Tema 1 (2014)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Bioquímica - 2º curso
Asignatura Cultius cel·lulars
Año del apunte 2014
Páginas 11
Fecha de subida 21/02/2015
Descargas 22
Subido por

Vista previa del texto

María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 Tema 1: EQUIPAMENT BÀSIC D’UN LABORATORI DE CULTIUS PETITA HISTORIA DEL DESENVOLUPAMENT DELS CULTIUS CEL·LULARS 1885, Roux: Descriu per primera vegada que si agafem cèl·lules d’un organisme viu i les posem en dissolució salina no es moren sinó que es mantenen vives durant un cert temps, per tant, obre la porta a experimentació amb cèl·lules provinents d’organismes vius.
1910, Rous: Indueix tumors a pollastres agafant cèl·lules tumorals, lisant-les i filtrant aquest lisat, el que produïa la generació d’un tumor en pollastres. Per primera vegada es veu que en el tumor hi ha un element que es capaç d’actuar sobre les cèl·lules sanes, més tard es descobrirà que el responsable és un virus (el sarcoma de Rous).
Amb ell va treballar Duran Reinals, que estableix la teoria que els càncers, els tumors, eren induïts per virus (és una teoria més general que la de rous) però afirma que tots els tumors estan provocats per infeccions víriques i per tant, Rous mai no va acceptar aquesta teoria, que actualment sabem que és falsa.
1913, Carrel: Per primera vegada extreu cèl·lules, teixits i òrgans d’un animal i els manté vius durant molt de temps subministrant nous medis de cultiu i sobretot mantenint les condicions d’esterilitat per evitar contaminacions. La literatura afirma que aquest òrgans van estar vius durant aproximadament 20 anys però el cert és que mai no s’ha pogut reproduir un experiment de tal característiques perquè les cèl·lules tenen una capacitat de proliferació limitada i per tant, hi ha un moment que pateixen un procés de senescència i deixen de reproduir-se. Els seus experiments van ser premiats amb un Nobel i va desenvolupar un medi de difusió continua, un sistema (sistema de perfusió) per subministrar medi fresc contínuament al teixit. Aquest sistema va obrir la via a generar transplantaments d’òrgans perquè es podia mantenir un teixit viu forma d’un organisme sense que aquest perdés funcionalitat.
1948, Earle: Primerament hem de tenir present que hi ha un buit espaial per els Guerres Mundials que es pateixen i per tant, la investigació queda aturada. Earle reobrirà la investigació clonant per primera vegada les cèl·lules per obtenir una línia cel·lular on totes les cèl·lules són idèntiques genèticament.
1952, Gey: Estableix la primera línia cel·lular que prové d’un teixit humà i aquesta és anomenada línia HeLa, que actualment es troba en gairebé tots els laboratoris.
1954, Levi Montalcini: Descriu que hi ha molècules molt específiques que estimulen un canvi de comportament en les cèl·lules de cultiu. Modifica aquest factor de creixement que permet el creixement de cèl·lules nervioses en cultiu. Aquest aspecte és molt important perquè hi ha molècules que poden modificar el comportament de les cèl·lules en cultiu i per tant, es bo saber com treballar amb aquestes molècules. Això suposa l’inici d’una nova etapa en que s’intenta buscar aquestes molècules.
Inici d’una etapa en que es busquen els mecanismes sistemàtics sobre el creixement de la cèl·lula en cultiu i per tant, es posen a punt els sistemes de cultiu que encara són utilitzats avui en dia.
1 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 1961, Hayflick i Moorhead: Descriuen per primera vegada que les cèl·lules que provenen d’un teixit normal tenen una vida en cultiu limitada, és a dir, tenen la capacitat de proliferar un nombre limitat de vegades i que a partir d’un determinat moment per molt que subministrem el mateix cultiu i mantinguem les menteixes condicions les cèl·lules entren en un procés de senescència i moren. Una possible explicació d’aquest fet és per l’escurçament dels telòmers en cada divisió; d’aquesta manera un cultiu de cèl·lules de nen petit durarà més que no un cultiu de cèl·lules d’un adult ja que els seus telòmers són més grans.
