Tecniques d'enriquimenr i aïllament de microorganismes en ambients aquàtics (2) (2008)

Apunte Catalán
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Ciencias Ambientales - 1º curso
Asignatura Biologia
Año del apunte 2008
Páginas 15
Fecha de subida 25/05/2014
Descargas 0

Vista previa del texto

Tècniques d’enriquiment i aïllament de microorganismes Ambients aqüàtics.
Grup D: Anna Pérez Jordi Pérez Marc Quintana Alberto Muñoz Adrià Rangel Anna Remolà Carla Ribalta Curs 2008-2009 Biologia 1, Microbiologia Definició d’enriquiment Són les condicions i nutrients que necessiten els microorganismes per desenvolupar-se.
Existeix la tècnica de cultiu d’enriquiment que permet aïllar el tipus de microorganismes que volem estudiar.
És una tècnica selectiva ja que l’objectiu del cultiu d’enriquiment és potenciar el creixement dels microorganismes que volem estudiar per tal de tenir un gran nombre d’aquest i facilitar el seu aïllament.
Aquesta tècnica es basa en crear un medi de cultiu que compleixi unes condicions d’incubació selectives per l’organisme que es vol aïllar i contra selectives per els organismes no desitjats.
Perquè un cultiu d’enriquiment tingui èxit cal aconseguir una replica exacta dels recursos i condicions del nínxol microbià dels organismes que volem aïllar i estudiar.
Un exemple de cultiu d’enriquiment és la columna de Winogradsky, que ens permet aïllar bactèries fototrofiques vermelles, verdes i altres microorganismes anaerobis.
Columna de Winogradsky Bacteris i Archaeas (procariotas), exhibeixen una diversitat metabólica tan sorprenent que difícilment podrem trobar-la en animals, plantes, fongs o altres organismes "superiors" (eucariotes). Els procariotas, literalment, mantenen el seu sistema biològic utilitzant i reciclant, una vegada i una altra, tots els elements minerals necessaris per al seu suport vital.
Depenent de les fonts de carboni i energia de les quals depèn cada organisme les quatre estratègies bàsiques dels éssers vius són :fotoautótrofs (plantes), quimioheterótrofs (animals, fongs), fotoheterótrofos i quimioautótrofos. Només entre els bacteris es poden trobar aquestes quatre estratègies bàsiques de la vida.
La columna de Winogradsky és una demostració clàssica de com els microorganismes ocupen "microespais" altament específics d'acord amb les seves toleràncies mediambientals i les seves necessitats vitals (requeriments de carboni i energia) i que, a més, il·lustra com diferents microorganismes desenvolupen els seus cicles, i la interdependència que arriba a existir entre ells (les activitats d'un microorganisme permet créixer a un altre i viceversa).
Aquesta columna és un sistema complet i autònom de reciclament, mantingut només per l'energia de la llum.
El muntatge consta d'un cilindre ample de cristall que s'ompli amb llots rics en matèria orgànica fins a/1 3 del seu volum. S'afegixen restes orgàniques de diferent origen (tires de paper de periòdic, restes d'arrels de plantes, carn picada, etc.). S'afegix a la barreja un suplement compost de SO4Ca i CO3Ca (que actuen com font de sulfat i tampó respectivament). La barreja, bé atapeïda perquè no quedin bombolles d'aire, es cobreix amb aigua procedent d'un llac, estany, sèquia (o alguna font similar), es cobreix amb paper d'alumini i es deixa en una finestra on rebi la llum del sol.
Al llarg de la columna es desenvolupen diversos organismes: En la zona inferior de llots es desenvolupen organismes que desenvolupen processos fermentatius, es produïxen productes de "deixalla" que són al seu torn el substrat per al desenvolupament de bacteris. Com resultat s'alliberen sulfurs que difonen a la zona superior oxigenada creant un gradient en el qual es desenvolupen bacteris fotosintéticas que utilitzen el sofre.
Per sobre d'aquesta zona poden desenvolupar-se els bacteris púrpura que no utilitzen el sofre.
Cianobacterias i algues creixen en la part superior i alliberen oxigen que manté aerobia aquesta zona.
Microbiologia de la columna de Winogradsky Zona anaeròbia Hi ha dos tipus d'organismes que poden créixer en condicions anaeròbies: els que fermenten la matèria orgànica o els que realitzen la respiració anaeròbia.
