Tema 6 Micro (2016)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biología - 2º curso
Asignatura Microbiologia
Año del apunte 2016
Páginas 5
Fecha de subida 18/04/2016
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TEMA 6: CULTIVO DE MICROORGANISMOS, MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN Y SISTEMAS DE CONSERVACIÓN En esta sociedad, todo lo que entre en contacto con un ser humano es analizado sistemáticamente y esto es lo que se llama microbiología analítica.
Medios de cultivo Se utilizan para aislar las bacterias y los hongos. Hay 2 formas: - Medios líquidos: tubos de vidrio o plástico y dentro tenemos un caldo de cultivo.
Medios sólidos: tenemos todos los nutrientes solidificados con agar.
Comparación entre medio líquido y sólido: en el sólido se pueden ver las colonias claramente.
Las ventajas de un medio líquido son que estos son más agradecidos para las bacterias, les gusta más crecer en estas condiciones. Estas sirven para recuperar muestras que estaban a punto de morir y también cuando hay que sembrar un gran volumen. Dependiendo del caso utilizaremos un método u otro.
Hay 2 tipos de medios de cultivo en función de si conocemos o no la composición exacta de ese medio de cultivo: - Medios definidos: se sabe exactamente toda la composición.
Medios complejos: medios utilizados más a menudo, no se conocen todos los componentes.
Hay otras clasificaciones: - Medios usuales: los medios que pueden ser solidos o líquidos que tienen los requerimientos mínimos para el crecimiento.
Medios ricos: llevan algo más (por ejemplo el agar- sangre) Medios selectivos: son aquellos que solo dejan crecer a un determinado grupo de bacterias u hongos. Ejemplo: agar de MacConkey.
Medios diferenciales: son los que nos permiten ver diferencias entre las distintas colonias que han crecido. Permite ver si la bacteria que ha crecido tiene hemolisinas, unas proteínas que lisan los hematíes y se ve un aclaramiento de estos (beta- hemólisis).
Agar de MacConkey Es un medio selectivo para enterobacterias, además es diferencial porque nos establece diferencias. Solo crecen los géneros de la familia Enterobacteriaceae.
Este método sirve para: por ejemplo las bacterias que con más frecuencia dan gastroenteritis en la población sana son las de los géneros Campylobacter, Salmonella, Shigella y Yersinia (enterocolítica). Al laboratorio nos llega una muestra de heces y a partir de estas tenemos que ver si hay alguna bacteria de estos géneros. Si las heces son sembradas en una placa normal habrá de todo, sobretodo especies no patógenas que enmascararán las patógenas. El campylobacter se siembra en una placa selectiva para estas (no en el agar) y el resto serán sembradas en una placa de agar macConkey. En esta placa solo nos crecerán las enterobacterias, con lo cual si las 3 últimas están veremos colonias de cada una.
Este medio lleva sales biliares que inhiben a la mayoría de gram +, cristal violeta que también inhibe gram + y algunos gram -, lactosa y rojo neutro. Entre las dos primeras se inhiben a todos los gram + y prácticamente todos los gram -, quedando solo las enterobacterias. Las colonias de enterobacterias que crezcan en esta placa y fermenten la lactosa, cogerán un color rojo. Las que no puedan fermentar la lactosa se quedaran de un color rosa pálido (colonias lactosa + y colonias lactosa -).
Esto es interesante porque las lactosa – son la salmonella, la shigella y la yersinia. Las positivas son escherichia coli, los preteus, etc. que forman parte de la microbiota normal. Si se ven colonias lactosa negativas se seguirá con su identificación mientras que si son positivas se tiraran porque no hay nada importante.