1964, Littlefield: Es comencen a identificar cèl·lules mutants i medis selectius que permeten el creixement de determinades cèl·lules. El medi HAT va ser utilitzat per diferents virus i s’aconsegueix per primera vegada fusionar cèl·lules de ratolins i humanes perquè tinguessin unes determinades característiques.
1975, Köhler i Milstein: La tècnica anterior es va estendre i es va arribar a fusionar limfòcits productors d’un anticòs amb cèl·lules portadores per obtenir un hibridoma, una cèl·lula híbrida que s’utilitza per produir un anticòs determinat.
Suposem que tenim una proteïna animal i una molècula que reacciona contra aquesta i que per tant, produeix un anticòs.
Si agafem els limfòcits productors d’anticossos d’un animal i els fusionem amb una cèl·lula normal, la nova cèl·lula hibrida adquireix dues propietats: és immortal (es pot dividir infinitament) i secreta, produeix l’anticòs. En 1975 es el primer any en que es produeixen anticossos.
1986, Martin i Evans: Aïllen cèl·lules mare embrionàries pluripotents a partir d’un ratolí.
1998, Thomson i Gearhar: Aïllen per primera vegada cèl·lules embrionàries humanes.
2006, Yamanaka: Es generen per primera vegada cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPS cells) el que va ser premiat amb un premi Nobel.
APLICACIONS DELS CULTIUS CEL·LULARS Els cultius cel·lulars ens permeten obtenir un ampli ventall de coneixement i gran part dels coneixements que s’aconsegueixen en altres ciències són gràcies a cultius cel·lulars ja que són una font de material que es pot utilitzar en diferents àmbits. En general els cultius ens permeten:  Estudiar el comportament cel·lular  Veure com les molècules afecten al funcionament cel·lular perquè les podem extreure.
 Veure la relació entre les cèl·lules  Obtenció de productes d’interès: vacunes, anticossos, hormones...
 Reproducció assistida Sabem doncs que els cultius cel·lulars no són una ciència en ells mateixos però si que són utilitzats per moltes branques de recerca.
2 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 EQUIPAMENT BÀSIC D’UN LABORATORI Manteniment d’un ambient estèril: campanes Durant la manipulació amb cultius cel·lulars necessitem una regió del laboratori en que hi hagi un ambient estèril, sense que els medis cel·lulars es puguin contaminar i per tant sempre es treballa amb cabines de flux d’aire (poden ser de flux vertical o horitzontal). La cabina és una poiata en que d’alguna manera entra un aire estèril que manté tot l’ambient amb aquesta característica d’esterilitat.
Hem de tenir present que la superfície de la cabina ni el que introduïm en ella és estèril sinó que ho és únicament l’aire i aquest aspecte és realment important.
Cabines de flux vertical L’aire entra des del sostre de la cabina a través d’un filtre, és impulsat i per tant, es genera un flux vertical, el que impedeix que entri aire contaminat de l’exterior. Normalment tenen a la part anterior una placa de vidre de metacrilat que l’investigador (que es posiciona assegut) té davant del seu nas, el que impedeix també que l’aire que respira i expira entri en contacte amb el medi de cultiu i el contamini. La placa permet que els braços de l’investigador entrin a l’interior.
Normalment a la part inferior (la taula de la poiata) trobem uns forats que permeten que l’aire que entri vagi cap a sota i que sigui reutilitzat un cop és filtrat i és estèril. Els filtres (filtres hepa) tenen una làmina que es va plegant en unes plaques, que poden ser d’alumini per exemple, i que direccional l’aire cap a una regió concreta ja que estan formades per fibres. La barreja de fibres generen uns porus que no poden travessar ni virus ni bacteris però si els gasos.
Aquestes són el tipus de campana que més s’utilitzen per treballar amb cultius.
