Bloc microbiologia-II (2017)

Apunte Catalán
Universidad Universidad de Barcelona (UB)
Grado Farmacia - 2º curso
Asignatura Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori
Año del apunte 2017
Páginas 12
Fecha de subida 29/09/2017
Descargas 0
Subido por

Vista previa del texto

Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito TEMA 18. DIAGNÒSTIC DE MENINGITIS  Mostra per biòpsia o punció: LCR: Origen de la infecció (meningitis): - Adquirida: d ela pròpia biota normal que travessa la barrera hematoencefàlica produint infecció a les meninges.
Neonatal: adquirida de la microbiota de la vagina materna Immunosuprimits, malalts de SIDA Es poden donar complicacions com encefalitis o abscessos.
Simptomatologia de la meningitis: - Febre Mal de cap Vòmits Fòbia a la llum Signes: - Rigidesa al clatell (signe de Brudzinski) Petèquies (estat molt greu) Afecta a totes les edats, però els infants tenen una major incidència. Les meningitis d’origen bacterià solen ser més greus que les víriques.
Principals MO patògens: - - Meningitis bacterianes: o Nens i adults:  Streptococcus pneumoniae (o pneumococ)  Neisseria meningitidis (o meningococ)  Haemophilus influenzae tipus B o Nounats:  Escherichia coli  Streptococcus agalactiae (grup B de Lancefield)  Listeria monocytogenes Meningitis víriques: o Enterovirus Meningitis fúngiques per fongs: o Cryptococcus neoformans La presa de mostra es fa per punció lumbar i amb especial compte de no contaminar la mostra: - Posició adequada Desinfecció de la pell Infiltració d’un anestèsic local Introduir l’agulla entre les vertebres L3 i L4 de forma perpendicular Retirar l’estilet i deixar sortir el LCR Recollir LCR en 3 tubs estèrils amb tap de rosca Extraure 3-5 mL de mostra Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito El transport ha de ser immediat al laboratori i no es pot refrigerar la mostra. Tenim tres tubs de mostra: - Tub 1: fem el recompte de leucòcits i la formula leucocitària Tub 2: per estudis bioquímics i immunològics Tub 3: anàlisis microbiològic. Cal centrifugar-lo durant 15 min. a 3000g i el sediment és el que s’analitza.
Es fa una observació directa per informar al metge de la presència de MO i leucòcits. El sediment del LCR centrifugat conté: - Bacteris: tinció de Gram, tinció taronja d’acridina Micobacteris: tinció de Ziehl-Neelsen Fongs: tinció de tinta xinesa, tinció de nigrosina L’aïllament és fonamental ja que és un líquid estèril, llavors si es detecta algun patogen hi ha una alta probabilitat de que sigui responsable de la infecció. Sediment del centrifugat: - - Bacteris: els tractem amb agar sang i agar xocolata durant 48-72h, brou tioglicolat, medis selectius, fem deteccions d’Ag i tècniques moleculars (PCR). Si hi ha colònies sospitoses fem proves d’identificació del patogen.
Fongs: es sembren a una cabina de seguretat en agar Sabouraud dextrosa durant 3-7 dies, si hi ha colònies sospitoses fem proves d’identificació del patogen.
Virus: fem cultius cel·lulars per observar l’efecte citopàtic (ECP), tècniques moleculars (PCR) i detecció d’Ag.
En la interpretació dels resultats qualsevol MO aïllat es considera responsable de la infecció, s’ha d’informar al metge.
L’estudi de la sensibilitat als antimicrobians s’ha de realitzar amb qualsevol MO aïllat responsable de la infecció. En fan antibiogrames pel mètode de difusió amb discos d’agar, E-test o el mètode de dilució en brou.
 Cas clínic: Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito TEMA 19. ESTUDI DE LA SENSIBILITAT DELS MICROORGANISMES ENFRONT A ANTIMICROBIANS: Els agents antimicrobians són productes químics que s’utilitzen per combatre infeccions. Segons el tipus d’infecció tenim: - Antibacterians Antivírics Antifúngics Antiparàsits Els antibiòtics són productes metabòlics produïts pels MO, que maten o inhibeixen el creixement d’altres MO. Treballem amb la CMI normalment en µg/mL però també podem fer servir la CMB.
