Tema 5: Mutagénesis (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 9
Fecha de subida 03/10/2017
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Profesor: Jaume Pinyol

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Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología.
TEMA 5 TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
Belén Pérez Sanmartín 2do Biotecnología.
MUTAGÉNESIS.
0 1 MUTAGÉNESIS IN VITRO.
Todo lo que es la biología molecular tiene que ver con la creación de un mutante que nos interesa. A partir del nacimiento del DNA recombinante da la posibilidad de obtener mutaciones de estas secuencias que queremos. Hasta ahora eran técnicas que se aplicaban sobre bacterias vivas.
La mutagénesis in vitro se realiza sobre moléculas de DNA aisladas, y hay dos tipos: mutagénesis dirigida y mutagénesis al azar.
- Mutagénesis dirigida (site directed mutagenesis).
Cuando conocemos la secuencia sobre el cual hacemos el cambio y sabemos más o menos de los cambios que estamos introduciendo.
1. Mutagénesis por “cassette”.
2. Mutagénesis por extensión de un encebador.
3. Mutagénesis por PCR.
- Mutagénesis al azar.
Aunque aumenta la cantidad de los mutantes, es un poco al azar. No se sabe la secuencia ni los cambios que estamos haciendo.
1. Mutagénesis por bisulfito.
2. Oligonucleótidos degenerados.
3. PCR tendiente a error (error prone).
4. Cepas deficientes en reparación.
5. Evolución molecular in vitro.
- Creación de proteínas híbridas.
1. PCR recombinante.
MUTACIONES SILENCIOSAS (SILENT MUTAGENESIS).
2 Se trata de cambios en la secuencia de DNA sin impacto en la secuencia de aminoácidos que codifica el DNA, gracias a que el código genético está degenerado.
Aplicaciones: - Se puede introducir una diana de restricción.
Expresar grandes cantidades de una proteína: 1. Cambiar los codones según el uso de codón, para tal de usar un tRNA que sea más frecuente en el microorganismo.
2. Cambiar de codón sin cambiar de aminoácido para poder tener más aminoácidos puestos.
MUTAGÉNESIS POR “CASSETTE” Está basado en el clonaje direccionar.
1. Se aprovechan 2 dianas de restricción que están a una distancia razonable (unos 60 nucleótidos o así, siempre que puedan funcionar como vector para un inserto sin problemas).
2. Se elimina la zona central de las 2 dianas con las enzimas de restricción que toquen.
3. Se le introduce el inserto (oligonucleótidos con mutación) cortado por las mismas enzimas: genera extremos cohesivos con las dianas.
4. Reacción de ligación: recirculará.
5. Transformación en E. Coli.
Al ser clonaje direccional sólo se recuperan las colonias que contienen la mutación.
3 MUTAGÉNESIS POR EXTENSIÓN DE UN ENCEBADOR.
o dut- : defectiva en dUTPasa, se incrementa la tasa de uracilos incorporados sobre el DNA.
o ung-: defectiva en uracil N-glicosidasa, que elimina los uracilos incorporados en el DNA.
Ya no se utiliza este método: 1. Poner el inserto en un m13 (cadena sencilla).
2. Se diseñan los oligos (encebadores) complementarios a la zona en la que queremos introducir la mutación. Si queremos una C cuando hay una A, debemos de poner el oligo con una G.
3. Añadimos pol K + dNTPs para hacer la cadena complementaria.
4. Añadimos T4 DNA ligasa.
5. Transformar en E. Coli: producimos M13.
Dentro de E. Coli se detecta que hay un desemparejamiento, pero se corrige con el sistema dam- Como la cadena parental estaba metilada en la secuencia dam, no hay ningún problema.
Como la otra cadena está invitro, es decir, no está metilada, entonces se arregla la G y se pone una T.
4 Por eso prácticamente toda la progenie del m13 están corregidas, pero aun así, no usar cepas E.
Coli dam-, porque sino aumenta demasiado la probabilidad de mutaciones.
Alternativa y solución: usar una cepa parental con Us en su secuencia. Una cepa ung- y duttiene una tasa de introducir Us mucho más elevada que uan E. Coli WT.
Cuando el genoma de M13 + inserto entra en E. Coli WT, la secuencia rica en Us se va degradando inmediatamente y queda la del encebadoor. Se elimina la parental del M13 porque está metilada y sólo queda la del extensión del encebador (la mutada).
“MUTAGÉNESIS POR PCR QUICKCHANGE” / “EXSITE”.
- Ambos requieren molde de doble cadena y deben de estar en forma circular.
En ambos amplificamos el producto de PCR mutante tanto el vector como el inserto y hacemos la mutación de mutagénesis.
En quickchange los dos oligos son complementarios, y dado que las enzimas se saturan cuando llegan al extremo 5’, no se puede amplificar por PCR una molécula de DNA con extremos 5’ porque el encima nunca llega a copiar la secuencia complementaria.