3 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 Cabines de flux horitzontal Hi ha alguns tipus de tècniques que requereix d’un ambient estèril i que alhora impliquen la utilització de material òptic com per exemple en laboratoris de reproducció en que és totalment necessari lupes per manipular els embrions i les cèl·lules reproductives.
Per aquest tipus d’investigació es necessiten cabines de flux horitzontal.
L’esquema d’aquest és bàsicament el mateix: tenen un ventilador que impulsa l’aire i aquest passa per un filtre. L’aire surt des de l’interior de la campana i va cap a l’investigador de manera que no tenim cap vidre davant d’ell. S’utilitza aquest tipus d’estratègia perquè amb un flux vertical els microorganismes que es trobessin sobre el material òptic sèrie conduits cap a la mostra.
Correcta forma de treballar Sempre és totalment necessari netejar la superfície de la campana amb etanol al 70% tant abans de començar a treballar com al acabar. També és important cada un temps netejar les parets de les campanes.
Per tenir uns bons resultats és imprescindible treballar de forma ordenada, hem de tenir present que el principal problema en la manipulació de cultius són les contaminacions ja que aquestes s’extenen i per tant sempre hem de ser acurats en treballar i intentar mantenir al màxim l’esterilitat (un exemple seria que si la pipeta toca la superfície de la campana o de l’ampolla deixa de ser estèril i per tant, hem d’utilitzar una nova i descartar aquesta).
Durant el treball el que sempre es manté estèril és l’aire però el material està contaminat. Els medis de cultius es trobaran en flascons que també són estèril en l’interior però no en l’exterior..
Autoclau Aquest és el mètode per el qual els productes que utilitzem són estèrils, sempre estaran indicats amb una etiqueta groga amb franges negres.
4 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 Sistema de purificació d’aigües Hem de tenir un sistema de purificació de l’aigua i aquesta aigua purificada és pràcticament idèntica en tots els llocs i per tant, es pot utilitzar els medis. Els medis que s’utilitzen per cultivar cèl·lules animals és esterilitzat per filtració, això vol dir que aquests filtres es posen en una espècie de xeringues. Si generem una gran proporció de medi aquest procés s’elabora a gran escala amb una bomba que fa passar el medi pel filtre i l’introdueix en un flascó o ampolla completament estèril (existeixen diversos sistemes però tots es basen en la filtració).
Incubadors de CO2 Aquest és un material imprescindible en un laboratori ja que serveix per mantenir la temperatura estable i per generar una atmosfera adequada perquè el pH sigui constant. Hem de tenir present que hi ha de més senzills o més complexos però que generalment tenen una camisa d’aigua que serveix per mantenir la temperatura de forma més o menys constant gràcies a la creació d’un reservori energètic. La generació d’aquesta camisa però, comporta un manteniment ja que l’aigua (destil·lada) sempre es troba a 37C i es poden donar problemes de corrosió si el manteniment no és l’adequat.
Hi ha incubadors que no tenen aquesta camisa d’aigua sinó que tenen una sèrie de termòstats que engeguen un sistema d’escalfament amb un conjunt de ventiladors.
5 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 L’interior d’aquests incubadors de CO2 (és necessari per mantenir el pH constant) està formant per acer inoxidable i per tant, han de tenir una neteja constant i continuada. A l’interior d’aquest normalment torbem una safata en que hi ha aigua tractada (perquè no indueixi a contaminacions) que serveix també per mantenir la humitat i evitar que l’aigua dels cultius s’evapori ràpidament.
Podem trobar d’altres incubadors (amb un cost econòmic més elevat) que estan formats en el seu interior per coure, un material antimicrobià i antifúngic, de manera que no permet el creixement de contaminació i per tant, el manteniment dels cultius és més estable. Hem de tenir present, que en l’aire podem trobar espores, que poden entrar lliurament en l’incubador al obrir les seves portes i per tant, elaborar una contaminació de tots els cultius.
