Tema 2: Vectores de clonaje 4/4 (2017)

Apunte Español
Universidad Universidad Autónoma de Barcelona (UAB)
Grado Biotecnología - 2º curso
Asignatura Tecnología del DNA recombinante
Año del apunte 2017
Páginas 10
Fecha de subida 03/10/2017
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Tema 1 de Tecnología del DNA recombinante

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TEMA 2 VECTORES DE CLONAJE TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE.
María Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología.
Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología CLONAJE DE PRODUCTOS DE PCR. VECTORES pTOPO (I).
Trataremos el vector con la topoisomerasa I de Vaccinia, que es una enzima que coge la secuencia CCCTT (y sólo sobre esta) y produce un corte después del fosfato 5’.
Hace un corte sobre el segundo enlace éster del segundo enlace fosfodiéster, para generar un nuevo enlace éster fosforado + tirosina 274 de la enzima.
Es decir, la energía del enlace roto se conserva mediante la formación de un enlace covalente entre la tirosina de la topoisomerasa I y el DNA. (*) - T-O-P-| | O-N Quedará un P en el 5’ del vector circular, ahora lineal. Puede venir el inserto sobre el OH 3’.
Cantomicina: inhibe la religación del producto que ha quedado cortado. Entonces, si la añadimos a la reacción obtenemos el producto cortado.
- Cromatografía para eliminar cantomicina.
Precipitación con etOH.
Intercambio iónico para la purificación del vector: el vector solo hace falta que se le ponga un inserto, no hace falta ligasas ni nada.
1 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología En el otro lado estará la secuencia complementaria, es decir, estará enlazada covalentemente la enzima al DNA.
(*) Cuando pongamos nuevamente el producto de PCR romo sobre eso, se revierte la reacción.
Es decir, el posterior ataque de este enlace por un extremo 5’-OH revierte la reacción, que se puede aprovechar para ligar moléculas romos procedentes de una PCR.
Quedará el vector enlazado covalentemente y la topoisomerasa de Vaccinia libre. Quedarán dos nicks, pero no hay problema para que se replique.
Como el producto de PCR genera un enlace covalente con una cadena pero no con la otra, la topoisomerasa de Vaccinia es incapaz de continuar trabajando ya que requiere enlaces covalentes en los dos lados.
Gracias a este método en una hora ya puede estar transformado.
Fabricación: - - Un vector con enzima de restricción deja extremos romos.
Utilizamos una DNA polimerasa terminal transferasa (la única eucariota que no necesita molde para copiar, pone nucleótidos en 3’) + ddNTP sobre el vector cortado por la enzima de restricción que ha dejado extremos romos.
Se purifica las enzimas que queden. Es decir, el T dd o una Td, será el extremo de este vector.
No hace falta que el ddTTP tenga nada más ya que no liga y quedará un nick, pero entre la A del inserto y la siguiente, liga y funciona.
Ahora bien, los extremos romos son costosos de clonar, podemos clonarlo con un vector T poniendo terminal transferasa, pero es caro.
Otra solución es poner DNA polimerasa normal (I, Klenow o Tac) al final de la PCR, para que no intervenga en la producción de los insertos ya que no tienen actividad correctora de pruebas, entonces solo queremos que actúe una vez se han sintetizado y solo faltan las As.
Entonces, la DNA polimerasa añade una A cuando acaba: el 50% del producto quedará con A sobresalientes en el 3’-OH. Es decir, la A independiente de molde solo se pone, aproximadamente, en la mitad de los casos. Aunque es menos eficiente que la terminal transferasa es más barato.
Producto PCR + vector + T4 DNA ligasa + ATP y esperar overnight: al día siguiente estará transformado.
Producto de PCR + vector T y después lo transformamos sobre células compatibles.
2 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología CLONAJE DE PRODUCTOS DE PCR. VECTORES pTOPO (II).
Explicación 1: También se pueden clonar productos de PCR con extremos A sobresalientes. Para hacerlo, se interponen entre las CCC y TT dos dianas BstN BI.