Els bacteris són sensibles a alguns antimicrobians i tenen resistència natural enfront altres. Entre els MO sensibles a un antimicrobià poden aparèixer soques resistents a antibiòtics que abans eren actius, parlem de resistència adquirida. Per poder establir un tractament farmacològic adequat, és necessari estudiar la sensibilitat dels bacteris que produeixin la infecció enfront als antimicrobians disponibles.
Un cop es coneix l’agent causal de la infecció, no sempre, per establir el tractament farmacològic adequat serà necessari estudiar la sensibilitat als antibiòtics.
 Mètodes d’estudi de la sensibilitat als antimicrobians: - Mètodes quantitatius (CMI): o Mètodes per dilució en medi líquid o sòlid o Mètode Epsilon-test (E-TEST) Mètode qualitatiu (S, I, R): o Mètode de difusió en agar: antibiograma - CMI: concentració mínima d’antibiòtic que inhibeix el creixement d’un MO. Un antibiòtic es considera que és actiu enfront a un bacteri quan inhibeix la seva multiplicació dins d’uns marges establerts. L’activitat d’un antibiòtic s’avalua in-vitro determinant la CMI.
 Determinació de la CMI: Mètode de dilució en medi líquid: És un mètode senzill de realitzar i de lectura macroscòpica. Procediment: 1. Inocular amb un bacteri patogen una sèrie de tubs amb medi de cultiu i concentració creixent de l’antibiòtic a estudiar 2. Incubem els tubs 3. Lectura dels tubs 4. CMI = concentració mínima d’antibiòtic que inhibeix el creixement bacterià Mètode de microdilució en líquid: És una tècnica útil i pràctica per calcular la CMI. Es realitza en plaques de poliestirè amb pouets en lloc de tubs, hi ha plaques que ja porten incorporats els antimicrobians.
Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito Funcionament: - - Els pouets de cada columna contenen concentracions creixents d’un antibiòtic liofilitzats Només és necessari incorporar el medi de cultiu líquid (200 µL) que conté també el bacteri a estudiar. La suspensió bacteriana problema es prepara en el volum de cultiu a afegir a cada pouet.
Incubem i determinem la CMI Mètode de dilució en medi sòlid: Procediment: 1. Inocular amb el bacteri patogen una sèrie de plaques amb medi de cultiu i concentració creixent de l’antibiòtic a estudiar 2. Incubem les plaques 3. Lectura de plaques 4. CMI Epsilon-test (ETEST): És una prova de difusió en gradient que combina la simplicitat i flexibilitat de les proves de difusió en disc (antibiograma) amb la capacitat per quantificar la CMI de les tècniques de dilució.
Consisteix en una tira que està recoberta d’un gradient predefinit i creixent d’antibiòtic: - Sobre la superfície de la placa sembrada amb el MO problema, es col·loca la tira. Per difusió de l’antibiòtic es forma un gradient exponencial al llarg i al voltant de la tira.
Incubem la placa a la temperatura òptima Observem la zona d’inhibició el·lipsoïdal i simètrica als dos costats de la tira.
Lectura de la placa: la intersecció de la tira amb la zona d’inhibició permet la lectura directa de la CMI.
Mètode de difusió en agar: antibiograma: Aquestes proves són fàcils de realitzar i d’un cost relativament baix, el que permet que siguin molt utilitzades en medicina clínica per determinar l’antibiòtic d’elecció pel tractament. És un mètode senzill que es basa en la inhibició del creixement bacterià al voltant d’un disc carregat amb un antimicrobià que difon en el medi de cultiu sòlid. Només és útil per bacteris de creixement ràpid.
És un mètode totalment estandarditzat: medi de cultiu, discs d’antibiòtics i inòcul bacterià. Procediment: - - Sembrar a la superfície d’un medi sòlid el bacteri problema Col·locar a la superfície una sèrie de discs de paper de filtre impregnats amb una concentració coneguda d’antibiòtic que difondrà a través de l’agar establint un gradient de concentracions al voltant del disc de major a menor concentració.