Material òptic Sempre és necessari la presència de material òptic per poder visualitzar els cultius que estem elaborant, veure com creixent les cèl·lules i per tant, tenir un control del seu creixement per tal de saber en quin moment les hem de subcultivar o per saber si el creixement es dona correctament.
Sabem que no podem tenyir les cèl·lules ja que la tinció provocaria la seva mort de manera que, hem de tenir un sistema òptic específic per veure les cèl·lules en el seu estat viu ja que aquestes no tenen color. Així doncs es fan servir diferents tècniques que ens permeten posar de manifest la superfície de la cèl·lula com per exemple el contrast de fase o la tècnica de Nomarski.
Tècnica de contrast de fases Observem en la següent imatge (avall esquerra) un cultiu que ha arribat a monocapa, en que ja no hi ha espais entre les cèl·lules. Si ens fixem podem veure una rodoneta amb punts negres més foscos, que correspon al nucli amb els seus nuclèols. Quan les cèl·lules arriben a aquest estat cal desunir-les del medi i subcultivar-les (ho veurem més endavant).
El contrast de fase es basa en l’índex de refracció de les diferents zones de les cèl·lules, el que ens permet veure un contrast amb més o més llum, veure zones més fosques o més clares.
En la següent imatge (avall dreta) podem observar un espermatozoide que ha fecundat una cèl·lula.
6 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 Microscopi invertit amb contrast de fases El microscopi de contrast de fase el que fa és fer incidir la llum (els fotons de la llum blanca) sobre la mostra però de forma obliqua a la mostra i no de forma perpendicular (microscopi normal).
Aquest aspecte és possible perquè el condensador del microscopi té un diafragma que només dispersa una quantitat de llum de forma obliqua.
Sabem que la llum ve de l’aire i arriba a la superfície del vidre: si incideix de forma perpendicular segueix la seva trajectòria però si incideix de forma obliqua els fotons són refractats amb un determinat índex de refracció.
L’índex de refracció de les parts de les cèl·lules generalment no és molt diferent però si que presenta algunes diferencies de manera que hi ha alguns rajos que no són refractats i altres que si que ho són.
El contrast de fases fa coincidir al mateix temps els fotons que no són refractats i els refractats, de manera que com aquests últims estan desviats tenen una fase diferent, el que ens donarà una imatge amb contrast: les zones que quasi no tenen refracció apareixen més clares i les que estan més refractades són més fosques. Aquest mètode ens permet observar cèl·lules vivies.
Aquests microscopi a més, tenen una altra peculiaritat, i és que són invertits. Normalment en les observacions de cultius cel·lulars tindrem les cèl·lules en una placa de petri, que queda molt allunyada del objectiu del microscopi normal i per tant, la capacitat que té la lent per enfocar és molt petita, el que no ens dona una bona imatge. En un microscopi invertit el que fem és que els objectius en comptes de situar-se a la part superior es troben a la part inferior, de manera que, en la platina el que veurem serà la lent de objectiu, que es trobarà a prop de les cèl·lules i per tant tindrà prou profunditat de camp com per poder enfocar.
Hem de tenir present que utilitzem microscopis invertits per tal de poder enfocar la capa que ens interessa de les cèl·lules i de contrast de fase perquè volem visualitzar les cèl·lules en el seu estat viu i amb llum blanca aquestes no són visibles.
Microscopis de fluorescència De vegades podem tractar les cèl·lules perquè expressin una molècula que és fluorescent de manera que sabrem si la cèl·lula ha incorporat un determinat gen. Amb aquest tipus de cèl·lules utilitzem microscopis de fluorescència (n’hi ha també de normals i d’invertits, que són els que ens interessen).
El sistema és molt similar a l’anterior però la llum que fa incidir és ultraviolada i si la mostra té fluorocroms aquests s’excitaran i emetran llum, que serà el que detectem, generalment, sobre un fons negre. Només detectem la llum que emeten els fluorocroms, que tenen sempre una longitud d’ona més gran i és menys energètica respecte a la llum incident. La llum ultraviolada arriba pel mateix objectiu per el qual nosaltres més tard captarem la llum.
