluny més difícil es pot fer, igual que el solapament, que també és directament proporcional.
4 4 Sonia López Pérez Tema 9: caracterització estructural de macromolècules Una molècula fluorescent és excitada i pot emetre un fotó (a) o transferir la seva energia a una molècula veïna (b), la qual pot ara retornar al seu estat basal amb el seu procés de fluorescència.
Una altra variació del FRET és anar més enllà: partir en dos una proteïna que després es trobi, es reconstitueixi i brilli (això és la pera). Per saber si dues proteïnes interaccionen agafo una proteïna i li posem una meitat de la GFP i després a una altra proteïna l’altra meitat. Si interacciones les proteïnes veurem color verd, fluorescència.
És el cas de la BIFC. En funció de la barreja de colors que podem barrejar podem saber quin és el partner més habitual de la proteïna d’interès, en funció de amb quina meitat s’associï cadascuna de les meitat, veurem un color o un altre que ens indicarà amb qui s’associa.
5 Sonia López Pérez Tema 9: caracterització estructural de macromolècules 1.1.2.
Espectroscòpia de Dicroisme Circular (CD) La llum incident és llum polaritzada. Elements que poden desviar la llum polaritzada = cromòfors quirals. Les proteïnes tenen cromòfors quirals, són els seus carbonis. Hi ha unes parets o dicroismes circulars que poden desviar la llum polaritzada incidida sobre una molècula. Si tenim aminoàcids amb centres quirals, cada estructura secundària tindrà la capacitat de donar un patró de llum polaritzada que el caracteritzi.
Dóna una idea de la composició de la seva estructura secundària. En funció de la disposició dels aminoàcids en fulla β o hèlix α desviarà la llum d’una manera determinada.
Ens permeten veure canvis per la unió de proteïnes que provoquen un canvi, o per estrès.
En funció del tipus d’estructura, apareixeria blau si ho ha hèlix α, vermell si tenim fulla β, i negre si no té estructura.
6 Sonia López Pérez Tema 9: caracterització estructural de macromolècules Imaginem que tenim dues proteïnes amb plegament en hèlix α que en unir-se pateixen un canvi conformacional, i formen una fulla amiloide tota β, aleshores es poden visualitzar els canvis en el contingut de secundària de les proteïnes.
Si tenim una proteïna β i l’escalfem, la desnaturalitzem i fem que perdi la seva estructura secundària, per tant ho observaríem al CD. 0 Les proteïnes són cromòfors quirals (assimètrics) i les seves estructures secundàries absorbeixen llum polaritzada de manera específica. La espectroscòpia de CD s’usa per a calcular el percentatge de cada tipus d’estructura secundària en una proteïna i per fer un seguiment dels canvis estructurals.
1.2. Espectroscòpia de masses És un mètode per a calcular la massa molecular de les macromolècules i per la seva seqüenciació de proteïnes (fingir Printing).
Amb un làser es carrega la mostra, es quantifica la relació càrrega massa i el detector calcula la massa en funció al temps de vol. (MALDI-TOF).
Es poden agafar una barreja de proteïnes i es sotmeten a una digestió enzimàtica, que sabem on tallen, i la barreja la posen a l’espectrofotòmetre de massa, que calcula el tamany dels pèptids. Després s’agafen les masses i les posen a una base de dades que agafa proteïnes que ja estaven descrites i l’especificitat dels enzims usats per saber els pèptids que podríem obtenir, quan troba una diana entre el patró de pèptids obtinguts a nivell pràctic amb el que ell prediu es diu fingir Printing (MASCOT és un programa amb una base de dades actualitzada amb totes les dades publicades, també tenim una alta “finestra” en la qual es posa amb què digerim l’experiment i diem els pèptids obtinguts en el MALDI, i et diu amb què quadra).
7 Sonia López Pérez Tema 9: caracterització estructural de macromolècules A continuació veiem un patró típic de MALDI. L'alçada de cada pic és inforativa de quant n'hi ha? NO, el MALDI no és una tècnica quantitativa, només s'usa per saber quant pesa una proteïna o quina és. L'alçada dels pics és la facilitat amb què una molècula pot volar, és intrínsec de la mostra.
1.3. Cristal·lografia de proteïnes i difracció de raigs X La dificultat radica en que necessitem que la molècula cristal·litzi i que una molècula ho faci és pràcticament aleatori. Es pot intentar cristal·litzar quelcom i que no surti, per tant no es podrà resoldre per cristal·lografia.
A la molècula li incidim un feix de raigs X que impacta amb els electrons de la mostra i això provoca la dispersió de la llum, detectada per un detector, que mesurarà l’angle de refracció. Necessitem un cristall molt ordenat per fer que les seves molècules difractin per a que les ones que genera la dispersió es sumin, siguin constructives de manera que la intensitat de la senyal augmenti. Si els senyals no estan ben definits, matemàticament no es poden obtenir les dades. Si el cristall està desendreçat tenim com barres.
Podem resoldre quelcom que pugui cristal·litzar sempre que sigui un bon cristall. S’obté un mapa de difracció o un mapa de densitat electrònica.
L’estructura tridimensional d’una molècula pot ser interpretada en aquests mapes.
L’ordre de les proteïnes en un cristall difracta els raigs-X obtenint mapa de diffraction.
8 ...