Manitol- sal- agar Solo permite el crecimiento de estafilococos y también es un medio selectivo. Lo que hace que sea selectivo es la elevada concentración de cloruro sódico (7.5%), los gram positivos normales no pueden crecer a concentraciones más elevadas de un 5% de cloruro sódico. Si crece algo sabremos que es un estafilococo. Además tenemos manitol y rojo fenol. S. Aureus, que es el más patógeno y es manitol positivo, puede utilizarlo produciendo ácido y en este caso el rojo fenol vira de rojo a amarillo. S. epidermidis también es un estafilococo pero no utiliza el manitol y además no suele dar patologías y por lo tanto no cambia el color.
Medios para hongos También hay medios especiales para el crecimiento de los hongos como el medio de Sabouraud.
Las cándidas son levaduras y crecen como si fueran bacterias. Los hongos filamentosos dan colonias típicas de hongos, como en Aspergillus.
Protozoos Con excepción de Tricomonas vaginallis no son cultivados normalmente el laboratorio. Esta sí que se cultiva porque se encontró un medio de cultivo en el que crecía bien. Normalmente son detectados en la muestra por el microscopio óptico, al ser eucariotas la medida celular es mayor.
Virus Los virus son patógenos de persistencia intracelular obligada, para cultivarlos necesitamos células o animales.
El virus de la gripe se cultiva en grandes cantidades para producir las vacunas. Se cultiva en los huevos fecundados de pollo, aunque ahora también se están intentado cultivar en cultivos celulares normales con medios en los que se permita el crecimiento de células.
Hasta hace poco todas las vacunas del virus de la gripe se cultivaban en huevos pero últimamente algunas ya se cultivan en líneas celulares (se utilizan líneas celulares de células VERO o células MDCK).
Si queremos aislar virus de muestras patológicas utilizaremos unas líneas celulares u otras como las de la córnea de conejo o las de un riñón de mono.
Identificación bioquímica Cuando nos ha crecido algo en el cultivo, tanto de hongos, virus, bacterias, protozoos… En casos de bacterias, hongos y virus tenemos que afinar más el análisis. A veces es necesario hacer algo más como:  API, bandeja de plástico con unos pocillos donde dentro hay medio de cultivo con una serie de reactivos necesarios para hacer la prueba y la bacteria será incubada, al día siguiente se verá a qué ha dado positivo la bacteria. Pueden estar miniaturizadas o no, hacerlas individualmente… en laboratorios grandes suelen estar mecanizadas y robotizadas, los paneles se introducen en un robot que detecta los cambios de color y los crecimientos y los identifica.
Se hace en todas las bacterias que crecen bien el 24- 48 h, es la más barata y la más conocida.
Identificación de hongos filamentosos Se deja a la colonia que crezca para ver qué color presenta y también por la forma de los conidios y conidióforos, partes que se diferencian para producir las esporas. Esto puede llegar a tardar unas 2 semanas. Los filamentos primero crecen dentro del agar, luego los aéreos y luego los conidióforos. No se pueden identificar bioquímicamente porque los hongos no se pueden desenganchar del agar, por lo tanto no se puede poner una suspensión homogénea. Para ver la estructura de los conidióforos se coge un celo transparente y se pone encima de la colonia enganchando los conidióforos y en un porta ponemos una gota de azul de lacto-fenol para hacer contraste y se pone el celo, los conidióforos se teñirán y ya se puede observar al M.O con objetivo de 40X. Penicillum tiene forma de pincel, Microsporum y Epidermophyton tienen forma cónica, son hongos dermatóficos y producen lesiones en la piel.
Efecto citopático Para identificar los virus. Cuando se siembran en una línea celular producen un efecto citopático característico. Por ejemplo el virus de la polio hace que las células se desenganchen teniendo una forma redonda característica. El virus respiratorio sincitial produce sincitios, las células que crecen en monocapa se fusionan por las membranas y se forman células mononucleadas. El virus de la varicela- zoster no produce que las células se separen, junten, sino que podemos observar que en su núcleo aparece un material extraño que son cápsides víricas, cuerpos de inclusión.