5 Entonces van reproduciendo una cantidad fija no exponencial de producto amplificado. Es una PCR lineal, no es exponencial: después del 2do ciclo tienes el doble, luego cuatro. La parte de molde puede ser una parte sustancial del molde parental no mutante. En el sistema quickchange como el DNA que hemos sintetizado no está metilado queda protegido de la encima y por tanto el molde parental queda cortado. Se linealiza por las dianas DpnI a trozos y lo único que queda disponible es el molde mutante, el parental lo eliminamos porque está metilado y es susceptible por la tac que lo corta a trozos. Como el mutante no está metilado puede entrar en E. Coli, replicar etc, es una manera de asegurar que solo separamos producto de PCR mutado en este tipo de reacción En exsite los oligos son adyacentes por su extremo 5’ (en vez de ser complementarios). Entonces el producto de PCR es estándar y la reacción de PCR es una reacción de PCR estándar, es decir, exponencial. Entonces, como los dos oligos son adyacentes, cuando se extienden se copia la cadena complementaria del otro oligo, entonces es una reacción de PCR estándart que da un producto de PCR lineal, ¿siempre y cuando qué? Siempre y cuando pongas un ¡¡¡¡¡¡¡enzima con actividad correctora de pruebas!!!!!!! Que da romos. Si no tiene actividad correctora de pruebas puedes tener mutaciones indeseadas amplificadas, las dos As independientes de molden que imposibilitan ligar con T4 DNA ligasa para poder obtener el plásmido recicularizado.
En las mutagénesis dirigidas siempre utilizamos enzimas con actividad correctora de pruebas: 1. No tienes mutaciones indeseadas en el producto.
2. No tienes las dos As y facilita la reacción de ligación, entonces la reacción de ligación es más eficiente.
¡¡¡¡Y para ligarlo el producto tiene que tener el 5’ fosfato!!!! - En el exsite puedes poner la mutación cuantas y donde quieras menos en el 3’, puedes ponerla en un oligo, en dos, sustituciones, adiciones, lo que quieras menos en el 3’!!!!!!!! Puede estar en el 5’ de un oligo, en dos, o en uno da igual, - Quick change SIEMPRE tiene que estar centrada en los dos oligos complementarios y SOLO una mutacion porque los oligos son complementarios entre siii solo una en quick, en exsite las que quieras. En exsite pcr exponencial, en quickchange es lineal.
El oligo es el extremo 5’ del producto de PCR.
En el quick change no lo podemos poner en el 5’ porque como los oligos son complementarios, queda en el 3’ de la otra y no podrá extender el molde paterno. En el exsite no lo podemos poner en el 3’.
6 MUTAGÉNESIS AL AZAR.
Si introducimos oligos 5’ con colas, es la alternativa a las mutaciones por “cassette”. Cuando queremos introducir una mutación en una proteína y no sabemos qué putacion ponemos.
1. Mutagénesis por bisulfito.
Tóxico para el ambiente.
Mejor evitarlo.
2. PCR tendiente a error (error prone).
Reacción de PCR en la cual uno de los nucleótidos se encuentra en una concentración.
Se utiliza una termopolimerasa sin actividad correctora de pruebas, por tanto, la enzima tiene más tendencia de equivocarse al no encontrar un nucleótido. Introduce mutaciones.
3. Cepas deficientes en reparación (por ejemplo XL1-Red).
MutS: no reparación de emparejamienos erróneos (mismatch).
MutD: mutación en la DNA pol III que eelimina la acividad exo 3’-5’ (correctora de pruebas).
MutT: no se hidroliza el oxo-dGTP (incremento de la frecuencia de transversiones).
4. Oligonucleótidos degenerados (por “cassette” o PCR).
Restringir el número de combinaciones porque si tenemos demasiadas combinaciones, baja la probabilidad de obtener cierta secuencia que deseamos. Ejemplo de combinaciones: NTS -> F, I, L, M, V (hidrofóbicos) (S: C o G) GAW -> D, E, T (ácidos) (W: A o T) (http://guinevere.otago.ac.nz/cgi-bin/aef/AA-Calculator.pl) 5. Evolución molecular in vitro.
La mejor opción sin saber qué mutación tendremos. Sólo hace falta saber cómo detectar de manera fácil, económico y de detectar grandes cantidades de mutantes.
No comenzar si no podemos ver las mutaciones fácilmente.
Se combina la mutación y la recombinación (como la evolución): aparición de mutantes y recombinación para encontrar combinaciones nuevas de mutaciones.
EVOLUCIÓN MOLECULAR IN VITRO. “DNA SHUFLING”.
DNA shuffling: por ejemplo, queremos una proteína mutante que dé fluorescencia roja en vez de verde (detectarlo visualmente plaqueando en E. Coli).
1. Fragmentar el DNA en trozos pequeños con DNasa I: separar los fragmentos de 50 -60 bp.
2. Reasociar los fragmentos resultantes y hacer la PCR sin encebadores (45 ciclos).
Entonces, las moléculas pueden autoprimar ya que pueden emparejarse enre ellos permitiendo que se extiendan. Entonces, obtenemos DNAs con mutaciones que estaban en cadenas diferentes: nueva mutación.
3. Entonces, se mira si se tiene fluorescencia o no.
4. PCR con encebadores.
5. Transformar en E. Coli ( o otro huésped apropiado).
7 6. Seleccionar los mejores recombinantes.
EVOLUCIÓN MOLECULAR IN VITRO. MEJORA DE PROTEÍNAS FLUORESCENTES.
8 ...

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