Cultius Cel·lulars Tema 8 (2015)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius Cel·lulars
Año del apunte 2015
Páginas 5
Fecha de subida 14/03/2015
Descargas 9

Vista previa del texto

1 2 3 4 5 6 7 8 TEMA 8. MÈTODES DE QUANTIFICACIÓ CEL·LULAR.
8.1 RECOMPTE CEL·LULAR.
El sistema més simple és l’hemocitòmetre. Es basa en un porta gruixut excavat. Sobre aquest s’hi posa un cubre, i entre cubre i porta queda un espai buit de 10^-4 mL on hi cap una alíquota del nostre cultiu cel·lular. El porta pot tenir una o dues zones de recompte (el de la imatge en té dos). En aquestes zones de recompte hi ha unes ratlles horitzontals i verticals perpendiculars. A patrir de l’alíquota que extraiem del cultiu i el volum total que tenim d’aquest podem saber la concentració total de cèl·lules. Per recomptar les cèl·lules no cal tenyir-les, però si volem podem fer una tinció amb blau de tripà. El blau ens marca les cèl·lules no viables, que tenen la membrana feta malbé i que deixen entrar aquest colorant al citoplasma. Els sistemes de recompte automàtic es basen en fer passar el líquid on estan les cèl·lules d’una en una per un lloc específic, de manera que quan en passa una es trenca el camp elèctric i produeix una senyal. Els sistemes més sofisticats ens permeten separar les cèl·lules per mida.
En el laboratori de cultius hi ha un seguit de càlculs que hem de tenir present. Per exemple, en una línia cel·lular finita, és interessant saber el nombre de divisions que es produeixen abans que aquesta línia deixi de ser viable. Aquest valor és anomenat PD, i correspon al nombre de vegades que s’ha duplicat la població cel·lular. També va bé per saber a partir de quin nombre de divisions les cèl·lules comencen a patir alteracions genètiques.
És important no confondre el nombre de divisions amb el nombre de passes, que és el nombre de subcultius que hem fet a partir d’una línia cel·lular inicial. Pot ser que, per exemple, cada dues duplicacions tinguem un subcultiu.
El temps mig de generació ens indica quan tarda una població cel·lular a duplicar-se. És característic de cada línia cel·lular. Per fer-ho, dividim el temps entre el nombre inicial menys el nombre final de cèl·lules, tenint en compte que hem de treballar sempre amb valors pertanyents a la fase logarítica de creixement (recta).
Totes les cèl·lules de línies cel·lulars proliferen, però en un cultiu primari pot ser que no totes siguin proliferants. Podem saber quina fracció de cèl·lules proliferen incorporant un nucleòtid marcat amb fluorescència. Veurem brillar aquelles cèl·lules que proliferin.
A vegades ens interessa saber la durada d’un cicle cel·lular. Per exemple, volem provar una droga que actua a la fase S, i per fer-ho hem de sincronitzar totes les cèl·lules del cultiu perquè estiguin en aquesta fase. El pas previ a la sincronització és el coneixement del cicle cel·lular. Fem créixer un ventall de cultius idèntics, el mateix dia, sobre un cubre. Apliquem un compost durant 30 minuts que s’incorpori al DNA quan estigui en replicació (per exemple amb nucleòtids marcats amb fluorocrom, com el cas anterior). Totes aquelles cèl·lules que estiguin en fase S hauran incorporat el nucleòtid i les podrem distingir, perquè és en aquesta fase quan es produeix la replicació del material genètic. Analitzo les mitosis marcades amb aquest nucleòtid. Al començament no en tenim cap, perquè les cèl·lules que s’estaven replicant estan ara en G2. A mesura que passa el temps, es veuen més i més mitosis marcades. S’arriba a un màxim, es descendeix, i després es torna a ascendir. La distància entre pics és la durada d’un cicle cel·lular complet.
8.2 RECOMPTE DE NUCLIS 1 assaig MTT. És un compost de color groc que posem al medi de cultiu, i que per una reacció d’una lactat DH mitocondrial esdevé de color blau (formazan) i insoluble en aigua.
La quantitat de formazan formada és directament proporcional al nombre de cèl·lules que hi ha en el cultiu. És molt útil per provar fàrmacs.
Posem diferents alíquotes d’una mostra cel·lular en uns pouets com els de la imatge, i en cadascun d’ells una concentració diferent del fàrmac que volem provar. Al cap d’un temps, rentem les mostres i hi posem MTT. La quantitat de formazan format ens revelarà la toxicitat del fàrmac, ja que com més formazan quantifiquem menys efecte tòxic tindrà la droga sobre les cèl·lules.
També podem fer-ho al revés i posar diferents concentracions cel·lulars en els pouets, i en tots ells aplicar una concentració de droga concreta. L’IC50 és la concentració d’una agent tòxic necessària per matar a la meitat d’una població cel·lular. En aquest exemple, les cèl·lules més resistents al fàrmac (i que per tant tenen un IC50 més elevat) són les de tipus B.
Si una droga afecta més a una població cel·lular, aleshores la fase de creixement exponencial serà més lenta. Amb aquest assaig podem determinar la toxicitat d’una droga, quin tipus de cèl·lules són més o menys sensibles a aquesta. També podem fer assajos MTT variant les condicions del medi. Per exemple, per a un mateix tipus cel·lular i una mateixa droga antitumoral, les cèl·lules cultivades sobre feeder layer presenten menys sensibilitat. (Nota: les feeder són més fidels a les condicions in vivo).