Esta enzima de restricción es una nickasa. Todas las enzimas de restricción trabajan haciendo el corte de las dos cadenas, excepto BstN BI. Solo corta la cadena 5’GAGTC3’ y no lo hace unas bases más allá, de forma que la topoisomerasa de Vaccinia será capaz de hidrolizar una cadena y la otra.
Si entre medo ponemos dos dianas BstN BI, producirá dos nicks, pero no al mismo lugar en las dos cadenas y, por tanto, no tendremos una abertura del plásmido sino que seguirá cerrado con dos nicks.
Si la última N por donde corta BstN BI por casualidad es una A, cuando se corte con la enzima producirán dos A. Por tanto, se abrá generado un vector con la energía necesaria para volver a ligar (por la topoisomerasa) y tendrá también As sobresalientes.
CCCTT’ BstNBI BstNBI ‘AGGG GGGA’ BstNBI BstNBI ‘TTCCC Con la T sobresaliente, dejará un vector T que podrá religar con un producto de PCR con As sobresalientes.
3 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Explicación 2: La idea es colocar dos dianas bstnt1 esplayando la diana de la topoisomerasa. La cadena de arriba la topoisomerasa cortará. Tenemos una diana bstnt1: GAGTC y en la base 5 hace un corte. A diferencia de la topoisomerasa, la BstNBI es normal y la A después de la flecha queda 5’, normal mientras que la N de arriba de la izquierda queda N OH porque ha añadido un grupo fosfato. Depende de donde ooloquemos la diana bstN BI, las podemos dejar para que quede la diana que nosotros queremos: con extremos romos, sobresalientes, etc.
Explicación 3: Se prepara el vector que en su lugar de clonaje tiene las bases de la imagen de abajo. Entonces, la topoisomerasa de Vaccinia corta por las flechas rojas, pero continúa teniendo enlaces covalentes y hacen falta enlaces sobresalientes, por tanto, se interrumpe la secuencia incorporando dos dianas de restricción Bstn BI. Esta enzima de restricción es de tipo II, es una nickasa, la única que corta sólo una de las dos cadenas complementarias del DNA, la que tiene la secuencia GATC5’3’. Corta las cuatro bases estándar de esta secuencia, dejando extremos 5 fósfato. Entonces, sobre la secuencia larga se corta con topoisomerasa de Vaccinia (hace falta magnesio para cortar).
- La nickasa corta y la topoisomerasa por la T (queda donde está el P). Solo hace falta purificar y poner en un tubo para vender.
Claro, este no puede religar (foto), ya que tiene dos T sobresalientes.
INTEGRACIÓN POR RECOMBINACIÓN. SISTEMA “GATEWAY”.
4 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología Es similar a una estrategia pTOPO.
Hacemos un clonaje entre 4-5 días. La parte más larga es, precisamente, la reacción de ligación.
Hace falta que existan unas dianas de restricción, cortarlas, mezclar el producto de las dianas con el inserto que tenga dianas de restricción compatibles y al día siguiente transformar.
Que haya la diana, cortarla y ponerlo a ligar con el vector es un día y medio y, además, la faena de hacerlo es complicada.
Por otro lado, todos los proyectos de genomas han multiplicado x 1 millón la cantidad de clones de cDNA teniendo en cuenta que antes ya teníamos un número elevado.
Para expresar un cDNA de forma recombinante hay vectores de E. Coli: sb40... etc. Puede haber 30 o 40 solo para expresar de forma recombinante, es decir, la lista de vectores para trabajar con cDNAs es larguísima.
Si por cada vector tenemos que coger nuestro cDNA, cortarlo con enzimas de restricción y juntarlo con el vector es pufff mucha tarea porque tenemos muchísisimos cDNAs.
Como en todo, hay gente a la que se le ha ocurrido métodos para hacer este subclonaje de DNA de forma rápida y, además, prácticamente de forma simultánea con todos los vectores que queramos: el sistema Gateway.