En el fons de la columna pot aparèixer una capa formada per bacteris del sofre portadores de vesículas de gas. En condicions totalment anaeróbicas poden aparèixer els bacteris del gènere Clostridium. Més amunt trobem les Desulfovibrio, bacteris reductors del sofre que utilitzen sulfats i tiosulfats per a obtenir SH2 que reaccionant amb el medi produirà sulfur ferròs que dóna el característic color negre a aquesta part de la columna. Per sobre d'aquestes trobem els bacteris verds del sofre, les Chlorobium, que processen els sulfats per a donar un color verd i els bacteris liles del sofre, els Chromatium. Aquestes bacteris obtenen energia de reaccions lluminoses i CO2 però a diferència que les plantes no es produïx oxigen perquè no parteixen de l'aigua si no de l'àcid sulfhídric. Un mica per sobre d'aquesta zona ens trobem una franja de bacteris liles no del sofre, com Rhodospirillum i Rhodopseudomonas, que adquireix un color vermell-ataronjat. la seu major o menor abundància dependrà de la quantitat de sulfhídric que s'hagi produït i de la quantitat que, no utilitzada per altres organismes, difongui cap amunt, ja que la seva presència inhibeix a aquests bacteris. Són anaerobis fotoorganótrofos que només poden realitzar la fotosíntesi en presència d'una font de carboni orgànic.
Zona aeròbia La part superior de la columna d'aigua pot contenir abundants poblacions de bacteris de diferents tipus. Són organismes aeròbis que es troben habitualment en els hàbitats aquàtics rics en matèria orgànica. Pot desenvolupar-se també microorganismes fototròfics variats procedents directament de l'aigua o del fang utilitzats originalment en el muntatge de la columna. La superfície del fang pot presentar en aquesta zona un lleuger color castany. Aquesta és la part de la columna més rica en oxigen i més pobre en sofre. No obstant això, aquí també arriba certes quantitats de SH2 que serà oxidat a sulfat per bacteris que oxidan sofre (com Beggiatoa i Thiobacillus). Aquests bacteris obtenen energia oxidando el SH2 a sofre elemental i sintetitzen la seva pròpia matèria orgànica a partir de CO2. Per això se'ls crida quimoautótrofas. En les zones superiors poden créixer també cianobacterias fotosintéticas, el que es visualitzaria com un tapet de gespa de color verd. Aquestes bacteris es caracteritzen per ser les úniques que realitzen una fotosíntesi similar a la de les plantes.
Mètodes d’aïllament Els cultius axènics o purs es poden obtenir de moltes formes a partir d’un enriquiment. Les més freqüents són: La sembra per estria en superficie (en placa de petri), la sembra en profunditat (agar-shake), i la dilució en líquid.
També existeix un mètode d’alta tecnologia per obtenir cultius axènics, que s’anomena les pinces laser, aquest però es menys utilitzat.
Sembra per estria en superfície s’utilitza per als microorganismes que creixen bé en medi sòlid (agar). A partir d’una població mixta, fem una sembra per estria i s’incuba en les condicions adequades per al microorganisme que ens interessa. Amb aquest tipus de sembra aconseguirem tenir colònies separades. Repetint aquesta tècnica amb una colonia obtindrem un cultiu pur. Aquest mètode s’utilitza per microorganismes aerobis i anaerobis.
ÆPlaca sembrada per estria.
ÆCom fer una sembra per estria Pinces làser Les pinces de laser consisteixen d’un microscopi òptic invertit equipat amb un laser infraroig enfocat amb precisió i un instrument de micromanipulació. Una cèl·lula individual del camp de visió queda atrapada i es separada dels altres microorganismes.
La cèl·lula queda atrapada degut a la força del laser, quan el laser es desplaça, la cèl·lula també. En aquest cas, la cèl·lula queda en el tub capilar, per aïllar-la tallem el tub, i posem la cèl·lula en un tub petit de medi estèril per iniciar el seu creixement.
ÆDibuix del funcionament del laser.
Aquest mètode es força útil per l’aïllament de bactèries de desenvolupament lent que poden ser superades per el desenvolupament ràpid d’altres poblacions en cultius d’enriquiment típic, o per organismes presents en quantitats molt baixes, tant que en els casos de dilució es podrien perdre.