2 Assaig amb NR. Mètode colorimètric. És un colorant supravital que s’acumula en els lisosomes de les cèl·lules viables. Primer es fa un rentat i després es solubilitzen les cèl·lules de manera que el colorant quedi al sobrenedant. Amb espectofotometria quantifiquem el Neutral Red (NR) que s’ha produït.
3 Assaig de la Lactat Deshidrogenasa. Quan les cèl·lules es moren llisen, i entre les coses que alliberen deixen anar LDH (que es deteriora amb el temps). Aquest enzim catalitza la reacció: Piruvat + NADH+H ↔ Lactat + NAD Si les cèl·lules són viables la reacció no es farà. Una manera senzilla de quantificar és mesurar a 340nm, que és on emet NADH, i observar com baixa o puja l’absorbància. Com més mort cel·lular hi hagi més NAD hi haurà i més baixarà l’absorbància a 340nm. És un mètode útil per treballar amb grans quantitats de cèl·lules (bioreactors).
8.3 MORT CEL·LULAR Hi ha diferents tipus de mort que es dónen en un cultiu. Alguns exemples són apoptosi, necrosi, autofàgia (les cèl·lules no tenen nutrients i es mengen el seu propi RE), entosi. Entosi es dóna en cultiu, sobretot en cèl·lules epitelials. Aquestes estan formant una monocapa, i estan unides per cadherines entre elles. Quan la densitat cel·lular és alta, aquests contactes per cadherines pot ser que acabin envoltant una cèl·lula i l’acabin fagocitant. Els mecanismes que poden desencadenar la mort cel·lular són molt diversos, i poden ser externs o interns.
1 Les restes apoptòtiques en cultius provoquen necrosi. Els macròfags, en els organismes, tenen la funció d’eliminar aquestes restes; però en cultiu no n’hi ha i per això cal netejar sovint el medi per evitar problemes.
2 Factors tròfics. Quan les cèl·lules deixen de rebre estímuls, encara que hi hagi nutrients, aquestes moren. És important procurar l’aplicació d’estímuls adequats a les cèl·lules en cultiu.
Com podem distingir una cèl·lula necròtica d’una cèl·lula apoptòtica? En les cèl·lules necròtiques el procés és diferent: es perd el balanç osmòtic i la cèl·lula rebenta. En les cèl·lules apoptòtiques el procés és diferent: 1 La cromatina es condensa a la perifèria del nucli i es fragmenta en petits nuclis amb la cromatina molt densa.
2 La cèl·lula es trenca formant parts (cossos apoptòtics) que mantenen dins seu el balanç osmòtic, la membrana plasmàtica està intecte. Inclouen fragments de l’antic nucli i d’orgànuls.
3 Els cossos apoptòtics són fagocitats per macròfags.
Detecció de cèl·lules apoptòtiques/necròtiques.
Fosfatidil serina –és un fosfolípid de membrana que es troba a la monocapa interna. Si marquem aquest fosfolípid (fluorescència o radioactivitat) podem veure on està. En les cèl·lules necròtiques, la membrana es trenca i el senyal pot entrar a dins. En cèl·lules apoptòtiques el senyal les marcarà per fora, perquè durant l’apoptosi s’activa una flipasa i algunes fosfatidil serines passaran a la monocapa externa i podran ser marcades pel senyal. En les cèl·lules normals no es marcarà res.
Iodur de propidi/taronja d’acridina –tenyeix el nucli. Si la cèl·lula està necrosant, el colorant entrarà. En les cèl·lules apoptòtiques no. Per aquest mètode cal que la membrana estigui impermeabilitzada. Combinant el marcatge de fosfatidil serina i iodur de propidi podem distingir, d’entre les cèl·lules que s’estan morint, les necròtiques de les apoptòtiques.
Detecció de l’activitat de la caspasa 3 –combinant el marcatge de fosfatidil serina i la detecció de l’activitat de la caspasa 3 es poden detectar cèl·lules apoptòtiques. Es posa un substrat (annexina) que la caspasa converteix en colorant, que s’enllaça finalment amb el DNA i emet fluorescència. La fosfatidil serina (en rosa) indica cèl·lula que s’està morint, i el nucli fluorescent indica que la cèl·lula és apoptòtica.
Mètode túnel –El trencament del DNA internucleosomal quan la cèl·lula està en apoptosi genera molts extrems 3’ lliures (per cada cromosoma tenim 2 extrems 3’ lliures, de normal). El mètode túnel utilitza aquests extrems per posar nucleòtids marcats. Si veiem més senyals dels normals, voldrà dir que la cèl·lula està apoptosant. Aquest mètode, però, no és exclusiu d’apoptosi. Si tractem les cèl·lules amb radiacions ionitzants o amb drogues que indueixen trencaments de la cadena de DNA també podem aplicar el mètode túnel per quantificar-ne l’activitat.
Altres mètodes de detecció de cèl·lules apoptòtiques és fer electroforesis (En l’apoptosi el DNA internucleosomal és digerit. El DNA que està enrotllat donant dues voltes al nucleosoma no és degradat. En electroforesi, apareix una banda de 180pb corresponent a aquest DNA) i també es pot fer per centrifugació (diferència de densitats entre cèl·lules apoptòtiques, cèl·lules necròtiques i cèl·lules viables).
...