El sistema Gateway hace una reacción diferente entre T4 DNA ligasa y la topoisomerasa, que es la reacción que se produce cuando pones el fago landa en E. Coli mediante ciclo lisogénico.
Una pequeña región del fago landa hace recombinación en la región attB del genoma de E. Coli.
Esto depende de la presencia de dos enzimas: 1. Integrasa (int) 2. Integration host factor (IHF).
3.
En presencia de estas dos enzimas tiene lugar una reacción unidireccional y al 100% , todos se encontrarían insertados en el genoma de E. Coli, produciendo la reacción de integración.
Si a la mezcla de estas dos enzimas, le añadimos una escisionasa (xis) tiene lugar la reacción contraria, de escisión, y el bacteriófago Lambda podría comenzar a hacer ciclo lítico.
Los attL y attR resultan de la recombinación del attP y attB, La reacción entre estos dos lugares L y R en presencia de estas encimas revierten la reacción anterior. Las reacciones son al 100% siempre. A día de hoy es el único sistema enzimático que permite hacer la reacción al 100%.
Las otras reacciones de integración son de equilibrio, el 50% de las moléculas quedan recombinadas y el otro 50% de las moléculas no quedan recombinadas.
Las del fago Lambda tiene la gracia de que es diferente. In vitro la reacción acaba en el equilibrio, pero el fago Lambda tiene una maquinaria distinta porque le añades un enzima más 5 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología para integrar y escindir, la reacción es siempre 100%. El 100% de los bacteriófagos nos aparecen dentro del genoma y no nos quedan bacteriófagos libres, es unidireccional.
Entonces, cuando un lugar P recombina con un lugar B, la recombinación se produce por las cajas 2. Se originan las cajas 4,2 y 5 que serían attL y las cajas 1,2 y 3 que serían attR.
La idea es: 1. Mediante integración creamos el vector de entrada 2. Mediante la escisión pasamos el vector de entrada a una expresión en E. Coli, levadura, etc.
Una vez tenemos creado el vector de entrada mediante el sistema enzimático de integración del fago Lambda, mediante una reacción de media hora pasamos el gen del vector de entrada a cualquier vector destino especializado para hacer una tarea diferente, podemos hacer los que queramos de forma simultánea. Ahí hay 6. Metiéndole los tres, la integrasa, la escisionasa y el integration host factor.
Preparar los vectores destinos es un lio, se compran, se compra el sistema para crear el vector de entrada.
SISTEMA “GATEWAY”. GENERACIÓN DEL VECTOR DE ENTRADA.
6 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología El sistema funciona por la mecánica enzimática de Lamda y por un concepto nuevo que no habíamos visto hasta ahora: la presencia de un factor de contraselección.
A diferencia de lo que es un factor de selección que seleccionan positivamente los portadores de la secuencia. Por ejemplo el gen de resistencia a ampicilina, que en presencia de ampicilina podemos seleccionar un plásmido con gen de resistencia a la betalactamasa porque la bacteria que no la porta caput.
Los factores de contraselección hacen todo lo contrario, permiten seleccionar negativamente los portadores de estas secuencias sobre condiciones determinadas.
- Factor de contraselección: eliminan las células portadoras Factor de selección: eliminan las células que no lo portan.
¿Cuáles serían estas condiciones determinadas? CcdB y ccdA, maquinaria de adición del factor F.
- CcdB codifica para la toxina -> estable CcdA codifica para la antitoxina -> inestable Si el plásmido se marcha, la toxina que ha perdido el plásmido se muere, por tanto, el B puede actuar como factor de contraselección en presencia de ccdA. Así, si ccdB se queda, se muere la célula, mientras que si se queda ccdA, sobrevive.
La contraselección en presencia de ccdB es un engorro porque no tenemos unas pinzas para quitar el ccdA de E. Coli.
Para contraseleccionar en presencia de ccdB se hace de una forma más creativa. Las células portadoras de ccdB son viables en presencia de la mutación gyrA462. Así, E. Coli es inmune a ccdB.