Nombre més probable (NMP) L’NMP o també anomenat per “dissolució d’extinció” és una estratègia eficient d’estimació de densitats poblacionals especialment quan una avaluació quantitativa de cèl·lules individuals no es factible. Es basa en determinar la presència o absència (positiu o negatiu) en rèpliques de dilucions consecutives de microorganismes presents en determinats medis. El nombre estimat de densitat poblacional s’obtindrà del patró obtingut en les dilucions seriades i d’una taula probabilística.
El procediment s’inicia amb la dilució en sèrie d’un inòcul en un medi líquid fins que el tub o tubs finals de la sèrie no mostren creixement. La combinació de tubs múltiples més freqüent és de deu en deu, per exemple, l’últim tub que mostri creixement s’ha d’haver originat a partir de deu cèl·lules o menys. Si es repeteix varies vegades aquest procediment s’obtenen cultiu axènics o purs, és a dir, que s’obtenen per mitjà de l’enriquiment.
Aquesta tècnica s’ha utilitzat per estimar el nombre de microorganismes en aliments, aigües residuals i en altres mostres on es té que avaluar rutinàriament el nombre de cèl·lules. Es pot fer amb medis altament selectius i condicions d’incubació dirigits a un grup d’organismes, com per exemple, un determinat patogen, o utilitzant un medi complex per obtenir una estimació del número total de cèl·lules.
La imatge mostra com en un medi de cultiu selectiu se li afegeix un cultiu d’enriquiment o una mostra natural d’aigua, terra... i es fa un banc de dilució. L’últim tub mostra el creixement (en l’exemple es la dilució 10-5 ), i es repeteix el procediment. En una estimació del nombre d’un tipus determinat de bacteris d’una mostra, el nombre més probable es defineix com la dilució més elevada que mostra creixement. L’ utilització de diversos tubs replicats per cada dilució ens dona una exactitud més gran en l’NMP final obtingut.
Sembra en profunditat Aquest mètode consisteix en la dilució d’un cultiu mixte en tubs d’agar fos.
Quan l’agar solidifica les colònies es desenvolupen mesclades en el tub d’agar enlloc de a la superficie, com seria a la sembra per estria en placa. És un mètode de gran utilitat per purificar determinats tipus de microorganismes anaeròbics. És possible obtenir cultius axènics mitjançant dilucions successives duna suspendió de cèl·lules en tubs d’agar fos. A partir d’una colònia crescuda en el tub de major dilució utilitzada com a inòcul, es pot tornar a fer un banc de dilucions, de tal manera que s’acabi obtenint un cultiu axènic.
Independentment del mètode utilitzat per purificar el cultiu, una vegada obtingut el suposat cultiu axènic és esencial comprovar la seva puresa. Per això s’utilitza una combinació de tècniques microscòpiques, observació de les característiques de la colònia en plaques, o en sembres de profunditat en tub, i comprovació de creixement en medis on el microorganismo que ens interessa aïllar creix molt poc, però que afavoreix el creixement dels microorganismes que l’acompanyen.
La observació microscòpica d’un sol tipus morfològic de cèl·lula, juntament amb unes característiques uniformes de la colonia, i si no hi ha contaminació corroborant-ho amb diferents medis de cultiu, pot ser la prova que el cultiu és axènic.
Els microorganismes en els ambients aquàtics Hàbitats aquàtics Els principals medis aquàtics són els mars, els estuaris, els llacs, els estanys, rius i manantials entre altres. Les característiques fisicoquímiques dels habitats aquàtics són diferents dels altres habitats on poden trobar microorganismes, en conseqüència els microorganismes que podem trobar als habitats aquàtics difereixen de las característiques físiques i biològiques dels altres habitats.
En els habitats aquàtics trobem els anomenats productors primaris, que són els microorganismes fototròfics que utilitzen l’energia provinent de la llum per a la producció inicial de matèria orgànica. Els organismes fototròfics predominants en la majoria dels habitats aquàtics són microorganismes.
La distribució d’aquests microorganismes productors primaris es diferenciada segons el ambient que habiten. En les zones òxiques són els cianobacteris i les algues són els organismes predominants, en les zones anòxiques dominen les bactèries fototròfiques anoxigèniques. Les algues que floten o es mantenen en superfícies s’anomenen fitoplàncton, i les que s’adhereixen al fons o a les vores s’anomenen algues bèntiques.
La activitat biològica dels ecosistemes aquàtics depèn de la taxa de producció primària que duen a terme els microorganismes fototròfics, a la vegada les activitats dels productors primaris es veu afectada pels recursos i per les condicions ambientals.
