Seguimiento in vivo de moléculas intracelulares (2013)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Genética - 1º curso
Asignatura Microbiologia
Año del apunte 2013
Páginas 2
Fecha de subida 20/10/2014
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SEGUIMIENTO EN VIVO DE MOLECULAS INTRACEluLAREs Tenemos muchas proteínas fluorescentes y cad auna de esas proteínas tiene un espectro determinado con una longitud de onda de excitación, y de emisión. Si somos capacces de manipular el genoma, nos interesará hacer, si sabeoms la secuencia de una proteína, si nosotros podemos tener la secuencia florescente, tendremos que tallar el DNA, junta el DNA para hace un gen quimeric y poner ese dentro de una célula paraque lo incorpore a su interior *1 (dibujo) la celula estará viva y podremos ver como se distribuye esta celula a cap del temp in vivo.
(D) lo de la izquierd fibroblasto . Vamos lo que se mueve, marcascn una proteína fluores una mitoconedrial y vamos al microscopio de fluoresencia y vemos cómo las mitocondrias se mueven.
Tmbién podemos marcar la tubulina de una celula y ver cómo se distribuyedurante la mitosis.
(D) diferentes estrategias, y todas relacionadas cn movimiento. La primera: EL FRAP: recuperacion de la florescencia despues el blanqueado.
Tenemo una celula y marcamos una mprote de membrana con una florescente. Tenemos prote de membrana que es florescente entonces. Se distribuye por toda lamembra de la célula , una vez que la irradiamos, con un laser una zona un buen rato y eso inhibe la fluorescencia. Al rato miramos al cabo del tiempo loq ue sucede: vuelven a aparecer. Esta zona ha recuperado la florescencia . Qué puede implicar aquesta recueración? Que se mueven. Que una prote forescente se ha difundido y ha llegado a esa zona. Por tanto nos demuestra que la mebrana plasma es fluida y que las prote se mueven en aquesta bicapa lipidica. Aixo es al que vaurian. (mirar gráfico) las que se han blanqueado no recuperan la florescencia.
Cómo se puede restringir el movimiento. ? 8En el nucleo se ve que no recupera fluorescencia.
Puede ser con proteínas de otra celula, con uniones, que las proteínas estuvieran fijadas, encuradas a algun elemento del exterior o del inerior. Si hablamos de la membrana nuclear puede ser por el citoesqueleto .
otra manera de ver movimiento es PJOTOACTIVACION Tener una molécula fluorescente que la tengamos em paquetada. La tenemos como dentro de la capsula, y por tanto no es florescente. Jo mediante un tratamiendo determinado lo que hacemos es abrir la capsula y se ve que esta proteina se devingui fluorescente. Exemple: a la derecha fotos: serie secuencual de una placa metafásica. En azul es un colorante que lo que hace es marcar el DNA. Todos los cromosoomas están alineados a la placa. Tmién tenemos los microtúbulos que salen e cada polo y van a engancharse a los citocoros. Todos los microtubulos están marcadas con tubulina que es fluorescente, proteína vermella. (foto A) . A més a més de la tubulina marcada con prote florescente vermella, tenemos una tubulina de color vert que está empaquetada. Llavors dintra de toto lo que es los microtubulos, habrá vermella y verde y la verda no la ves xk está empaquetada. Lo que haces es desempaquetarlacuando irradiu, irradiamos solamente el costat de los cromosomas. Cuando hemos irraiado aquella tubulina verde empaquetadde se desempaqueta y se deviene vert, esperamos y vemos qué pasa. Con el tiempo esta tubulina se desplaza © hacia el polo (D). Qué quiere decri eso? Que las proteínas se mueven.
*2 qué es un microtubulo? A vermella vemos que al cabo del tiempo , la distancia desde el polo hasta el cinetocoro no varía, por lo tanto el microtubulo no crece ni decrece, tiene logitud estable.
Pero la otra nos dice que hay algo que se mueve, eso quiere decir qu ehay un movimento de subunidades, que entran por polo positivo y se van moviendo uy salen por el polo negativo.
Cuando hacemos que se hagan verdes es que al final va moviendo porque entran otras y estas acaban saliendo por la parte negativa *3!.
(D) LA FRET (la necesitamos para el problema) transferrencia de energía por resonancia. Cuando hablambamos de flurocromos: tenemos molecula que al iluminarse los electrr psuben de orbital y para volver a estado de reposo se tiene qu perder energía. La emisión de fluorescencia no solo es la forma de perder energía, puede ser por calor, o se puede transferir tmbien. La FRET siver para determinar interaccion entre dos poteínas diferentes, o de diferentes dominios de una diferentes proteínas.
Consiste en trabajar con dos proteínas florescentes que tengan su espectro solapado *4 (mirar dibujo hoja). Imaginamos que tenemos dos proteínas (voy a dibujar todo esto en *5 por detrás) iluminamos la muestra con la longitud de onda que excita a la Blue, (BFP) y loq ue pasa es que esta elimina lux de color azul. Esto sucede cuando la distancia entre las dos proteínas es más grande de 2 nm. Si están más jntas de eso, molt properas, cuando excite la Blue, como estarán tan cerca, en vez de emitir florescencia , transmitirá la energía a la green, y será la gree, que ahora está excitada, dará lloc a florescencia verde. Por lo tanto lo que mide son interacciones. Si interactúan, habrá FRET, transferencia de enrgía y veremos florescencia verde, si no interactúan estarán distanciadas y nunca habrá FRET: esto puede ser con dos proteínas o puede ser con una sola proteína . Puede ser que tenga proteína de mebrana con dos dominios citosolicos (*6) y hace un cambio conformacional y los dominios se quedan muy cerca. Marcamos ls dos e irradiamos. Y si irradiamos el azul y se enciende el verde es porque ha sucedido e interaccionan.
(D) lo siguiente no nos lo explicará pero lo tenemos como base, con anticuerpos para marcar proteínas y ác nucleicos para arcar DNA específicos.
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