Incubem les plaques Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito Per fer la lectura de l’antibiograma: s’observa el creixement del bacteri en la superfície de l’agar.
Es mesuren els diàmetres dels halus d’inhibició en mm amb una regla, compàs... També hi ha instruments que permeten realitzar la lectura de forma automàtica. Per la interpretació dels resultats s’utilitzen taules estandarditzades, es compara el valor de l’halus d’inhibició obtingut per a cada antibiòtic amb els rangs establerts a la taula. El resultat per a cada antibiòtic assajat podrà ser: sensible, intermedi o resistent.
Els resultats obtinguts amb l’antibiograma tenen una bona correlació amb els valors quantitatius de CMI. Interpretació de l’antibiograma: - MO resistent: indica que l’antibiòtic a les dosis terapèutiques no inhibeix el creixement bacterià. No és adequat pel tractament.
MO sensible: indica que l’antibiòtic a les dosis terapèutiques inhibeix el creixement bacterià. És adequat pel tractament.
MO intermedi: indica que l’antibiòtic a les dosis terapèutiques habituals no inhibeix el creixement bacterià. Si la dosis d’antibiòtic es pot incrementar, es produeix una acumulació de l’antibiòtic a alguna zona del cos (orina) i serà adequat pel tractament.
El metge és la persona que escull l’antibiòtic més adequat pel tractament del malalt tenint en compte: - Els resultats obtinguts en l’estudi de sensibilitat a antimicrobians L’òrgan o teixit diana on es localitza la infecció Les al·lèrgies a fàrmacs del malalt El metabolisme de l’antibiòtic i la via d’eliminació  Control de qualitat del mètode: S’han d’incorporar soques de sensibilitat o resistència conegudes per mesurar els halus d’inhibició i controlar si els valors obtinguts estan dins dels marges establerts. S’utilitzen soques de col·lecció (ATCC = American Type Culture Collection): - Staphylococcus aureus ATCC 29213, 25923 Escherichia coli ATCC 35218 25922 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Haemophylus influenzae ATCC 49766, 49247 Campylobacter jejuni ATCC 33560 L’ús de patrons és indispensable en totes les tècniques que es descriuen, així com el control de la puresa dels cultius microbiològics utilitzats.
Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito TEMA 20. DIAGNÒSTIC DE CISTITIS  Exsudats inflamatoris: orina i esput La problemàtica són les mostres que es recullen després de passar per una zona del cos amb una biota normal perquè contaminen la mostra. Com a conseqüència el simple aïllament i identificació d’un MO no ens indica quin és el responsable de la infecció. Per que el MO aïllat sigui el responsable de la infecció: - S’ha d’aïllar de la mostra en concentració elevada Amb presència o absència de leucòcits Pacient amb simptomatologia  Exsudats inflamatoris: orina Freqüència i origen de la infecció: Al tracte urinari l’origen pot ser: - Ascendent: pròpia biota normal de l’intestí gros que ascendeix per l’uretra per arribar a la bufeta urinària. Més freqüent en dones.
Hematògena: a partir d’un focus infecciós arriba per la sang al sistema excretor.
Poden produir cistitis (infecció d’orina) o pielonefritis (quan afecta a més estructures del tracte urinari inclosos els ronyons).
Simptomatologia: - Cistitis: urgència per orinar, freqüència elevada (pol·laciúria), molèsties a l’orinar (disúria), pesadesa a la part baixa de l’abdomen, febre, hematúria.
Principals MO patògens: Al tracte urinari només tenim biota normal a la uretra; la bufeta, urèters i ronyons són zones estèrils. Diferenciem dos tipus d’infecció: La presa de mostres d’orina requereix reduir al màxim la contaminació i s’han de donar instruccions al pacient per la recollida correcta de la mostra. La micció espontània o sondatge uretral poden ser mostres contaminades, en canvi, la punció suprapúbica és una mostra no contaminada.
Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito Durant el transport no s’ha de modificar la biota de la mostra des de la seva recollida fins a l’anàlisi. La orina és un bon medi de cultiu i s’ha de transportar el més ràpid possible (cal processar-la en menys de 2h). Si no és possible es pot conservar en nevera un màxim de 24h o s’afegeix un conservant.
Amb la observació directa es pot informar de si la mostra està ben recollida i es pot continuar l’anàlisi i també dels medis de cultiu que es poden utilitzar. Tenim mètodes de Screening opcionals, les tècniques que s’utilitzen són Gram directe d’orina o Gram de sediment que aporta informació del número i tipus de bacteris i del número de leucòcits. Això també permet descartar mostres mal recollides o negatives.
L’aïllament té 2 finalitats principals: aïllar el possible patogen amb un medi selectiu i quantificarlo amb un medi ric. El simple aïllament d’un MO patogen potencial no indica que sigui responsable de la infecció.
Si arriba un pacient ambulatori amb cistitis, es fa un recompte sembrant 0,001mL d’orina en un medi ric i després es fa l’aïllament sembrant per estria en un medi selectiu per E.coli (MacConkey).
Només s’han d’identificar els MO responsables de la infecció, s’estudia el creixement dominant.
Perquè sigui un MO amb creixement dominant cal que hi hagi >100 colònies en recompte o que hi hagi entre 10-100 colònies i presència de leucòcits, simptomatologia, tipus de mostra i sexe.
Per la identificació de la cistitis, el patogen habitual és E.coli. Es fan: - Proves bàsiques: és un bacil petit gramnegatiu, oxidasa -, catalasa +, amb mobilitat i lactosa +.
Proves específiques Sistemes comercialitzats L’estudi de la sensibilitat als antimicrobians només es realitza amb els MO considerats responsables de la infecció.
Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito TEMA 21. DIAGNÒSTIC D’ENTERITIS  Mostres procedents de zones amb biota normal: Femtes, tracte respiratori superior, pell, ulls, tracte genital, etc. La problemàtica és que és difícil observar i aïllar els MO patògens en mostres que de forma normal ja contenen molts bacteris de la pròpia biota normal, l’observació directa no sempre és útil i en l’aïllament s’han d’utilitzar medis selectius i/o diferencials Microbiota normal: -  Femtes: bacteris anaerobis Tracte respiratori superior: Streptococcusgrupo viridans, Neiserias comensales, Fusobacteris (anaerobis).
Pell: Staphylococcus epidermidis, Corinebacteris sapròfites, Propionibacterium sp., Micrococcus sp.
Tracte genital: o Uretra: conté biota similar a la pell i enterobacteris o Vagina: gran abundància de lactobacils Mostres amb biota normal: femtes: La enteritis és important perquè és molt freqüent en països subdesenvolupats ja que afenta sobretot a nens, es més greu per desnutrició, falta d’higiene i hi ha risc de mort; també en països desenvolupats on afecta a nens i adults i és més greu en lactants i a la tercera edat.
Els principals MO patògens d’enteritis en la població general s’adquireixen per via feco-oral i pel consum d’aliments i aigua contaminats, són: Mecanismes de patogenicitat: - Invasió: Salmonella, Campylobacer, Shigella Enterotoxines: Vibrio cholerae, Clostridrium difficile Toxines preformades: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus Destrucció de cèl·lules: virus Simptomatologia: pot orientar però no permet fer un diagnòstic clínic - Diarrees sempre, ocasionalment febre, dolor abdominal, sang, pus Diarrea molt liquida en aigua d’arròs (Vibrio cholerae) Incubació molt curta, diarrea i vòmits, principalment toxo-infecció Vòmits abundants i diarrea en nens (rotavirus) Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito La presa de mostres de femtes diarreiques (sang i mucus) s’ha de fer en un recipient estèril de boca ampla i en quantitat suficient (5-10mL). La mostra ha d’estar identificada correctament i amb informació completa del pacient i quadre clínic, també cal apuntar les circumstancies especials: viatges, si pren antibiòtics...