En mar obert la producció primària es molt baixa, mentrestant la en les zones costaneres es elevada, i es donen les taxes més altes de producció en llacs o manantials. El mar obert es relativament poc fèrtil degut a que els nutrients inorgànics necessaris pel creixement del fitoplàncton es troba en baixes concentracions. les zones costaneres per altra banda són més fèrtils degut a l’aport de nutrients procedent de rius i altres entrades d’aigua continental contaminada.
La quantitat de flora i fauna produïda per un ecosistema depèn en última instància, d’una taxa de producció primària elevada.
Oxígen en llacs i rius L’oxigen està presents en quantitats elevades a l’atmosfera, però en canvi, als medis aquàtics la seva presència és limitada, i l’intercanvi entre el oxigen dissolt i l’oxigen atmosfèric en les masses d’aigua es baix.
En la superfície de les masses d’aigua nomes es dur a terme la producció d’O2 fotosintètic, degut a que nomes a la superfície es on arriba la llum que poden utilitzar els microorganismes fotosintètics. La matèria orgànica que no es consumeix en els estrats superiors de les masses d’aigua decanta per gravetat fins al fons, on es descompon per l’acció de microorganismes facultatius, principalment fongs, que utilitzen el O2 dissolt en l’aigua. En els llacs, quan s’ha consumit l’O2 dissolt, les capes més profundes es tornen anòxiques, que són capes on no es possible el desenvolupament d’organismes aerobis estrictes (plantes superiors i animals) i les úniques espècies que poden habitar en aquestes capes són microorganismes anaeròbics i animals microaerofilitics.
La presència o no d’O2 depèn de varis factors, però principalment depèn de la presència de matèria orgànica i el moviment i la velocitat d’intercanvi d’aigües entre les capes profundes i les de superfície. Si la matèria orgànica es escassa (llacs i mar obert) es possible que no hi haguí suficient estrat per que els organismes quimioorganòtrofs consumeixin tot el oxigen present al medi. A la vegada si les masses d’aigua es barregen correctament l’oxigen de superfície pot arribar a aigües més profundes i repartir la quantitat d’oxigen present al medi.
Als medis aquàtics de les zones temperades les masses d’aigua romanen estratificades durant l’estiu, amb capes menys denses i amb major temperatura a la superfície, i més fredes i denses en profunditat, quan es forma l’estratificació les capes inferiors de la massa d’aigua es tornen anòxiques. A les èpoques més fredes les aigües superficials es refreden i es tornen més denses que les capes inferiors i es produeix un intercanvi de masses d’aigua que afavoreix l’aeració del fons.
Oxígen en rius Els rius son habitats aquàtics que reben molta matèria orgànica procedent d’aigües residuals i industrials, encara que els fluxos turbulents dels rius provoquen que les masses d’aigua es barregin molt, si l’aport de matèria orgànica es molt elevat pot produir-se un dèficit d’oxigen dissolt. La disminució de la presencia d’oxigen dissolt en aigua no es convenient degut a que els animals necessiten l’O2 per poder viure, i en condicions anòxiques no poden sobreviure.
Quan el aigua es torna anòxica, bactèries anaeròbiques comencen a créixer i produeixen substàncies odoríferes i tòxiques per als organismes superiors.
Demanda Bioquímica d’Oxígen (DBO) La Demanda Bioquímica d’Oxigen (DBO) és la capacitat de consumir oxigen que té una massa d’aigua determinada. La DBO serveix com a mesura indirecta de la quantitat de matèria orgànica que pot ser oxidat per els microorganismes.
Quan un riu es recupera de la contaminació produïda per compostos orgànics, la caiguda de la DBO ve acompanyada d’un augment en la concentració d’oxigen dissolt en l’aigua.
Bibliografia Madigan, M.T. et al, 2005 Brock Biology of Microorganisms (11a ed.).
Prentice Hall www.cv2008.uab.cat www.google.es Repartiment de la feina Jordi Pérez ha fet la part de la definició d’enriquiment i el seu respectiu Power Point.
Adrià Rangel ha fet la part de la columna de Winogradsky i el seu respectiu Power Point.
Anna Pérez, Anna Remolà i Carla Ribalta s’han dividit els mètodes d’aïllament i han fet els respectius Power Points. A més, carla Ribalta ha ajuntat tots els Power Points i Anna Pérez els Documents de Word.
Marc Quintana I Alberto Muñoz han fet la part de Microorganismes Aqüàtics amb el respectiu Power Point.
...