Volvemos, lo de rojo serían las secuencias correspondientes a attP, B, L o R. Entonces, nosotros hemos de hacer una recombinación entre dos cajas, pasamos el gen del centro a arriba a la izquierda.
- - ¿Cómo seleccionamos los vectores donde efectivamente ha tenido lugar esta recombinación? Una vez creado el vector de entrada, el vector destino nos lleva el gen ccdB.
¿Dónde tenemos el vector destino? En una E.Coli gyrA462.
¿Le pasa algo antes de recibir el inserto? No, porque ccdB permite crecer perfectamente en gyr462, que es una mutación en la girasa.
Después, el gen diana ha sustituido el ccdB.
Antes de hacer nada, el vector destino tiene el gen ccdB en una E. Coli gyrA462. Mezclamos el vector destino que tiene ccdB con el vector de entrada que es el que tiene el gen diana y ponemos la maquinaria enzimática, que transferirá el gen diana al vector destino y transferirá el ccdB al lugar que ocupaba el gen diana.
El vector diana que ahora tiene el ccdB ahora no será viable. El vector destino sí que será viable porque no portará el ccdB.
7 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología SISTEMA “GATEWAY”. CLONAJE EN LOS VECTORES DESTINO.
Una recombinación de attL con attR nos generará attB, y una attL con attR generará el attP.
Pero, attL podría recombinar con el otro attR, ¿no? Para que esto no pase y la replicación sea unidireccional (entre solo uno de los dos attR) Bs y Ps tienen pequeñas modificaciones.
Se crea un attL1 que solo puede recombinar con attR1 y un attL2 que solo puede recombinar con attR2, pero el resto es igual.
Dan direccionalidad a la reacción de integración o a la reacción de escisión.
Se varía un poco haciendo que cada uno solo pueda recombinar con uno.
Entonces, producto de la recombinación se produce un attp1 y un attP2.
Para tal de asegurar la direccionalidad de la recombinación se han diseñado los casets attB1, attP1 y attB2, attP2.
Por doble recombinación, esos cases darán lugar, respectivamente, a attL1, attR1 y attL2, atR2.
- LR clonasa: Int, IHF, Xis.
BP clonasa: Int, IHF.
8 Belén Pérez Sanmartín 2º Biotecnología REACCIÓN PARA EL INTERCAMBIO DE SECUENCIAS EN EL SISTEMA “GATEWAY”.
CcdB: gen de adicción procedente del factor F. Los plásmidos portadores de ccdB son viables en mutantes gyrA462 o bien en células portadoras de ccdA. Los plásmidos portadores de ccdB son letales en células gyr+.
La reacción en el sentido de arriba a abajo está catalizada por int e IHF mientras que la reversa por int, xis e IHF.
Y ahora jugamos, las cajas 3, 2 y 4 o la que queramos, la podemos entrar como colas en una reacción de PCR. Una vez entradas las primeras cajas podemos jugar con el gen diana y muchos vectores destino. Hacemos ir la reacción de integración o de escisión.
Como hay pequeñas modificaciones en las cajas permite solo que 5, y 1 puedan recombinar con 3,2,4. Nunca se podría producir con 4,3,2 por las pequeñas mutaciones que se introducen en cada uno de los lugares.
El entrecruzamiento tiene lugar por la caja 2. La escisionasa reconoce a la 5 y 1 flanqueando a la 2 y la 4 flanqueando a la 1, y la integrasa. Mientras que la xis e ihf, la 4 a la 5 y la 1 a la 3 y ccdB funciona como factor de contraselección. Una vez hacemos la reacción de intercambio lo ponemos en E. Coli, en la cual es plásmido que porta ccdB no es viable. Generamos dos cajas nuevas: la L y la R, las que quedan en los dos extremos de Lambda.
Esto se hace cuando se ha de pasar una secuencia de DNA a múltiples plásmidos diferentes. Es un sistema caro pero nos ahorramos muchíiiiiiiiiiiiiiisimo tiempo.
9 ...

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