7 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 Observem en la següent imatge una larva de Caenohabditis elegans, un cuc molt utilitzat en desenvolupament perquè en adult te al voltant de 1090 cèl·lules i se sap des del moment de la fecundació, en que tenim una cèl·lula, a quina cèl·lula donarà lloc i per tant quina és la diferenciació que es seguirà. Hem de tenir present que totes les cèl·lules presenten un genoma però desprès s’especialitzen per la producció de determinades proteïnes. En la imatge observem en blau el nucli i en vermell els microfilaments d’actina; els punts és on hem marcat la proteïna binculina de la matriu extracel·lular.
Microscopis confocals El principi bàsic d’aquests microscopis és el marcatge de les cèl·lules amb fluorocroms que emetran fluorescència però en lloc d’utilitzar una font de llum d’una bombeta que emeti llum ultraviolada utilitzarem un làser, que tindrà una longitud d’ona específica, que ens interessa.
Imaginem que tenim una cèl·lula i la il·luminem amb un microscopi laser confocal; gràcies al laser, que és capaç de tenir obertures confocals molt petites podem enfocar aquest foc de llum en un punt molt concret de la mostra, és a dir, podem il·luminar un punt concret de la mostra, el que ens permetrà obtenir un pla d’aquesta i també ens permet la possibilitat de generar diferents plans en funció de l’alçada.
La imatge que obtenim de cada pla és una imatge molt nítida i ho és molt més que en el cas del microscopi de fluorescència ja que en aquest últim no tenim la capacitat de enfocar el feix de llum en un punt concret de la mostra (una cèl·lula, per exemple) de manera que enfoquem tota la mostra el que provoca que els cromòfors s’excitin i per tant, és una imatge menys nítida, Normalment els microscopis també poden portar unes càmeres per mantenir la pressió de CO 2 de manera que actuaria com un petit incubador que no permetria la mort de les cèl·lules.
8 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 Sistemes de recompte cel·lular Durant l’experimentació necessitem elaborar un recompte de les cèl·lules i per això és totalment necessari que aquestes es desenganxin, les puguem contar i les dividim en el nombre de flascons adients per continuar l’experimentació.
Existeixen diferents sistemes per elaborar aquest recompte.
Hemocitòmetre Aquest és el sistema més senzill i també és anomenat cambra de Neubauer.
Consisteix en un portaobjectes més gruixut del normal que està escabat i marcat amb una sèrie de ratlles de manera que quan posem un cobreobjectes a sobre del escabat (part blau cel) i entre el cobreobjectes i l’hemocitòmetre posem el fluid en que hi ha les cèl·lules (part lila) sabem que a la regió central en que -4 s’ajunten les ratlles horitzontals i perpendiculars el volum és sempre de 10 ml.
Això ens permet, introduir una gota del nostre cultiu cel·lular i elaborar un recompte de les cèl·lules que tenim en aquest volum determinat; sabent el volum total del nostre cultiu podem extrapolar el nombre de cèl·lules que tenim.
Podem tractar les cèl·lules amb colorants supravitals, colorants que només ens marquen les cèl·lules mortes o aquelles que tenen la membrana danyada. En la imatge les veiem tenyides de colorant blau i això és perquè el colorant pot entrar a la cèl·lula gràcies a que la seva membrana es troba danyada.
Recomptadors cel·lulars automàtics És un sistema semiautomàtic en que tenim una espècie de portaobjectes en el que carreguem el fluid i que s’introdueix sobre una ranura que elabora el recompte de cèl·lules per mitjà d’un sistema òptic. Aquest és un sistema més car ja que cada portaobjectes és únicament d’un sol us.