Podemos también identificar a los microorganismos por sus antígenos con anticuerpos específicos. Una bacteria cualquiera está llega de antígenos y su flagelo también. Las bacterias, los virus, los hongos están llenos de antígenos y se pueden obtener anticuerpos que solo reaccionen frente a esa estructura. A parte de pruebas bioquímicas podemos identificar los microorganismos usando anticuerpos específicos que se unan a sus antígenos específicos, la identificación por detección de antígenos.
Técnicas de aglutinación Se puede detectar presencia de rotavirus en unas heces sin cultivar por esta técnica, que detecta antígenos de la cápside.
Inmunofluorescencia Lo principal es que el anticuerpo reconozca a su antígeno específico. La muestra sería un porta por ejemplo y se añade un anticuerpo marcado con una sustancia que emitirá una fluorescencia cuando sea iluminada con luz UV.
Estas pruebas se pueden aplicar directamente utilizando la colonia o sobre un cultivo donde ha crecido un virus o también sobre la muestra tal cual, porque es un método muy específico.
Chlamidia thrachomatis: cultivo celular donde ha crecido la chlamidia, solo las amarillas son fluorescentes y es un patógeno de persistencia intracelular obligada por eso hay otras células.
Enziminmunoanálisis Tenemos una sustancia llamada sustrato que es incolora y que cuando reacciona con el enzima que lleva enganchado el anticuerpo, cambia de color. Se puede hacer sobre cualquier soporte.
En la placa está el antígeno que buscamos, puede quedarse adherido en el plástico o bien a un anticuerpo que en el pocillo ya puede estar. Se puede poner el anticuerpo ya con la enzima unida y si se pone encima el sustrato este cambiara de color. Si el anticuerpo no está el antígeno se va.
Inmunocromatografia Mejora de la inmunología. Nos permite a partir de una colonia o muestra cualquiera detectar específicamente la presencia de un microorganismo en 15 minutos, también tiene una complicación técnica importante.
Tenemos una tira de papel especial, abajo está absorbido pero no enganchado un anticuerpo marcado como el 1, que reconoce al antígeno y que lleva una partícula de color. El anticuerpo 2 sí que está enganchado a la tira y también reconoce al antígeno.
El ac3 también enganchado a la tira no reconoce el antígeno, reconoce al anticuerpo número 1. La muestra necesariamente tiene que ser líquida para que suba la fase líquida por la tira que es una fase estacionaria.
El ac1 también irá subiendo así como los antígenos a la zona de ac2. El ac2 hace de ancla y los atrapa. Si la muestra es positiva aparecería una raya de color azul porque ha habido un efecto de la concentración del color. La segunda raya es para ver si da negativo, es un control de calidad, realmente el anticuerpo 1 ha subido hacia arriba del todo.
Se presentan en formatos como los immunocards.
MALDITOF: espectrometría de masas Ionizar molécula que dependiendo de su masa de mueve de forma diferente y esto nos permite detectar la masa molecular. Se coge la colonia y hay que partir de un cultivo puro, se introduce en el MALDITOV y este nos hace un gráfico con las masas de las proteínas de esa bacteria (especie de proteinograma).
Las bacterias tienen espectros de MALDITOF específicos.
Identificación por detección del material genético Se pude identificar cualquier microorganismo detectando una secuencia específica. La identificación se basa en la utilización de sondas.
Métodos de conservación    A corto plazo: se va re-sembrando continuamente. Como mucho 2 meses.
A medio plazo: se pueden congelar pero se tiene que hacer en soluciones acuosas con alto contenido en materia orgánica, por ejemplo una solución acuosa con leche desnatada para que no se formen cristales de hielo. Como mucho 3 años.
A largo plazo: liofilización, que consiste en deshidratar una muestra congelada (se hace el vacío). En ningún momento pasa de solido a líquido y de líquido a gas, solo de solido a gas. Cuando se quiere recuperar solo hay que echar agua. Para siempre.
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