El transport i processament de la mostra ha de ser inferior a 2h. Si no és possible es pot utilitzar un mitjà de transport per bacteris o refrigerar la mostra a 4ºC, en aquests dos casos cal processar la mostra com a màxim 24h després.
L’observació directa és poc útil en mostres de femtes. L’examen macroscòpic pot orientar segons si hi ha sang, pus, aigua d’arròs, ...; l’examen microscòpic també és poc útil i no sempre es realitza. Tinció de Gram: és poc útil observar el MO patogen entre milions de bacteris de la biota normal del tub digestiu, pot ser útil en diarrees produïdes per Campulobacter i Vibrio, perquè presenten una morfologia característica.
És difícil d’aïllar el MO patogen entre la microbiota normal, és molt important fer servir medis selectius i diferencials que permetin el creixement dels bacteris patògens i inhibeixin la resta de microbiota, es poden fer enriquiments en medis líquids previs a l’aïllament en medis sòlids selectius.
Protocol per aïllar Salmonella: 1. Realitzar simultàniament un enriquiment i l’aïllament: a. Enriquiment selectiu per Salmonella en brou de selenito-cisteina a temperatura ambient, després aïllar en medis sòlids selectius.
b. Aïllament directe en medis sòlids selectius i diferencials a temperatura ambient.
2. Buscar colònies sospitoses: colònies que no fermentin la lactosa En la interpretació, la presència de Salmonella en femtes de malalts i en aliments implicats en un brot de gastroenteritis s’interpreta com l’agent patogen responsable. L’estudi de la sensibilitats als antimicrobians no sempre es realitza i normalment no s’administren antibiòtics.
Estudi de virus: rotavirus La presa de mostres i el transport es realitza igual que en bacteris, no es realitza una observació directa perquè els virus no s’observen al microscopi òptic i l’electrònic no s’utilitza en la rutina dels laboratoris. En quant a l’aïllament, no creix en cultiu convencionals.
Pel diagnòstic de laboratori cal una detecció directa d’Ag vírics en femtes mitjançant una aglutinació amb làtex o EIA, també es pot fer la detecció d’un fragment de RNA amb la RT-PCR.
Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito TEMA 22. DIAGNÒSTIC IMMUNOLÒGIC: SÍFILIS  Diagnòstic immunològic: Moltes malalties infeccioses es diagnostiquen directament o es confirma el seu diagnòstic presumptiu per la detecció d’Ag i/o Ab. Com per exemple en la pneumònia clàssica, les pneumònies atípiques, la sífilis, l’hepatitis B i C i el VIH.
 Resposta immunitària: És un mecanisme de defensa anti-infecciosa, reconeix molècules estranyes anomenades antígens que corresponen a proteïnes i polisacàrids de l’agent estrany i produeix: - Resposta humoral: producció d’Ab Resposta cel·lular: activació d’altres cèl·lules del sistema immunitari Quan un individu reconeix l’Ag mitjançant els limfòcits B, es dóna la maduració dels Ab que s’uniran específicament formant un complex Ag-Ab. La base de les proves immunològiques és que si tenim una mostra amb Ag es detecta un Ab conegut; si tenim Ab en sèrum es fa la detecció d’un Ag conegut.
 Diagnòstic immunològic: Antígens: Es fa un diagnòstic microbiològic per detectar l’Ag responsable d’una infecció, es pot dur a terme un examen microscòpic, un cultiu o una detecció d’Ag específics en una mostra clínica mitjançant proves immunològiques.
Els avantatges són que és ràpid i té bona sensibilitat per detectar clamídies i virus. Els inconvenients són que és car, poden ser complexes, s’investiga un únic MO i requereixen anti-sèrum. Hi ha molts tipus de procediments diferents.
Tenim una mostra clínica (LCR o orina) i li afegim un Ab* conegut, es donarà la reacció per formar el complex Ag-Ab* que aglutinarà al portaobjectes, apliquem una tècnica d’immunofluorescència i un enzim-immunoanàlisi (EIA) per tal de detectar l’Ab* i, per tant, l’Ag de la mostra que ens interessa.
Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori Silvia Expósito Anticossos: diagnòstic serològic: En aquest cas tenim sèrum (LCR) i li afegim un Ag sospitós, es donarà la reacció Ag-Ab. Aquestes tècniques permeten quantificar els Ab presents al sèrum, la majoria són automatitzades i necessiten un diagnòstic presumptiu per buscar un MO concret.
La presència d’Ab no indica que l’individu estigui paint la malaltia, poden ser Ab de memòria. El que indica que hi ha una infecció present són els nivells d’IgM elevats. Aquestes proves es realitzen amb dues mostres, una presa a l’inici i una altra presa al cap de 3-5 setmanes perquè doni temps a que es formin els Ab. Si hi ha hagut un increment molt gran del nivell d’Ab el resultat és positiu; és un resultat a posteriori que confirma el diagnòstic.
 VIH i SIDA: La síndrome de la immunodeficiència adquirida (SIDA) és la fase final de la infecció pel virus de la immunodeficiència humana adquirida (VIH). Es caracteritza per la presència d’infeccions oportunistes greus i processos tumorals, el virus indueix la destrucció dels limfòcits T CD4 involucrats en la coordinació de la resposta immune. Hi ha dos virus que es denominen VIH-1 i VIH-2.
Estadis clínics de la infecció: - Període d’incubació de 2-6 setmanes 1ª fase: síndrome retroviral agut (2-3 setmanes) 2ª fase: període asimptomàtic (molts anys) 3ª fase: inici dels símptomes 4ª fase: SIDA (malalties oportunistes, SNC) Anàlisis clíniques i diagnòstic de laboratori  Silvia Expósito Diagnòstic per infecció de VIH: Mètodes que s’utilitzen pel diagnòstic: - Detecció d’Ab per proves serològiques (EIA) Detecció d’Ag del virus (Western blot) Detecció del DNA proviral integrat a les cèl·lules infectades per tècniques moleculars Seguiment de la malaltia: - Determinació quantitativa del RNA dels virus circulants en sang Determinació del número total de limfòcits T CD4 La quantificació del virus en sang és detectar la càrrega vírica, això és un indicador de l’activitat replicativa del virus, per tant, ens permet fer un pronòstic de la malaltia.
 Detecció d’Ab anti-VIH: Es fa mitjançant una tècnica d’enzim-immunoassaig (EIA): la mostra que s’utilitza és el sèrum del pacient i requereix una placa de microtitter. Procediment: - Els Ag virals es fixen als pouets d’una placa de microtitter S’afegeix a la placa la mostra de sèrum amb possibles Ab Si s’ha produït la reacció Ag-Ab es revela positivament perquè s’uneix amb una anti-Ig humana marcada prèviament Interpretació dels resultats: - Negatiu: no hi ha infecció, excepte si és durant el període inicial Positiu: s’ha de repetir la prova d’EIA Resultat repetit positiu: s’ha de confirmar mitjançant la detecció d’Ag específics per una Western blot.
Com hem dit, si el resultat a la prova serològica és positiu per primer cop cal confirmar el diagnòstic amb la prova Western blot detectant Ag virals específics. Procediment: - Es posa en contacte el sèrum del malalt amb Ag virals específics purificats i es separen en una tira de nitrocel·lulosa.
Interpretació de resultats: - Positiu: si es detecten Ab enfront al menys dues de les tres proteïnes de l’embolcall i de la nucleocàpsida del virus (GP 160/120, GP41, P24).
 Període inicial seronegatiu: El període inicial de la infecció dura entre 3 setmanes i 3 mesos. En aquesta fase l’individu afectat és seronegatiu, el diagnòstic s’ha de realitzar mitjançant la detecció de l’Ag P24 per tècniques d’EIA. Excepte en aquest període inicial, les persones infectades presenten Ab anti-VIH durant tota la vida (seropositius) permeten realitzar així el diagnòstic per serologia.
...

Comprar Previsualizar