Altres sistemes Existeixen altres sistemes que es basen en la capacitat de passar un fluid amb cèl·lules per una ranura i que aquestes modifiquin un determinat camp magnètic o elèctric, la distorsió del camp també dependrà de la mida de les cèl·lules (cèl·lules més petites menys distorsió). Aquest tipus de mètodes són molt utilitzats en recomptes cel·lulars sanguinis i per tant, estan presents en laboratoris d’hematologia.
Hi ha altres sistemes més senzills que tenen unes punts en que carregues el líquid i a mesura que passen les cèl·lules d’una regió a una altra mesuren les distorsions que es produeixen i que fins i tot ens poden dir la mida de la cèl·lula.
Aquest és un sistema molt ràpid (respecte l’hemocitòmetre) però també molt car.
9 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 Criopreservació: Tancs de nitrogen líquid Necessitem de llocs en que puguem reservar es cèl·lules quan no les utilitzem i aquest sistema ha de permetre, que al recuperar-les aquestes no hagin perdut viabilitat. Existeixen dos mètodes diferenciats.
Congeladors a -80°C És un sistema que serveix per poc temps ja que si mantenim les cèl·lules durant anys en aquest estat al final acaben perdent viabilitat com per exemple capacitat de divisió. Així doncs, és un sistema que ens servirà per exemple per mantenir les cèl·lules durant un o dos mesos.
Nitrogen líquid Submergim les cèl·lules en nitrogen líquid, que està aproximadament a -196 °C i es mantenen en uns tancs. La seva viabilitat mai no es veu afectada. Podem aconseguir de dues maners que les cèl·lules adquireixen la temperatura esmentada anteriorment:  Sucar les cèl·lules en nitrogen líquid  Mantenir-les en el vapor de nitrogen líquid Sempre és important que s’arribi a la temperatura de forma gradual. Respecte els mètodes anteriors hi ha investigadors que afirmen notar diferències mentre que d’altres afirmen que és el mateix.
DISSENY D’UN LABORATORI DE CULTIUS CEL·LULARS Exemple 1: laboratori no apte Aquest laboratori que podem observar no seria un vol laboratori de cultius per varis motius:  En l’interior del laboratori trobem piques d’aigua i aquestes són una font de contaminació, sempre s’ha d’intentar aconseguir tenir l’ambient més estèril possible.
 No podem tenir en la mateixa poiata un comptador cel·lular i una centrífuga perquè aquesta última produeix vibracions que poden interferir en el recompte cel·lular, el que induirà errors en l’experimentació. Hem de tenir present que un incubador tampoc no podrà estar en la mateixa poiata perquè les cèl·lules, per la vibració, no es podran adherir correctament.
 Les bombones de CO2 estan a l’interior del laboratori però això és un error. Òbviament necessitem CO2 en el laboratori perquè aquest ha d’arribar fins als incubadors però que estiguin al interior és perillós perquè si hi hagués una fuita aquest gas desplaça totalment a l’oxigen i per tant, poden haver-hi accidents molts greus. Un laboratori sempre ha d’intentar mantenir el CO2 fora del laboratori i alhora instal·lar un sistema de control dels nivells d’oxigen (situats a l’alçada del pit de la persona més baixa que treballa allà) 10 María Monteserín Cuesta Judith González Gallego Cultius cel·lulars T1 Exemple 2: no correcte En aquest cas el que està mal fet són les cambres de CO2, que es segueixen mantenint a l’interior.
Exemple 3: Bona planificació del laboratori Aquesta és una bona planificació i només caldria modificar que la centrifuga i el comptador cel·lular es troben a la mateixa poiata.
Cambres de creixement de cultius Quan s’elabora una gran producció a vegades és important o recomanable tenir petites cambres o habitacions pel creixement de cultius i aquestes sempre s’han de mantenir a 32°C de forma uniforme, és a dir, ha de tenir la mateixa temperatura a la part inferior que superior. Necessitem una sèrie de termostats i un mecanisme de reciclatge de l’aire que eviti una acumulació de l’aire calent a la part superior i de l’aire fred a la part inferior, el que afectaria al creixement cel·lular.
11 ...